Name: Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer geheel-mount clearing en kleuring van Arabidopsis bloemorganen en siliques voor plantenreproductieonderzoek. Deze methode maakt snelle screening van ontwikkelingsstadia mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Zürich, een IEF Marie Curie Grant (toekennen neen. TransEpigen-254797 naar A.H.), een Advanced Grant van de European Research Council (verlenen neen. Medea-250358 naar U.G.), en een onderzoek en technologische ontwikkeling project (grant MecanX aan U.G.) van SystemsX.ch, het Zwitserse initiatief in de systeembiologie.

1. bloem en Hauw fixatie
<ol><li>Oogst bloemen en siliques uit planten gesynchroniseerd bij de opening van de eerste bloem. Opmerking: Onder de experimentele omstandigheden hier gebruikt, starten planten bloeien ongeveer 21 dagen na de transplantatie van Murashige en Skoog (MS) platen voor de bodem. Zaden zijn gelaagde voor 3-4 dagen bij 4 ° C en ontkiemd/geteeld op MS platen bij 22 ° C/16 h licht en 18 ° C/8 uur donker voor 8 tot 10 dagen, vóór het transplanteren van de zaailingen op voedselrijke bodem in potten bewaard onder dezelfde voorwaarden (Figuur 1). Het aantal replicatieonderzoeken hangt af van het specifieke onderzoek doel, maar een minimum van 5 bloeiwijzen (uit 5 afzonderlijke fabrieken) voor elke behandeling wordt aanbevolen. Als de bloemen zijn de experimentele eenheid, wordt een minimum van 10 bloemen per repliceren aanbevolen.</li>
	<li>Knip bloeiwijzen of bloemen (figuur 1E-H) met behulp van kleine schaar (b.v., nagelschaartje) en plaats ze onmiddellijk in een microcentrifuge buis (voor de enkelvoudige bloeiwijze/bloem fixatie) of een conische buis (voor de collectieve vastleggingen) bevattende vers gemaakt van Carnoy, methanol/azijnzuur of FPA50 fixatives (afhankelijk van de toepassing, zie hieronder) op het ijs. Opmerking: Monsters moeten volledig worden ondergedompeld in het fixeer.</li>
	<li>Laat het weefsel binnen de fixeerspray voor 4 uur naar girale bij 4 ° C. Opmerking: Vacuüm infiltratie kan worden gebruikt voor het versnellen van de penetratie van de fixeerspray in het weefsel, maar dit schadelijk kan zijn voor het behoud van de structuur van het weefsel. De auteurs voeren niet vacuüm infiltratie.</li>
	<li>Het fixeer verwijderen, toevoegen van genoeg 70% ethanol ter dekking van de monsters en terugsturen tot 4 ° C gedurende ten minste 24 uur; monsters kunnen blijven voor onbepaalde tijd in deze oplossing. Na het verwijderen van ethanol, ga onmiddellijk naar de volgende stap; dissectie of SDS clearing.</li>
</ol>2. dissectie onder de stereomicroscoop
<ol><li>Zet vers gemaakte 70% ethanol in van de maker van een horloge glas geplaatst op een kleine petrischaal voor steun.</li>
	<li>
Plaats de bloeiwijze/bloem/Hauw op dit vers gemaakt fixeer en ontleden onder de stereomicroscoop met pincet en een injectiespuit met een naald.
	<ol>
<li>Gebruik van de maker van een horloge glas of soortgelijk apparaat waarmee de monsters te worden volledig bedekt met ethanol (aanbevolen) voor de dissectie van bloeiwijzen en verscheurt floral organen van volwassen bloemen (kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraad kan worden ontleed in dit stadium ) om te voorkomen dat het risico van monsters uitdrogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ontleden siliques en kleine bloemknoppen op een dia, zoals hieronder beschreven.
	<ol>
<li>Van de maker van het horloge glas met voorbewerkte monsters opzij zetten, en gebruik van een normale dia voor de definitieve dissectie.</li>
		<li>Het monster van belang naar de dia en voeg 10 µL van verse 70% ethanol. Werk snel op de laatste dissectie en voeg 10 µL van ethanol, indien nodig, het monster om vochtig te houden zonder buitensporige vloeistof.</li>
		<li>Voor het vrijgeven van stuifmeel korrels van meeldraden, zie stap 5.1. Voor ontrafeling van de carpellen en de zaadknoppen, volgt u de procedure die is beschreven in Figuur 2. Deze procedure is van toepassing op alle stadia van de ontwikkeling van de carpel, met inbegrip van de fase van de ontwikkeling van groene siliques. Opmerking: Voeg geen ethanol, als er voldoende ethanol "Carry-over" van de verhuizing van de monsters; Ontrafeling van zeer kleine steekproeven is veel gemakkelijker in een minimale hoeveelheid vloeistof. Houd altijd alleen de organen van belang (kelkbladen, bloemblaadjes, meeldraden, carpellen, zaadknoppen, zaden of stuifmeel korrels) op de dia. Deze procedure zorgt voor een uniforme dikte tussen de dia en dekglaasje aan, overeenkomt met de dikte van het orgaan onderzochte, wat resulteert in een hogere homogeniteit, en dus efficiëntie voor microscopisch onderzoek (hoger aantal exemplaren van het doel in het zelfde brandvlak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een klein stuk Vloeipapier te absorberen en verwijder zoveel ethanol mogelijk. Snel overgaan naar de volgende stap (sectie 3, 4 of 6) voordat de monster droogt uit.</li>
</ol>3. Chloraalhydraat gebaseerde Clearing en gecombineerde Clearing-kleuring
Opmerking: Beste resultaten voor de clearing Chloraalhydraat gebaseerde worden verkregen met FPA50 vast materiaal.
<ol><li>Plaats 20 µL van clearing oplossing (Chloraalhydraat/glycerol, gewijzigd Hoyer van medium, Herr's 4½ of Herr's IKI-4½ oplossingen) op de dia specimen dragende. Met behulp van een paar spuiten met hypoderme naalden, positie van de specimens desgewenst door het verminderen van de ruimte tussen hen, en flipping degenen waar het orgel van belang gezichten naar beneden. Verwijder eventuele resterende luchtbel met behulp van de naald.</li>
	<li>Verlagen van een dekglaasje aan zijwaarts voorzichtig plaats, heel voorzichtig op te drukken en wachten tot de oplossing van de clearing de ruimte tussen vult. Voeg minimaal clearing oplossing, indien nodig, de hele ruimte onder het dekglaasje aan te vullen.</li>
	<li>Plaats van de dia op een dia houder en laat deze onder de zuurkast. Ga naar microscopische opmerkingen na ten minste 4 uur en gedurende de volgende 4 – 5 dagen.</li>
</ol>4. gecombineerd Alexander kleuring en Herr's 4½ Clearing van helmknoppen
Opmerking: De originele Alexander-protocol is gebaseerd op het vrijgeven van stuifmeel korrels op de dia vóór kleuring. Een efficiënte en informatiever, gemodificeerde Alexander kleuring en het opschonen van de procedure is de kleuring van volwassen stuifmeel korrels binnen de helmknoppen van volwassen maar niet-dehiscent.
<ol><li>Kies vers geoogste bloemknoppen die zijn bezig met openen met niet-dehiscent helmknoppen. Opmerking: Neem geen jongere bloemknoppen omdat Alexander kleuring is bedoeld voor volwassen stuifmeel korrels en doet geen efficiënt onvolwassen stuifmeel korrels vlekken. Een minimum van 5 bloemen per behandeling van verschillende planten en bloeiwijzen geoogst wordt aanbevolen.</li>
	<li>Een 96-wells-plaat met genoeg Alexanders oplossing te dompelen een bloem bud voor te bereiden. De helmknoppen bloot doordat de kelkbladen en bloemblaadjes en hen onder te dompelen in Alexanders oplossing. Houd de monsters onder de zuurkast voor 1 – 3 h.</li>
	<li>Alexanders oplossing vervangen door Herr's 4½ oplossing en plaats de multi goed plaat terug onder de zuurkast voor een overnachting incubatie.</li>
	<li>Met behulp van Tang, zachtjes gaan de gewiste bloemknoppen op een nieuwe dia Aangezien sommige "Carry-over" van Alexanders oplossing optreden kan, kunt een vloeipapier verwijderen zoveel clearing-oplossing mogelijk.</li>
	<li>Ontleden van de meeldraden en verwijder alle andere weefsels. Volg de stappen in sectie 3 met behulp van Herr's 4½ oplossing.</li>
</ol>5. het verwijderen van de Exine van stuifmeel korrels
Opmerking: Raden We de Carnoy fixatief voor de DAPI kleuring.
<ol><li>Volg de fixatie en dissectie procedures beschreven in de punten 1 en 2. Onderhand, moet men een te veel meeldraden op de dia binnen een minimumbedrag van 70% ethanol.</li>
	<li>Gebruik een vloeipapier verwijderen overtollige ethanol en voeg 5-10 µL van DAPI oplossing. Met een paar spuiten met naalden, laat de stuifmeel korrels binnen die kleine hoeveelheid oplossing (bijvoorbeeldgebruik van een spuit te immobiliseren van de meeldraad en anderzijds om de stuifmeel korrels). Voeg een andere 5 µL van DAPI als de oplossing droogt uit.</li>
	<li>Het verwijderen van alle vuil van de meeldraad is een cruciale stap, zodat alleen stuifmeel korrels zitten tussen de dia en het dekglaasje aan.</li>
	<li>Plaats van een dekglaasje aan op de specimen dragende dia door het verlagen van het zijwaarts en voeg de minimale hoeveelheid DAPI oplossing nodig om de ruimte te vullen. Plaats een wijsvinger op het dekglaasje aan, en zonder het te pletten veel maken een snelle, stevige en korte glijdende beweging. Opmerking: Om te peilen de nodige kracht en de amplitude van de glijdende beweging, deze stap moet beoefend worden meerdere malen, controleren de resultaten telkens onder de Microscoop.</li>
	<li>DAPI oplossing Voeg indien nodig en plaats de dia in een vochtige vak in het donker bij 4 ° C gedurende 15 min. tot 1 h. treed toe tot het nemen van monsters onder breed-gebied fluorescentie- of confocale microscopie binnen 24 h. probeert te combineren deze procedure met SDS wissen om te controleren of verder verbeteren menten kan worden verkregen.</li>
</ol>6. natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) wissen
Opmerking: Afhankelijk van de bloemen orgel te analyseren, en van de onderzoeker vaardigheden te ontleden zeer zacht en kleine exemplaren, de SDS behandeling kan worden uitgevoerd voordat (voor ervaren onderzoekers) of nadat de dissectie stap (voor minder ervaren onderzoekers) op methanol-azijnzuur vaste materiaal.
<ol><li>Gebruik van de maker van een horloge glas, een holle dia of een microcentrifuge buis aan ontleed of niet-ontleed monsters in 1% SDS en 0,2 N NaOH oplossing 's nachts bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Voorzichtig behandelen omdat het monster zeer zacht is en een transparante uitstraling heeft. Spoel verschillende malen met water. Opmerking: Restanten van de SDS-oplossing kunnen leiden tot neerslag bij het toevoegen van de kleurstofoplossing bv, aniline blauw.</li>
	<li>Voor niet-ontleed monsters, volg de dissectie-procedure die wordt beschreven in sectie 2, met behulp van water in plaats van 70% ethanol. Na de ontrafeling van het gewenste weefsel, Verwijder eventuele resten en puin, en overtollig water met een vloeipapier, dan toevoegen van 20 – 40 µL van kleurstofoplossing en ga verder met stap 6.5.</li>
	<li>Voor ontleed monsters, zorgvuldig Verplaats het monster uit de oplossing wassen en plaatst u deze op een schone dia en toevoegen van 20 – 40 µL van kleurstofoplossing.</li>
	<li>Zachtjes Breng een dekglaasje aan op de dia door zijwaarts verlagen. Wees voorzichtig niet te pletten van de voorbereiding. Als het weefsel te zacht is, verlaten plaats om het even welk scheidingsteken in tussen de dia en het dekglaasje aan op de hoeken (b.v., tape of een gebroken dekglaasje aan), dunne een kamer-achtige ruimte tussen dia en dekglaasje aan, zodanig dat het dekglaasje aan het model niet verpletteren.</li>
	<li>Plaats alle dia's in een vochtige doos, bedekken met aluminiumfolie en plaats deze bij 4 ° C gedurende ten minste 1 h. treed toe tot het observeren van het model met behulp van widefield fluorescentie- of confocale microscopie binnen de 24u.</li>
</ol>

<ol><li>Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/374027a0">The origin and early diversification of angiosperms.</a> Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).</li>
<li>Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+Darwin%27s+%27abominable+mystery%27%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The meaning of Darwin's 'abominable mystery'.</a> Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).</li>
<li>Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+first+flower%3A+A+Jurassic+angiosperm%2C+Archaefructus%2C+from+Northeast+China%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China.</a> Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).</li>
<li>Mulcahy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+the+angiosperms%3A+a+genecological+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The rise of the angiosperms: a genecological factor.</a> Science. 206 (4414), 20-23 (1979).</li>
<li>Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The evolution of plant development.</a> Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).</li>
<li>Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065229606440015">Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower</a>. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).</li>
<li>Alvarez-Buylla, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Flower development.</a> Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).</li>
<li>Beddington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+contributions+from+science+to+a+new+and+greener+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Food security: contributions from science to a new and greener revolution.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).</li>
<li>Godfray, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+The+challenge+of+feeding+9+billion+people%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Food security: The challenge of feeding 9 billion people.</a> Science. 327 (5967), 812-818 (2010).</li>
<li>Burkle, L. A., Alarcón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+plant-pollinator+diversity%3A+understanding+interaction+networks+across+time%2C+space%2C+and+global+change%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change.</a> Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).</li>
<li>Meyerowitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+and+molecular+model+for+flower+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana.</a> Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).</li>
<li>Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+gametophyte+development+and+function+in+angiosperms%3A+a+general+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept.</a> Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+common+concepts+and+developmental+flexibility+in+sexual+and+asexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction.</a> Development. 142 (2), 229-241 (2015).</li>
<li>Sprunck, S., Dresselhaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+cell+fusions+during+double+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three cell fusions during double fertilization.</a> Cell. 161 (4), 708-709 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Fruit development in Arabidopsis.</a> Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%2C+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB.+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.2481">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Endress, P. K. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2995533">Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum.</a> Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).</li>
<li>Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+gynoecium%3A+at+the+carpel+margin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Inside the gynoecium: at the carpel margin.</a> Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).</li>
<li>Hill, J. P., Lord, E. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b89-375#.WhXEGbQ-dZ0">Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant.</a> Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).</li>
<li>Sessions, R. A., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7789281">Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants.</a> Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).</li>
<li>Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1995.07050731.x/abstract">Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue.</a> Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).</li>
<li>Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=pzu4SVKg1PcC&oi=fnd&pg=PA35&dq=Sundberg,+E+%22Annual+Plant+Reviews%22&ots=G8KcTeYQ7v&sig=KxClSALK76vqi5_xDvnDOlhXfg4#v=onepage&q=Sundberg%2C%20E%20%22Annual%20Plant%20Reviews%22&f=false">Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal</a>. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).</li>
<li>Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://cshmonographs.org/index.php/monographs/article/view/3103">10 seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).</li>
<li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2441475">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).</li>
<li>Alexander, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+stain+for+pollen+fungi%2C+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria.</a> Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).</li>
<li>Herr, J. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.jstor.org/stable/24334877">Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology.</a> J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).</li>
<li>Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. <a target="_blank" href="http://www.ableweb.org/volumes/vol-5/5-herr.pdf">Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE)</a>. Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).</li>
<li>Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+somatic+embryogenesis+receptor+kinases1+and+2+are+essential+for+tapetum+development+and+microspore+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation.</a> Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).</li>
<li>Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+pollen+quality+and+a+further+appraisal+of+the+fluorochromatic+%28FCR%29+test+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure.</a> Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).</li>
<li>Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2446073">Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review.</a> Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).</li>
<li>Dafni, A., Firmage, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984098">Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications.</a> Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).</li>
<li>Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+development+in+Annona+cherimola+Mill.+%28Annonaceae%29.+Implications+for+the+evolution+of+aggregated+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen.</a> BMC Plant Biol. 9, 129(2009).</li>
<li>Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light+microscopic+atlas+of+meiosis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).</li>
<li>Park, S. K., Howden, R., Twell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+gametophytic+mutation+gemini+pollen1+disrupts+microspore+polarity%2C+division+asymmetry+and+pollen+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate.</a> Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).</li>
<li>Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+botanical+techniques+for+new+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Old botanical techniques for new microscopes.</a> BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).</li>
<li>Crane, C. F., Carman, J. G. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2443827?seq=1#page_scan_tab_contents">Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand.</a> Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).</li>
<li>Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b79-204">Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses.</a> Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142, 4168-4179 (2015).</li>
<li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy.</a> Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).</li>
<li>Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).</li>
<li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Optical+Clearing+Protocol+for+Deep+Tissue+Imaging+of+Fluorescent+Proteins+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het bestaan van vele bloemknoppen binnen een enkele bloeiwijze van Arabidopsis, verspreid over alle ontwikkelingsstadia van de bloem, biedt een unieke gelegenheid voor studies gericht op de karakterisering van een effect van een behandeling of een ontwikkelingstoxiciteit functie gelijktijdig in de verschillende stadia van Bloemontwikkeling. Een goede referentiepunt tussen verschillende individuele planten is de opening van de eerste bloem van de belangrijkste bloeiwijze. Planten worden behandeld op een zodanige ...

Bloemen zijn een van de belangrijkste organen van bedektzadigen definiëren. Bloeiende planten ongeveer 90-130 miljoen jaar geleden verscheen1, en gediversifieerde zo snel dat hun snelle verschijning werd beschreven als een "verschrikkelijke verborgenheid" door Charles Darwin2. De belangen van plant onderzoekers in Bloemontwikkeling zijn divers. Wat onderzoek heeft zich gericht op het begrijpen van de evolutionaire oorsprong van de bloem als geheel, of de ontwikkeling van specifieke anatomische, structurele en functionele eigenschappen van bloemen3,4,5,6 . De hoge variatie in floral vorm en structuur, evenals de vervoermiddelen seksuele en ongeslachtelijke voortplanting beroep op hen, maken de bloem een zeer complexe structuur. Dit heeft geleid tot diverse inspanningen te karakteriseren van de anatomie en de structurele kenmerken van floral organen, met behulp van licht en elektron microscopische technieken die kunnen worden gecombineerd met genetische en moleculaire onderzoeken7. Bovendien, als de bron van vruchten en zaden, zijn bloemen van het allergrootste belang voor de voeding van mens en dier. Dus, de karakterisatie van bloem en fruit ontwikkeling heeft veel gevolgen voor toegepast onderzoek, met inbegrip van de veiligstelling van de voedselvoorziening voor een toenemende menselijke bevolking en de strategieën van de ecologische behoud onder een veranderende omgeving8 , 9 , 10.
Bloemontwikkeling Arabidopsis begint met bloem inductie en de transformatie van de vegetatieve meristeem aan een meristeem bloeiwijze (groep van bloemen). Bloem primordia zijn lateraal gestart op de flank van de bloeiwijze meristeem11. De bloemen orgel primordia vormen geleidelijk in concentrische slierten van buiten naar het midden van de bloem, en zich uiteindelijk ontwikkelen tot kelkbladen, bloemblaadjes, meeldraden en carpellen7. Deze bloemen organen vervullen verschillende voedend, beschermende en functionele (bijvoorbeeldpollinator attractie) rollen in verschillende plantensoorten, met het ondersteunen van de ontwikkeling van mannelijke en vrouwelijke gametofyten, respectievelijk12 geslachtsorganen , 13. de gametofyten, op zijn beurt, elk onderscheiden een paar van mannelijke (sperma) en vrouwelijke gameten (ei en centrale cel), die verenigen op dubbele bevruchting tot het vormen van de volgende generatie, de zygote en de primaire endosperm, een terminal weefsel, ter ondersteuning van de ontwikkeling van het embryo14,15. Vruchten en zaden ontwikkeling steunen de groei, rijping en bewaring van het embryo en, uiteindelijk, de versnippering. Uitgebreid onderzoek heeft verricht om het karakteriseren van bloem en embryo-ontwikkeling in diverse plantensoorten, vooral in de model soorten Arabidopsis7,16,17.
Vroege microscopische analyses van de bloemontwikkeling waren gebaseerd op tijdrovende monster verwerking en observatie technieken, zoals paraffine of hars inbedding en segmenteren, in combinatie met licht of elektronenmicroscopie. Deze traditionele microscopische technieken werden vaak gebruikt in combinatie met moleculaire genetische onderzoeken, zoals microscopische analyses van mutanten, de lokalisatie van RNA door in situ hybridisatie, of de immuno-detectie van eiwitten. Recente vooruitgang in breed-gebied en confocal fluorescentie microscopie, in de state-of-the-art 3-D computer-aided beeld analyses, en de continue verfijning van moleculaire methoden die kunnen worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een behoefte aan efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken die bij voorkeur zich lenen voor kwantitatieve analyses. In de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van clearing technieken op geheel-mount dierlijke exemplaar. Zij maken het monster transparant door gebruik te maken van waterige ureum of suiker gebaseerde reagentia (bijvoorbeeld, schaal, SeeDB, CUBIC)18,19,20, of door het selectief verwijderen van lipiden (met het detergent SDS) na monsters te Embedding in stabiele hydrogels; de verwijdering van lipiden kan worden bereikt door passieve diffusie (b.v.gewijzigd duidelijkheid protocol21, PACT-PARS-velgen22) of actief door elektroforese (oorspronkelijke duidelijkheid protocol23 en ACT-PRESTO-24). Aangemoedigd door deze snelle vooruitgang, enkele afgeleide technieken zijn ook in opkomst voor gebruik in planten.
In deze paper methoden gericht op het model Arabidopsis, beschrijven we de procedure voor de juiste dissectie van de bloemknoppen, bloemen, en jonge siliques en het opruimen van geheel-mount monsters voor uiteenlopende kleuring en observatie procedures met klassieke of een recente SDS gebaseerde clearing methode. Voorbeelden voor zetmeel, callose en chromatine kleuring worden gegeven. Hoewel deze procedures verdere wellicht verbeteringen en aanpassingen bij gebruik in combinatie met andere soorten, we hopen dat ze zal het decor voor verder onderzoek op deze eenvoudige maar kritische methoden die het startpunt van vele onderzoeksprojecten.

<table><tbody><tr><td>Reagents and Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Gum arabic</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Potassium iodide</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin acid</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Fluorescent brightener 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Aniline blue</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient-rich substrate</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Watch maker's glass</td><td></td><td></td><td>No specific brand</td></tr><tr><td>15 ml falcon centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Preparation needle</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>cut edges</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Humid box</td><td></td><td></td><td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixatives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carnoy's (Farmer's) fixative</td><td></td><td></td><td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Methanol/acetic acid fixative</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td></tr><tr><td>FPA50 fixative</td><td></td><td></td><td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td>Clearing solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate/glycerol</td><td></td><td></td><td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml, water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>Herr's 4&frac12; clearing fluid</td><td></td><td></td><td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH solution</td><td></td><td></td><td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td></tr><tr><td>SDS stock solution</td><td></td><td></td><td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td></tr><tr><td>NaOH stock solution</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td></tr><tr><td>Combined clearing and staining solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>To a standard 4&frac12; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.</td></tr><tr><td>Alexander staining</td><td></td><td></td><td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4&frac12; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.</td></tr><tr><td>S

geheel-mount clearing en kleuring van arabidopsis bloem organen en siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Als gevolg van zijn geweldige hulpmiddelen voor moleculaire genetische studies is Arabidopsis thaliana een van de meest prominente model soort plantenbiologie en, vooral, reproductieve biologie van de plant. Echter, plant morfologische, anatomische en ultrastructurele analyses traditioneel betrekken tijdrovende insluiten en segmenteren van de procedures voor heldere veld, scannen en elektronenmicroscopie. Recente vooruitgang in confocale fluorescentie microscopie, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopische analyses en de continue verfijning van moleculaire technieken om te worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een toegenomen vraag naar de ontwikkeling van efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken. In dit protocol, beschrijven we technieken voor goed ontrafeling van Arabidopsis bloemen en siliques, fundamentele technieken, clearing en sommige kleuring procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Arabidopsis behoort tot de familie van Brassicacea, rekening houdend met bloeiwijzen met biseksuele bloemen gerangschikt in een corymb (Figuur 1). Elke bloem heeft vier kelkbladen, vier bloemblaadjes, zes meeldraden (vier lange en twee korte) en een syncarpous vruchtbeginsel bestaande uit twee congenitaal gesmolten carpellen (figuur 1F-H) gerangschikt in vier concentrische slierten25</s...

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Dit protocol beschrijft hoe bloemknoppen, bloemen en jonge siliques correct worden gedissecteerd. En het daaropvolgende geheel inbedden en ophelderen voor diverse kleurings- en observatietechnieken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van seksuele plantproductie.Zoals een stabiele mutantenanalyse of enige omgevings- en experimenteel geïnduceerde storing in de ontwikkeling en functie van bloemen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en snel mogelijk maakt om veel ontwikkelingsstadia tegelijk te screenen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor het dissekteren van bloemorganen moeilijk te leren zijn omdat ze voorkennis van bloemanatomie en dissectiefvaardigheden vereisen.Gebruik om te beginnen kleine schaar om bloemen uit gesynchroniseerde planten te verwijderen. En plaats ze onmiddellijk in afzonderlijke microcentrifugebuisjes, die een geschikt fixeermiddel bevatten. Vervolgens verwijdert u het fixeermiddel en voegt u voldoende 70% ethanol toe om de monsters volledig te bedekken.Breng de monsters terug naar vier graden Celsius gedurende ten minste 24 uur. Vul vervolgens een uurglas van een horlogemaker met vers gemaakte 70% ethanol en plaats deze in een kleine petrischaal voor ondersteuning. Plaats vervolgens de bloeiwijze in het uurglas en zorg ervoor dat deze volledig bedekt is met de ethanol.Gebruik pincetten en een spuit voorzien van een naald om de bloem onder de stereomicroscoop te dissekteren door de kelkblaadjes, kroonbladen en meeldraden uit elkaar te scheuren. Plaats vervolgens het uurglas opzij en gebruik een glazen latje voor de laatste dissectie. Verplaats het monster naar het latje en voeg 10 microliter vers gemaakte 70% ethanol toe.Maak sneden aan elke kant van het karpel, draai het zo nodig. Verwijder vervolgens voorzichtig de kleppen om de zaadknoppen bloot te leggen. Maak een scherpe kleine snede om de helft van het doorlatende weefsel los te maken van het ontvangstgedeelte en gebruik pincetten en een naald om de twee helften uit elkaar te scheuren.Verwijder de stigmastijl en de steel met scherpe sneden. Gebruik de pincetten en naald om voorzichtig de nog aangehechte zaadknoppen om te draaien en te rangschikken om twee parallelle rijen te verkrijgen. Gebruik een klein stukje papier om het ethanol van het monster op het glazen latje te verwijderen.Voeg vervolgens 20 microliter ophelderingsoplossing toe aan het latje. Gebruik een paar spuiten met naalden om de monsters te positioneren en eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens voorzichtig een dekglas op het latje en wacht tot de ophelderingsoplossing de ruimte tussen het dekglas en het monster heeft gevuld.Plaats het latje in een latjehouder en laat het onder de afzuigkap. Dus laten we vers geoogste bloemknoppen die op het punt staan te bloeien met niet-openspringende meeldraden. Bereid vervolgens een 96-well plate voor met voldoende Alexander-oplossing om de bloemknoppen volledig onder te dompelen.Verwijder de kelkblaadjes en kroonbladen om de meeldraden bloot te leggen en dompel ze in de Alexander-oplossing. Laat de plaat één tot drie uur onder de afzuigkap staan. Vervolgens vervangt u de Alexander-oplossing door Herr's vier en een half oplossing en incubeert u de plaat een nacht onder de afzuigkap.Gebruik de volgende dag pincetten om de opgeruimde knoppen voorzichtig naar een nieuw latje te verplaatsen. Dissecteer vervolgens de meeldraden en verwijder alle andere weefsels uit de monsters. Ga vervolgens verder met op chlooralhydraat gebaseerde opheldering en gecombineerde ophelderingskleuring met behulp van Herr's vier en een half oplossing.Verplaats eerst de bloem van het uurglas naar het latje en gebruik een papier om overtollig ethanol te verwijderen. Voeg vijf tot 10 microliter DAPI-oplossing toe. Gebruik twee spuiten met naalden om de meeldraden te dissekteren en alle andere bloemdelen te verwijderen.Laat vervolgens de pollenkorrels vrij in de DAPI-oplossing. Verwijder al het puin van de meeldraad van het latje en zorg ervoor dat alleen de pollenkorrels op het latje achterblijven. Het verwijderen van al het meeldraadpuin van het latje is de meest cruciale stap voor het verwijderen van exine.Alleen pollenkorrels mogen tussen het latje en het dekglas achterblijven. Plaats vervolgens een dekglas op het monsterdragende latje en voeg de minimale hoeveelheid DAPI-oplossing toe die nodig is om de ruimte tussen het latje en het dekglas te vullen. Plaats een wijsvinger voorzichtig op het dekglas en maak een snelle korte glijdende beweging.Plaats het latje in een mensenbox in het donker bij vier graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten. Observeer vervolgens het latje binnen 24 uur onder brede veldfluorescentie of confocale microscopie. Verplaats het gedissekteerde monster van het uurglas naar een glazen plaat met holtes gevuld met 1% SDS en een 0,2 natriumhydroxide-oplossing.Incubeer een nacht bij kamertemperatuur. De SDS-natriumhydroxide-oplossing zal de monsters snel ophelderen, waardoor ze binnen enkele minuten transparant lijken. Spoel het monster voorzichtig af met water en plaats het op een schoon latje.Voeg vervolgens 20 tot 40 microliter kleuroplossing toe aan het latje. Afhankelijk van het te analyseren bloemorgaan en de vaardigheden van de onderzoeker kan deze DS-behandeling worden uitgevoerd vóór, voor ervaren onderzoekers of na de dissectiestap voor minder ervaren onderzoekers. Plaats vervolgens een dekglas op het latje, zorg ervoor dat de voorbereiding niet wordt verpletterd.Plaats vervolgens alle voorbereide latjes in een mensenbox bedekt met aluminiumfolie en incubeer gedurende één uur bij vier graden Celsius. Observeer ten slotte het monster onder brede veldfluorescentie of confocale microscopie. Na de beschrijving van de dissectieprocedure in het protocol worden onnodige weefsels die de

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Hier wordt een methode beschreven om plantenweefsels transparant te maken met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten. Deze techniek vergemakkelijkt diepe beeldvorming van geklaarde plantenweefsels zonder fysieke doorsnede.

Optische clearing van plantenweefsels voor fluorescentiebeeldvorming

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de histologische observatie van gallen geïnduceerd door Plasmodiophora brassicae. Vibratome-secties van hypocotylen worden gewist vóór fluorescentiebeeldvorming om de betrokkenheid van transcriptiefactoren en fytohormonen tijdens ziekteprogressie te bestuderen. Dit protocol overwint de beperkingen van de inbedding van hars, waardoor planta-visualisatie van fluorescerende eiwitten mogelijk wordt.

Clearing en fluorescentiemicroscopie combineren voor het visualiseren van veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties op Plasmodiophora brassicae

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Leer geheel-mount clearing en kleuring van Arabidopsis bloemorganen en siliques voor plantenreproductieonderzoek. Deze methode maakt snelle screening van ontwikkelingsstadia mogelijk.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Meer video's verkennen