Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Het algemene doel van deze methoden is om meer inzicht te krijgen in de effecten van een behandeling op de besmettelijkheid of integriteit van de humane norovirus-capsiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van inactivatie van niet-omhulde virale deeltjes. Zoals wat er gebeurt met het vermogen van de virale capsiden om een cel te infecteren na een bepaalde behandeling.

Het grootste voordeel van deze methoden is dat ze aanvullende mechanistische inzichten kunnen bieden in de werking van elke gegeven behandeling op het virus. Hoewel deze methode inzicht kan geven in inactivatiestrategieën voor humaan norovirus, kan deze ook worden toegepast op andere niet-omhulde virussen zoals rhinovirus of hepatitis A. Om te beginnen, verdunt u gezuiverd humaan norovirus-hoofdcapsid-eiwit, geassembleerd in capsiden tot 50 microgram per milliliter in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Gebruik een maximaal volume van 15 microliter in de afzonderlijke PCR-buisjes met dop.

Zorg ervoor dat de buis ten minste 600 nanogram capsiden bevat en dat er 600 nanogram capsiden per behandelingsligande-combinatie is. Verwarm vervolgens de thermocycler voor tot de gewenste warmtebehandeling. Verwarm vervolgens een extra thermocycler voor tot vier graden Celsius voor onmiddellijke koeling.

Voeg de buisjes met capsid-oplossing toe aan de thermocycler voor de gewenste tijd. Breng de buisjes na het verwarmen onmiddellijk over naar de voorgekoelde vier graden Celsius-cyclus gedurende vijf minuten. Draai de buisjes kort in de centrifuge om alle druppels naar de bodem van de buis te laten zakken.

Verdun de behandelde capsid-oplossingen en PBS tot drie microgram per milliliter. Zorg ervoor dat er ten minste 200 microliter verdunde behandelde capsiden zijn. Breng vervolgens 100 microliter capsid-oplossing aan op elke put en zorg ervoor dat er ten minste twee putten per behandeling zijn.

Neem ook twee controleputten op met 100 microliter PBS voor elke ligand. Dit biedt de achtergrondabsorptie van de assay. Bedek de plaat met een deksel en verzegel de randen met paraffinefolie om verdamping te verminderen.

Laat de plaat overnacht staan in een schuddende incubator bij vier graden Celsius of gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Na incubatie verwijdert u de behandelde capsid-oplossingen van de plaat. Voeg vervolgens 200 microliter blokkeringsbuffer per put toe.

Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Verdun ondertussen de biotinyleerde aptamer tot één micromolair in nuclease-vrij water. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing is voor in totaal 200 microliter voor elke behandeling.

Verdun ook de gekozen biotinyleerde HPGA tot 30 microliter per milliliter in de blokkeringsbuffer. Zorg er opnieuw voor dat er voldoende oplossing is voor in totaal 200 microliter totaal volume voor elke behandeling. Na incubatie verwijdert u de blokkeringsbuffer en was de plaat drie keer met 200 microliter per put PBST.

Dek de plaat af met steriel papier om de resterende vocht te drogen. Vervolgens, bij 100 microliter per put van de ligandbindingsoplossingen, zorg ervoor dat er twee putten zijn per warmtebehandelingsligande-combinatie, incubeer de afgedekte plaat op een orbitale shaker bij ongeveer 60 RPM gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na het wassen van de putten zoals beschreven in het tekstprotocol, voegt u 100 microliter per put toe van 0,2 microgram per milliliter streptavidin paardenraden peroxidase en PBS.

Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden op een orbitale shaker voordat u de putten opnieuw wast. Voeg vervolgens na nog een wasbeurt 100 microliter per put toe van TMB-substraat en laat de kleur zich ontwikkelen gedurende vijf tot vijftien minuten. Observeer de putten op kleur.

Zorg ervoor dat u consistent gedurende dezelfde tijd ontwikkelt tussen replicaatplaten en wees u bewust van het absorptiebereik van de gebruikte platenlezer. Stop de ontwikkeling van de reactie met 100 microliter per put van een molaire fosforzuur. Lees de plaat onmiddellijk bij 450 nanometer.

Maak een nieuwe standaardprocedure voor de grootte in de DLS-instrumentsoftware zoals beschreven in het tekstprotocol. Selecteer vervolgens de groene pijl voor uitvoering in de software en geef de monsternaam op. Verdun de warmtebehandelde virusachtige deeltjes of VLP's een op tien in 1X PBS voor een eindconcentratie van vijf microgram per milliliter.

Filter vervolgens het monster met een poriëngrootte van één micron om stofdeeltjes te verwijderen. DLS is erg gevoelig voor stof, omdat grote deeltjes veel meer licht verstrooien dan kleine deeltjes. Breng 50 microliter van de verdunde VLP's over in een kleine volume wegwerpcuvet.

Plaats de cuvet in de monsterkamer van het instrument. Start de run en gebruik de correlatiegramcumulantfit en deskundige adviezen-tabs om de gegevenskwaliteit te evalueren. Controleer tijdens de run of de polydispersiteit van de indexwaarde minder dan 0,3 is, wat een kwaliteitsmeting vertegenwoordigt.

Zorg er in het multiview-tabblad voor dat de correlatiecoëfficiënt constant is en dichtbij maar niet meer dan één bij een korte tijd en daalt scherp af naar nul bij een latere tijd, kenmerkend voor deeltjesgrootte. Gebruik de deskundige adviezen-tab voor feedback over de gegevenskwaliteit tijdens de metingen. Controleer na voltooiing van de meting opnieuw of de polydispersiteit van de indexwaarde minder dan 0,3 is.

Zorg ervoor dat de cumulantfit-lijn de gegevenspunten nauwgezet volgt in de cumulantenfit-tab. Maak een nieuwe standaardprocedure voor de grootte in de DLS-instrumentsoftware zoals beschreven in het tekstprotocol. Selecteer de uitvoeringspijl in de software om een nieuwe monster te openen en te benoemen en laat het instrument de temperatuureenheid bereiken.

Breng de VLP-suspensie over naar een kleine volume kwartscuvet en vermijd luchtbellen en pipet langzaam tegen de wand van de cuvet. Nadat het instrument temperatuureenheid heeft bereikt, plaatst u de cuvet in de monsterkamer. Wacht 10 seconden totdat