Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Het algemene doel van deze methoden is om meer inzicht te krijgen in de effecten van de behandeling op de infectiviteit of integriteit van het menselijke norovirus-capside. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van inactivatie van niet-omhulde virussen, zoals wat er gebeurt met het vermogen van het virale capside om een cel te infecteren na een bepaalde behandeling.

Het belangrijkste voordeel van deze methoden is dat ze aanvullend mechanistisch inzicht kunnen bieden in de werking van een bepaalde behandeling op het virus. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in inactivatiestrategieën voor het menselijke norovirus, kan zij potentieel ook worden toegepast op andere niet-omhulde virussen, zoals rhinovirus of hepatitis A.

Begin met het verdunnen van gezuiverd menselijk norovirus major capsid-eiwit, geassembleerd in capsiden, tot 50 micrograms per milliliter in 1X phosphate buffered saline. Gebruik een maximaal volume van 15 microliters in de individuele afgesloten PCR-buisjes.

Zorg ervoor dat de buis ten minste 600 nanogram capsid bevat en dat er 600 nanogram capsid per combinatie van behandeling en ligand aanwezig is. Verwarm vervolgens de thermocycler voor tot de gewenste hittebehandeling. Verwarm daarna een extra thermocycler voor tot vier graden Celsius voor onmiddellijke koeling.

Plaats de buisjes met capsid-oplossing voor de gewenste tijd in de thermocycler. Breng de buisjes na verhitting onmiddellijk vijf minuten over naar de vooraf gekoelde cycler op vier graden Celsius. Centrifugeer de buisjes kort om alle druppels naar de bodem van de buis te brengen.

Verdun de behandelde capsidoplanningen en de PBS tot drie micrograms per milliliter. Zorg ervoor dat er ten minste 200 microliters verdund behandeld capsid aanwezig is. Breng vervolgens 100 microliters capsidoplossing aan in elke put en zorg dat er ten minste twee putten per behandeling zijn. Voeg daarnaast voor elk ligand twee controleputten toe met 100 microliters PBS. Dit dient om de achtergrondabsorbentie van de assay te bepalen. Dek de plaat af met een deksel en verzegel de randen met paraffinefolie om verdamping te verminderen. Laat de plaat een nacht in een schuddende incubator bij vier degrees Celsius, of gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Verwijder na incubatie de behandelde capsidesoluties van de plaat. Voeg vervolgens 200 µL blokkeringsbuffer per putje toe. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of afgesloten bij vier °C gedurende de nacht.

Verdun ondertussen de gebiotineerde aptameer tot één micromolar in nucleasevrij water. Zorg dat er voldoende oplossing aanwezig is voor in totaal 200 microliters per behandeling.

Verdun daarnaast het gekozen gebiotineerde HPGA tot 30 µL per milliliter in de blokkeringsbuffer. Zorg er opnieuw voor dat er voldoende oplossing aanwezig is voor een totaal volume van 200 µL per behandeling.

Verwijder na incubatie de blokkeringsbuffer en was de plaat drie keer met 200 µL PBST per well. Dep de plaat ondersteboven op steriele papieren handdoeken om het resterende vocht te drogen. Voeg vervolgens 100 µL van de ligandbindingsoplossingen per well toe, waarbij wordt gewaarborgd dat er twee wells per combinatie van hittebehandeling en ligand zijn, en incubeer de afgedekte plaat op een orbitale schudder bij ongeveer 60 RPM gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Voeg na het wassen van de wells zoals beschreven in het tekstprotocol 100 µL per well toe van 0,2 µg/mL streptavidine-paardenradijsperoxidase in PBS.

Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden op een orbitale schudder voordat de wells opnieuw worden gewassen. Voeg vervolgens, na nog een wasbeurt, 100 µL TMB-substraat per well toe en laat de kleur gedurende vijf tot 15 minuten ontwikkelen. Observeer de wells op kleurontwikkeling.

Zorg ervoor dat de ontwikkeling voor elke replica-plaat consistent gedurende dezelfde tijd plaatsvindt en houd rekening met het absorptiebereik van de gebruikte plaatlezer. Stop de ontwikkeling van de reactie met 100 µL per well van één molar fosforzuur. Lees de plaat onmiddellijk af bij 450 nm.

Maak een nieuwe standaardprocedure voor de grootte aan in de software van het DLS-instrument, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Selecteer vervolgens de groene startpijl in de software en benoem het monster.

Verdun de hittebehandelde virusachtige deeltjes of VLP's 1 op 10 in 1X PBS voor een uiteindelijke concentratie van 5 µg/mL. Filtreer het monster vervolgens met een filter met een poriegrootte van 1 µm om stofdeeltjes te verwijderen. DLS is zeer gevoelig voor stof, aangezien grote deeltjes veel meer licht verstrooien dan kleine deeltjes. Breng 50 µL van de verdunde VLP's over in een wegwerpcuvette voor kleine volumes. Plaats de cuvette in de monsterkamer van het instrument. Start de run en gebruik de tabbladen correlogram cumulant fit en expert advice om de datakwaliteit te evalueren. Controleer tijdens de run of de polydispersiteitsindexwaarde kleiner is dan 0,3, wat duidt op een kwalitatieve meting.

Controleer in het Multiview-tabblad of de correlatiecoëfficiënt constant is en dicht bij, maar niet hoger dan één ligt bij een korte tijd, en dat deze op een later tijdstip scherp daalt naar nul, wat kenmerkend is voor de partikelgrootte. Gebruik het tabblad 'expert advice' voor feedback over de datakwaliteit tijdens de metingen. Controleer na voltooiing van de meting opnieuw of de polydispersiteitsindexwaarde kleiner is dan 0,3.

Zorg ervoor dat de cumulant-fitlijn de datapunten nauwkeurig volgt in het tabblad 'cumulants fit'. Maak een nieuwe standaardprocedure voor de grootte aan in de software van het DLS-instrument, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Selecteer de startpijl in de software om een nieuw monster te openen en te benoemen, en laat het instrument het temperatuurevenwicht bereiken.

Breng de VLP-suspensie over naar een kwartscuvette met een klein volume; vermijd luchtbellen en pipetteer langzaam tegen de wand van de cuvette. Wanneer het instrument het temperatuurevenwicht heeft bereikt, plaatst u de cuvette in de monsterkamer. Wacht 10 seconden zodat de temperatuur van het monster kan stabiliseren, start vervolgens de meting en start gelijktijdig een timer.

Stop de timer aan het einde van de eerste meting. Gebruik deze tijd als het eerste tijdstip. Verkrijg opeenvolgende tijdstippen uit de door de software geregistreerde meettimes.

Voer de hittebehandeling uit zoals voorheen, behalve dat PBS wordt vervangen door 10 millimolair HEPES, pH 7,4 en dat de capsiden na de behandeling niet verder worden verdund. Pipetteer vervolgens de volledige druppel van 15 microliter behandelde capsidoplossing op paraffinefolie. Pak de rand van het raster met een pincet vast, waarbij u deze op de rand sluit om het raster vast te houden, en plaats het raster met de koolstofzijde naar beneden op de druppel van de behandelde oplossing.

Laat het rooster 10 minuten incuberen om het capside aan het rooster te laten hechten. Afhankelijk van de zuiverheid van de capsidestofvoorbereiding kunnen wasstappen met de HEPES-oplossing worden toegevoegd in de vorm van druppels van 10 tot 15 µL, die in een lijn achter de druppel met het behandelde capside worden geplaatst. Neem na 10 minuten het rooster met de druppel op.

Plaats het rooster bijna loodrecht op een stuk filterpapier om de druppel weg te zuigen. Gebruik vervolgens het rooster om de druppel van 10 tot 15 µL HEPES-buffer op te nemen en houd dit 30 seconden vast. Na een wastijd van 30 seconden wordt de vloeistof met een ander stuk filterpapier weggezogen.

Plaats vervolgens een druppel van 15 µL van een twee procent uranylacetaatoplossing op een leeg gebied van de paraffinefolie. Neem de uranylacetaatdruppel op met het raster en houd dit 45 seconden vast. Trek daarna het uranylacetaat weg, waarbij u erop let dat het grootste deel van de oplossing wordt verwijderd.

Plaats het raster met de koolstofzijde naar boven op een stukje filterpapier, waarbij u erop let dat het raster niet aan het vocht op de pincet blijft plakken. Plaats vervolgens het filterpapier met het raster erop in een open glazen petrischaal. Nadat dit proces voor alle behandelingen is herhaald, worden de helften van de petrischaal met de rasters gedurende de nacht in een desiccator geplaatst om te drogen voorafgaand aan de observatie met TEM.

De volgende grafiek toont de afname van het bindingsvermogen van menselijke noroviruscapsiden over tijd bij een behandeling op 68 °C. Zoals te zien is, is de binding aan HPGA het eerste signaal dat volledig verdwijnt. Op dit punt wordt aangenomen dat de grote meerderheid van de capsiden in de oplossing het vermogen heeft verloren om te binden aan HPGAs van de gastheercel en dus niet door de cel kan worden geïnternaliseerd.

De binding van het aptameer weerspiegelt die van HBGA, hoewel er iets meer hittebehandeling nodig is om het signaal te verwijderen. Hier wordt een DLS-correlatiecoëfficiëntcurve getoond die representatief is voor data van goede kwaliteit. Op een tijdstip dicht bij nul is het correlogram constant op een waarde die dicht bij, maar onder de één ligt.

Vervolgens daalt het scherp naar nul op een tijdstip dat kenmerkend is voor de partikelgrootte. De grootte-resultaten van dit experiment kunnen waarschijnlijk worden vertrouwd. Omgekeerd is deze correlatiecoëfficiëntcurve representatief voor gegevens van slechte kwaliteit.

Het correlogram begint bij een waarde boven één en daalt geleidelijk naar nul. De resultaten van dit experiment mogen niet worden gebruikt. Hier vertonen de gegevens over de deeltjesgrootte een duidelijk aggregatieprofiel voor capsiden die behandeld zijn bij 68 °C, waarbij superaggregaten worden gevormd na ongeveer 20 minuten.

Het tijdstip waarop de superaggregatie optreedt, is kenmerkend voor de gevoeligheid van de VLPs voor die behandeling. Deze figuur visualiseert de TEM-resultaten voor de hittebehandeling van menselijke noroviruscapsiden. Hier werden de capsiden behandeld bij 60 tot 80 °C van links naar rechts.

Zoals te zien is, verandert de morfologie van de capsiden duidelijk na behandeling, aangezien de capsiden aggregeren en denatureren. Een soortgelijk fenomeen wordt waargenomen voor capsiden die gedurende nul tot 25 minuten bij 68 °C zijn behandeld.

Zodra men deze technieken beheerst, kunnen ze in één tot 24 uur worden uitgevoerd indien ze correct worden toegepast.

Na de ontwikkeling bood deze techniek onderzoekers op het gebied van de voedselvirologie een aanvullende mogelijkheid om de mechanismen en effecten van inactivatie op het capside van humane norovirussen te onderzoeken. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals real-time RT-PCR met en zonder RNase-voorbehandeling, SDS-page van virale capsiden en plaque-assays met kweekbare surrogaatvirussen, worden uitgevoerd om een vollediger totaalbeeld te krijgen van de virale reductie na een bepaalde behandeling. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ligandbinding, dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie kunt gebruiken om verder mechanistisch inzicht te krijgen in de effecten van inactivatiebehandelingen op het humane noroviruscapside.

Vergeet niet dat het werken met sommige van de gebruikte reagentia gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het volgen van de beste praktijken voor laboratoriumveiligheid.