Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Het algemene doel van deze procedure is om drie monoamine neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen gelijktijdig te bepalen via een eenvoudige vaste-fase-extractie gekoppeld aan hoogdrukunvloeistofchromatografie met elektrochemische detectie. Deze methode kan onstabiele doelverbindingen in een volledig monster voorspellen en bepalen met eenvoudige bediening in een korte tijd. Uw voorbeelden kunnen eenvoudig voorgereinigd worden door een nauwe vezel gevulde vaste-fase quorum, en de analyten in het monster kunnen gemakkelijk worden verrijkt, opgelost en gedetecteerd op een elektrochemisch-detectiesysteem.

We kwamen eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat extractie en analyse van catecholamine neurotransmitters in biologische vloeistoffen cruciaal is bij het beoordelen van de weerstandsfunctie en de bijbehorende ziekten. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen omdat blootstelling aan licht moet worden vermeden, en de prebehandelingstijd zo kort mogelijk moet zijn. Bij het demonstreren van de procedure hebben we Lanlan Wei en Qing Han, twee promovendi uit ons laboratorium.

Om te beginnen, bereidt u een stockoplossing van twee milligram per milliliter DPBA-oplossing voor door twee milligram van de verbinding op te lossen in één milliliter gedestilleerd water. Bewaar de oplossing in het donker bij vier graden Celsius. Houd bij het bereiden van de analytenverlengers rekening met de chemische structuur en de eigenschappen van catecholamines die onstabiel zijn, en omdat ze gemakkelijk ontbinden, moet het bereidingsproces van de verlengers erg snel zijn en moet blootstelling aan dun zonlicht worden vermeden.

Weeg 1,0 milligram norepinefrine, epinefrine, dopamine, MHPG, DOPAC en interne standaard DHBA in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Voeg 1,0 milliliter gedestilleerd water toe om elk van de verbindingen op te lossen, behalve epinefrine, dat moet worden opgelost in een oplossing van 0,01 mol per liter zoutzuur. Oscilleer de bereide standaarden in het donker op hoge snelheid totdat de analyten volledig zijn opgelost.

Dit zijn de primaire voorraden en kunnen gedurende maximaal enkele weken bij min 20 graden Celsius worden bewaard. Om de secundaire analytevoorraden van norepinefrine, epinefrine, dopamine, DOPAC en MHPG voor te bereiden, brengt u vijf microliter van elk primaire analytevoorraad over in 4.975 microliter gedestilleerd water in afzonderlijke centrifugebuisjes van vijf milliliter. Bereid deze oplossingen dagelijks vers en bewaar de oplossingen in het donker bij vier graden Celsius tot gebruik.

Voor DHBA brengt u vijf microliter van de primaire voorraad over in 4.995 microliter gedestilleerd water in een centrifugebuisje van vijf milliliter en bewaar het afzonderlijk in het donker bij vier graden Celsius. Maak verdere verdunningen met de secundaire analytevoorraad om een standaardcurve te maken. Bewaar de oplossingen in het donker bij vier graden Celsius en bereid ze dagelijks vers.

Test vervolgens de optimale spanning van de ECD-detector met de standaardvoorraad met de juiste concentratie. Varieer de spanning om een waarde te vinden waarbij de analyten de beste piekverschijning hebben. Om 10 milliliter eluent-oplosmiddel voor te bereiden, gebruikt u 5,5 milliliter gedestilleerd water, voegt u vervolgens 1,5 milliliter acetonitril en drie milliliter fosforzuur druppel voor druppel toe aan het water.

Om de mobiele fase voor te bereiden, meet u de componenten die in het tekstprotocol staan opgegeven in een schone fles van één liter. Voeg 40 milliliter acetonitril en gedestilleerd water toe aan 1.000 milliliter. Roer en tril ultrasoon gedurende 15 minuten totdat de materie in de oplossing volledig is opgelost.

Gebruik een pH-meter met een glazen elektrode om de pH-waarde van de mobiele fase aan te passen naar 4,21 met een verzadigde natriumhydroxideoplossing. Filter de mobiele fase met een polyvinylideenfluoride-microporieuze membraan van 0,45 micron en een vacuümzuigapparaat om onzuiverheden te verwijderen. Gebruik ultrasoon trillen gedurende 15 minuten om de mobiele fase elke keer voor gebruik te degasseren.

Vervolgens moet u de urinemonsters voor de behandeling vortexen en centrifugeren bij 1.510 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de meeste deeltjesinterferentie te verwijderen. Verzamel de supernatanten en gooi het sediment weg voor verdere experimenten. Om de analyten effectief te extraheren, gaat u onmiddellijk na het centrifugeren naar de Vaste-Fase-Extractie met Gevulde Vezels, of PFSPE-voorbehandeling.

Om de nanovezels te activeren, drukt u 100 microliter methanol en 100 microliter water sequentieel door de PFSPE-kolom met behulp van een spuit van vijf milliliter op een langzame druppelsgewijze manier. Het urinemonster moet worden gemengd met DPPA-oplossing om de hydrofobiciteit te verbeteren en de catecholamines en metabolieten te helpen absorberen op de vezels. DHBA-oplossing moet ook worden toegevoegd als interne standaard.

Meng 100 microliter urinemonster met 100 microliter van een oplossing van twee milligram per milliliter DPBA en 30 microliter van een oplossing van 100 nanogram per milliliter DHBA interne standaard in een Eppendorfbuisje van 0,5 milliliter. Druk vervolgens de gemengde monsteroplossing door de PFSPE-kolom met behulp van een plastic spuit van vijf milliliter van het gastype met de kracht van de luchtdruk. Spoel de kolom drie keer uit door met behulp van een plastic spuit van vijf milliliter van het gastype 100 microliter van de DPBA-oplossing in de SPE-kolom te laden en de oplossing langzaam door de cartridge te duwen met luchtdruk.

Deze spoelstaps is noodzakelijk omdat de DPBA-oplossing de onzuiverheden kan verwijderen terwijl de analyten worden vastgehouden, waardoor de gevoeligheid en selectiviteit voor de analyten wordt verbeterd. Laad vervolgens 50 microliter van het eluent op de PFSPE-kolom en duwt het door de kolom, waarbij de eluaat wordt verzameld in een Eppendorfbuisje van 0,5 milliliter. Schakel de HPLC-ontgasser in om de lucht in het systeem te ontgassen.

Voor de monsteranalyses moet het systeem meer dan 0,5 uur met de mobiele fase lopen om de baselineruis te egaliseren en te verminderen. Neem