Name: Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor de extractie en analyse van catecholamine-neurotransmitters en hun metabolieten in urine van zuigelingen met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation of China (No.81172720, nr. 81673230), de sociale ontwikkeling onderzoek programma van Jiangsu provincie wetenschap en technologie afdeling (nr. BE2016741), Science & technologieproject van China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), het Open Project programma van belangrijke laboratorium voor de ontwikkeling van het kind en het leren van de wetenschap van het ministerie van onderwijs, Zuidoost-Universiteit (CDLS-2016-04). Wij erkennen oprecht Yuan lied en Ping Liu die ons in monsters collectie geholpen.

Geïnformeerde toestemming van de ouders was verkregen, en institutionele beoordeling van bestuur goedkeuring is verkregen voor de studie. De studie werd uitgevoerd overeenkomstig de gedragscode van de World Medical Association (verklaring van Helsinki) voor het uittesten van mensen. De verzorgers van alle deelnemers verstrekt schriftelijke toestemming voor het in de studie wordt ingeschreven. Ethisch comité goedgekeurd door Zhongda ziekenhuis, affiliate met Zuidoost-Universiteit, werd ook verkregen.
1. bereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de extractie en de vastberadenheid van Catecholamines en kolommen
<ol><li>De kolom PFSPE voor te bereiden. 1-2 mg PCE-PS nanofibers in 5-6 aliquots verdelen, en gebruik een fijne stalen staaf met 0,5 mm diameter om deze ordelijk in het einde van een pipet-tip met een volume van 200 µL comprimeren.</li>
	<li>Bereiden van het kunstmatige urine door weging 2.427 g ureum 0.034 g urinezuur, 0.09 g creatinine, 0,297 g Trinatriumcitraat citraat, 0.634 g natriumchloride, 0,45 g kaliumchloride, 0.161 g ammoniumchloride, 0.089 g calciumchloride-dihydraat, 0,1 g magnesiumsulfaat -heptahydraat, 0.034 g natriumbicarbonaat 0.003 g natrium oxalaat, 0.258 g Natriumsulfaat, 0,1 g natriumfosfaat kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water, en 0.011 g Dinatrium waterstof fosfaat en los de bovenstaande chemicaliën in 200 mL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Bereiden van 2 mg/mL stockoplossing van diphenylborate (DPBA) oplossing door oplossend 2 mg van de stof in 1 mL gedestilleerd water. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.</li>
	<li>
Analyt standaard Opmerking: De chemische structuur en eigenschappen van catecholamines zijn instabiel, en ze gemakkelijk ontleden. Het voorbereidingsproces van normen moet zeer snel en moet voorkomen dat blootstelling aan direct zonlicht.<ol>
<li>Weeg 1.0 mg NE, E, DA, MHPG, DOPAC en interne standaard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen. Verdun de DHBA oplossing in water tot 100 ng/mL vóór gebruik.</li>
		<li>Oscillate de bereid normen in het donker op een hoge snelheid totdat analyten volledig los. Dit is de primaire voorraad; bewaren bij-20 ° C voor maximaal enkele weken.</li>
		<li>De secundaire 1000 ng/mL analyt voorraden voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van elke primaire analyt voorraad in 4,975 ÂµL van gedistilleerd water in een centrifugebuis 5 mL voor NE, E, DA, DOPAC en MHPG, en bewaren het in het donker bij 4 ° C tot gebruik. Deze vers dagelijks van oplossingen voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van primaire voorraad in 4,995 ÂµL van gedistilleerd water in een centrifugebuis 5 mL voor DHBA, en slaat u op in het donker afzonderlijk bij 4 ° C.</li>
		<li>Maken verdere verdunningen met de secundaire analyt voorraad aan standaard curven maken (bijv., aanvullende tabel 2). Opslaan van oplossingen in het donker bij 4 ° C en bereiden van verse dagelijks.</li>
		<li>Test de optimale spanning van ECD detector met behulp van de standaard voorraad met goede concentratie. Variëren de spanning om te zoeken naar een waarde waar de analyten de beste piek uitstraling hebben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van eluant met 30% fosforzuur, 15% acetonitril, en 55% gedestilleerd water. Voor 10 mL oplosmiddel per eluant, gebruik van 5,5 mL gedestilleerd water en voeg 1,5 mL acetonitril en 3 mL fosforzuur druppelsgewijs in het water.</li>
</ol>2. voorbereiding van de echte Urine monsters en mobiele fase
<ol><li>Hebben moeders de eerste ochtend urine van hun zuigelingen met cups van aseptische urine verzamelen. Breng de monsters in polypropyleen tubes en label onmiddellijk. Sla de monsters in een vriezer van-20 ° C.</li>
	<li>Vortex en centrifuge de urine monsters bij 1,510 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om zich te ontdoen van de meeste deeltjes inmenging. Negeren van het sediment en het supernatant voor verdere experimenten te verzamelen. Om de analyten effectief uitpakken, gaat u verder met PFSPE voorbehandeling (stap 3) direct na het centrifugeren.</li>
	<li>
De mobiele fase voor te bereiden
	<ol>
<li>Bereiden van een schone fles, ten minste 1 L. De samenstelling van de mobiele fase wordt vermeld in de aanvullende tabel 1; voor 1 L mobiele fase, maatregel 6.7242 g citroenzuur, 93.06 mg van ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) Dinatrium zout, 7.02 g monometallistische natrium ORTHOFOSFAAT, hydrateren 404.5 mg 1-heptanesulfonic zuur natrium zout en 3,5 g natrium in de fles. Voeg 40 mL acetonitril en gedestilleerd water tot 1000 mL. Doorroeren en trillen corrosiebestendige gedurende 15 minuten, totdat de zaak in de oplossing is allemaal opgelost.</li>
		<li>Gebruik een pH-meter met een glaselektrode, pas de pH-waarde van de mobiele fase om 4.21 met een verzadigde natriumhydroxide-oplossing.</li>
		<li>De mobiele fase met een membraan 0,45 µm Polyvinylideenfluoride fluoride microporeuze en een vacuüm zuig-apparaat om zich te ontdoen van onzuiverheden filteren.</li>
		<li>Gebruik ultrasone trillingen voor 15 min te ontgas de mobiele fase telkens vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PFSPE extractie en HPLC analyse
<ol><li>Het activeren van de nanofibers. Druk op 100 µL van methanol en 100 ÂµL van water achter elkaar door de kolom van de PFSPE met behulp van een spuit 5 mL in een langzame, dropwise manier.</li>
	<li>Mix 100 µL urine proeven met 100 µL 2 mg/ml DPBA en 30 µL 100 ng/ml van DHBA oplossing (IS, interne standaard) in een tube van 0,5 mL EP, dan de gemengde oplossing naar de kolom PFSPE. Druk op de oplossing van de gemengd monster door de kolom PFSPE met een 5 mL gasdicht kunststof spuit met behulp van de kracht van de luchtdruk.</li>
	<li>Uitspoelen van de kolom drie keer door het laden van 100 µL DPBA oplossing (2 mg/mL) in de kolom van de SPE, en druk op de oplossing langzaam door de cartridge met behulp van een gasdichte kunststof spuit 5 mL luchtdruk.</li>
	<li>Laden 50 µL van de eluant op de PFSPE kolom en het doorzetten van de kolom, het verzamelen van het eluaat met een 0,5 mL EP-buis.</li>
	<li>De HPLC-degasser naar ontgas de lucht in het systeem inschakelen. Voorafgaand aan de voorbeeld-analyses, moet het systeem worden uitgevoerd gedurende meer dan 0.5 uur met de mobiele fase equilibreer en beperking van het lawaai van de basislijn. Zie aanvullende tabel 1 toont de setup-parameters van het HPLC-systeem.</li>
	<li>Monster 20 µL van het eluaat met behulp van een automatische sampler, en het vervolgens te injecteren in de HPLC-ECD-systeem.</li>
	<li>Wanneer de punten zijn voltooid, schakelt u de detector-cel met de detector-interface. Zet niet uit de cel met de schakelaar aan de achterkant van de detector, aangezien dit het instrument zou kunnen beschadigen.</li>
	<li>Handmatig omzetten in de samenstelling van de mobiele fase 10% methanol en 90% water. Een looptijd van ten minste 30 min. Vervolgens handmatig wijzigen in de mobiele fase methanol van HPLC-kwaliteit. Een looptijd van ongeveer 15 min ter bescherming van het systeem in methanol. Niet-uitvoeren van deze stap na de aanbevolen lopende tijd kan leiden tot schade aan de kolom en de detector. Uitschakelen van de stroom, dan de degasser uitschakelen.</li>
</ol>4. Phenylboronic zuur Cartridges (PBA) extractie
PBA cartridge extractie procedures waren gelijk aan de regeling in Kumar et al. (2011) 25. alle oplossingen worden geduwd door de PBA-cartridge (100 mg, 1 mL) met lucht gedwongen door een spuit.
<ol><li>Conditie van de cartridge met 1 mL 80:20 acetonitril-water (v/v) die 1% mierenzuur en 1 mL 50 mM fosfaatbuffer (pH 10) achter elkaar bevatten.</li>
	<li>Druk op de gebufferde urine monster (1 mL urine en 2 mL fosfaatbuffer, pH 8,5) door de PBA-cartridge.</li>
	<li>Wassen van de cartridge met 1 mL 50:50 v/v acetonitril-fosfaatbuffer (10 mM, pH 8,5).</li>
	<li>Elueer de cartridge met 1 mL acetonitril / water (80:20 v/v) met 1% mierenzuur.</li>
</ol>5. identificatie en kwantificering van Catecholamines
<ol><li>
Lineariteit
	<ol>
<li>Verdun de secundaire analyten voorraad met kunstmatige urine aan zes concentraties (1.5, 3, 12, 25, 50 en 100 ng/mL); de omvang van de verdunning van de kunstmatige urine volgt aanvullende tabel 2. Maak drie parallelle monsters met elke concentratie om 18 analyt experimentele oplossingen voor de bouw van de kalibratiekrommen.</li>
		<li>Verdun de secundaire materieel DHBA met kunstmatige urine 10-fold om 100 ng/mL experimentele oplossing.</li>
		<li>Voorbehandeling alle oplossingen van de analyt van 5.1.1, volgens stap 3 (PFSPE extractie procedures). Als in stap 3, door 20 µL van elke overeenkomstige eluaat te injecteren in de HPLC-ECD-systeem om een chromatogram van HPLC.</li>
		<li>Teken kalibratiekrommen van de vijf analyten door de verhouding van piekoppervlakte (doelen/IS) als de Y-as tegen de verhouding van concentraties (doelen/IS) als de X-as, zoals in aanvullende figuur 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LOD en LOQ waarde voor de lichtgevoeligheid
	<ol>
<li>Injecteren 20 µL van de lege kunstmatige urine in de HPLC-ECD-systeem (zoals in stap 3), met het oog op het chromatogram van HPLC van het monster.</li>
		<li>In het chromatogram van 5.2.1, verzamelen van 11 leeg signaal waarden en berekent de gemiddelde waarde Xb en de standaardafwijking Sb. Berekenen van de minimale signaal van een stof die kan worden ontdekt op een bepaald niveau van vertrouwen, XL, zoals XL X =b+ K * Sb (K is de coëfficiënt bepaald door betrouwbaarheidsniveau, Sb weerspiegelt geluidsniveau van de meetmethode en geluidsniveau van de machine). Dus, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S staat voor de waarde van de helling van de curve van de werken).</li>
		<li>Een S/N van 3:1 (K = 3) als de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) en een S/N, van 10:1 (K = 10) als de grens voor kwantificering (LOQ) definiëren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evalueren van de terugvorderingen
	<ol>
<li>Echte en puntige urine monsters voor te bereiden. Verdun de secundaire analyten voorraad met echte urine aan drie concentraties (5, 50, 100 ng/mL) te verkrijgen de puntige urine monsters. Bereiden drie parallelle monsters voor elke oplossing van de analyt. Tellen de puntige concentratie als de hoeveelheid doel verbindingen spiked in het monster urine. Deze waarde is gedefinieerd als eens.</li>
		<li>Verdunde DHBA voorraad tot 100 ng/mL, zoals in stap 5.1.2.</li>
		<li>Verwerken van elke oplossing van het monster uit 5.3.1 volgens stap 3 (PFSPE extractie procedures) en de 20 µL van elke overeenkomstige eluant injecteren in de HPLC-ECD-systeem om het chromatogram resultaat te krijgen. De waarde van de analyten wordt gerekend als een hoeveelheid doel verbindingen gekwantificeerd in de steekproef puntige urine. Deze waarde is gedefinieerd als eent.</li>
		<li>Injecteren 20 µL van urine monster in de HPLC-ECD (zoals in stap 3) systeem om het chromatogram resultaat te krijgen. De waarde van de analyten wordt gerekend als een initiële hoeveelheid van doel verbindingen gekwantificeerd in de steekproef van de urine. Deze waarde is gedefinieerd als eenik.</li>
		<li>Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Het percentage herstel wordt geraamd op methodologische herstel % = (eent - Aik) × 100 / (As). Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evalueren de onnauwkeurigheid
	<ol>
<li>Puntige kunstmatige urine monsters 5, 50 en 100 ng/mL concentraties zoals in stap 5.3.1 voor te bereiden. Bereiden zes parallelle monsters voor elke oplossing van de analyt. Bereiden van verse experimentele monsters elke dag.</li>
		<li>Verdun DHBA voorraad tot 100 ng/mL zoals in stap 5.1.2.</li>
		<li>Evalueren van de precisie van de intra-day (n = 6). Verwerken van elke oplossing van het monster in 5.4.1 volgens stap 3 en de 20 µL van elke correspondent eluant injecteren in de HPLC-ECD-systeem om het chromatogram. Doe dezelfde bewerking zesmaal op dezelfde dag.</li>
		<li>Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Onder dezelfde concentratie van de dezelfde compound, wordt de relatieve standaardafwijking (RSD) van de zes tests in één dag bepaald als intradaagse-precisie. Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.</li>
		<li>Evalueren van de precisie van Inter dag (n = 6). Tegelijkertijd elke dag in de zes opeenvolgende dagen, puntige kunstmatige urine monsters te bereiden voor de drie concentraties van 5, 50, 100 ng/mL, zoals in 5.4.1 en 5.4.2., en verwerken van elke analyt monsteroplossing volgens stap 3.</li>
		<li>De 20 µL van elke overeenkomstige eluaat uit 5.4.5 injecteren in het systeem van de HPLC-ECD chromatografische om resultaten te krijgen elke dag. Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Tussen dag precisie wordt uitgedrukt door de RSD hoeveelheid het testen van de monsters van de puntige kunstmatige urine bij de drie concentraties in zes opeenvolgende dagen. Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang met elke financiële organisatie met betrekking tot het materiaal dat in dit artikel besproken is.

De voorgestelde methode PFSPE in dit document mogelijk belangrijke en zinvolle ten aanzien van zijn snelheid, eenvoud en gemak. De adsorbents gebruikt in het protocol zijn electrospun nanofibers, die hebben hoge oppervlakte gebied-te-volume verhoudingen en de analyten adsorberen met een hoog rendement. De procedure alleen moet een paar milligram van nanofiber en een klein volume van eluant oplosmiddel, en hoeft niet een stap van de verdamping te concentreren van de analyten. Wij hebben hier een gedetailleerd overzicht va...

Catecholamine neurotransmitters kunnen hun metaboliet inhoud in lichaamsvloeistoffen neurale functioneren aantasten en invloed hebben op het saldo van de reactie-naar-stimulans Staten op een groot deel1. Abnormities kan leiden tot allerlei ziekten, zoals pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoom en neurologische aandoeningen1,2. De extractie en de vastberadenheid van catecholamines in lichaamsvloeistoffen is zinvol voor de diagnose van de relevante ziekten. Echter catecholamines in biologische monsters bestaan in lage concentraties en gemakkelijk worden geoxideerd. Bovendien zijn ze zeer moeilijk te elueren vanwege de grote hoeveelheid inmenging in de middelgrote3. Simultane detectie van catecholamines in biologische vloeistoffen is dus nog steeds een uitdaging.
Zijn er beoordelingen aantonen dat urine catecholaminen kan een maatregel van stress, en dat hun niveaus zijn belangrijke biologische markers reageren op tactiele stimulatie verwerking in pasgeborenen5. Volgens het onderzoek, alle zuigelingen die hebben geleden onder voorbarig incidenten in gevaar voor hersenen letsel4,5,6, en schade kan veroorzaken abnormale vrijkomen van catecholamines en aanverwante zaken in de vloeistoffen. Er bestaan technieken van geavanceerde magnetische resonantie dat schade aan de hersenen in eerdere fasen7,8 detecteren kunnen. Echter binnen de eerste 48 uur, zal een abnormale neurodevelopmental proces veroorzaken permanente hersenletsel die niet zal in medische beelden11 blijken. Bovendien, het instrument van de hoge kosten en schaarse middelen, samen met andere factoren, maakt het onmogelijk voor alle neonatale eenheden toegang hebben tot deze gespecialiseerde neuro-imaging technieken. Echter, het gebruik van een gemakkelijk toegankelijke en praktische biomerker (zoals catecholamines en hun metabolieten) kon deze tekortkomingen verhelpen en de screening van een biomarker in menselijke vloeistoffen kan helpen in de vroege diagnose van hersenletsel en leiden tot vragen identificatie van pasgeboren zuigelingen neuroprotectie9nodig. De catecholaminen in urine kan een eenvoudig en duidelijk-index, vanwege de directe correlatie tussen de hoeveelheid ze vrijkomen van vloeistoffen en neuroactivity functie.
Onder biologische vloeistoffen, cerebrospinale vloeistof (CSF) en plasma monsters zijn niet gemakkelijk te bereiken via bestaande traumatische procedures, en het is ook zeer moeilijk om zich te ontdoen van interferentie als gevolg van zelfklevende eiwitten en andere onzuiverheden, wat leidt tot een storend en de bemonstering van de tijdrovende proces dat is niet geschikt voor herhaald detectie. Ook voor kinderen is het bijna onmogelijk om de monsters in een traumatische manier. Daarom urine bemonstering is beter dan de andere vormen van monsterneming, als het niet-invasieve, eenvoudig te bedienen, en herhaaldelijk kan worden gedaan. Urine monsters zijn overvloedig en makkelijk om te slaan, en Toon grote voordelen ten opzichte van de andere vormen van biologische monsters.
De belangrijkste methoden te kwantificeren catecholamines in biologische vloeistoffen zijn radioenzymic assays10, immuun-sorptiemiddel assays enzyme-linked11, voltammetrie12 en thermische lens spectrometrie13. Maar tekortkomingen bestaan, zoals de ingewikkelde operaties en hard-aan-detect meerdere doelen. Vandaag, is de dominante analysetechniek krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)14, in combinatie met gevoelige elektrochemische15 of fluorimetrische detectie16, vanwege de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Met tandem massaspectrometrie technologie, zoals vloeibare chromatografie/massaspectrometrie (LC/MS) en vloeibare chromatografie/massa spectrometrie/massaspectrometrie (LC/MS/MS), de analyse en de kwantificering van de neurotransmitters hoog kunnen bereiken nauwkeurigheid en specificiteit17,18. De MS-techniek verlangt echter duur instrumentatie evenals aanzienlijk gekwalificeerde arbeidskrachten, waardoor de methode moeilijk universeel toepasbaar in de meeste conventionele laboratoria. HPLC-ECD systemen zijn meestal voorzien in de meest conventionele en klinische laboratoria, en zijn verworden tot een gemeenschappelijk en goede keuze voor onderzoeksgroepen moeten worden gebruikt voor chemische bepaling, maar zij vereisen het monster geïntroduceerd in het systeem te reinigen en van Microscale volume19. Het is dus van groot belang om te zuiveren en het monster vóór de analyse te laten condenseren. De klassieke methode voor de zuivering is vloeistof-vloeistof extractie14,15,20 en off-line solid-phase extraction, met inbegrip van de kolom geactiveerd aluminiumoxide kolom21,22 en diphenylborate (DPBA) kleurverandering23,24,25,26.
Myeongho Lee et al. zijn geweest using polymeer hars, chemisch gewijzigd met kroon ether als de absorberend selectief catecholamines extraheren uit menselijke urine sinds 200727. Ook in 2006, hij Haibo et al. aangetoond van een benadering van de facile synthese voor boronate affiniteit extractie sorptiemiddel byutilizing een functionalizable nanomagnetic polyedrale oligomere silsesquioxane (POSS) gebaseerde nanomagnetic composiet, en toe te passen op de verrijking van catecholamines in menselijke urine (adrenaline, noradrenaline en isoprenaline)28. Ze maakte ook gebruik van de nanomaterialen aan het werk, met behulp van een technologie genaamd nano-electrospinning en de vorming van het polymeer materiaal in nanoschaal te vervullen. Het electrospinning-proces kunt aanpassen de diameter, morfologie en ruimtelijke uitlijning van het product door de werkende spanning beheersen en veranderen van de inhoud van de spinnen-oplossing samen met andere parameters29. Vergeleken met de conventionele SPE cartridge, electrospun nanofibers zijn zeer geschikt om te halen en verrijken van doel analyten uit een complexe matrix, zoals ze zijn uitgerust met hoge oppervlakte-gebied-te-volume verhoudingen te adsorberen van de analyten met hoog rendement, en vertonen meer gemakkelijk-gecontroleerde oppervlakte chemische eigenschappen, handige beslag op de doel-verbindingen toe te staan. Deze eigenschappen maken hen goede keuzen voor SPE adsorbents, sterk verminderen van de vaste fase en desorptie oplosmiddel bedrag30,31,32,33. Voor catecholamines in urine monsters, werden electrospun nanofibers, samengesteld uit apolymeric kroon ether met polystyreen (PCE-PS) gebruikt om selectief uitpakken drie catecholamines (NE E en DA)34. Het papier aangegeven dat de selectieve kroon ether de doelstellingen van NE, E en DA, die was gebaseerd op de juiste geometrie geadsorbeerde voor bindende catecholamines via vorming van waterstofbruggen. De resultaten weergegeven de materiële kroon ether effectief, het verwijderen van andere storende stoffen bevatte in biologische monsters. Geïnspireerd door dit verslag, een nieuwe methode is ontwikkeld voor de selectieve extractie van de catecholaminen door gebruik van electrospun samengestelde nanofibers samengesteld uit PCE-PS.
In deze paper gemelde de methode eerder34 was verbeterd en gebruikt niet alleen om succesvol te analyseren E, NE, en DA, maar ook hun metabolieten, MHPG en DOPAC, in de urine. Ook onderzoeken we nieuwe mogelijkheden voor het mechanisme van de adsorptie-proces. De methode geeft bevredigende extractie-efficiëntie en selectiviteit voor de vijf analyten, en de methode werd gecontroleerd in de analyse van de urine van risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles.

<table><tbody><tr><td>200 &micro;L pipette tip</td><td></td><td></td><td>kolom om nanovezels te bevatten</td></tr><tr><td>PCE-PS nanovezels</td><td></td><td></td><td>materiaal voor PFSPE-extractie</td></tr><tr><td>staafstaal (ongeveer 0,5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>vul de nanovezels in de kolom</td></tr><tr><td>gasdichte plastic spuit (5 ml)</td><td></td><td></td><td>comprimeer oplossing in het uiteinde van de punt</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>difenylborinezuur 2-aminoethylester(DPBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>complex reagens</td></tr><tr><td>norepinephrine(NE)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>analyt</td></tr><tr><td>3-Methoxy-4-hydroxyfenylglycol(MHPG)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>analyt</td></tr><tr><td>epinephrine(E)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>analyt</td></tr><tr><td>3, 4-Dihydroxyfenylacetaatzuur(DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>analyt</td></tr><tr><td>dopamine(DA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H-8502</td><td>analyt</td></tr><tr><td>3, 4-dihydroxybenzylaminehydrobromide(DHBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>binnenlabel</td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>eluans en mobiele fase</td></tr><tr><td>fosforzuur</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7664-38-2</td><td>eluans</td></tr><tr><td>urinezuur</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>69-93-2</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>creatinine</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>60-27-5</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>trinatriumcitraat</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>6132-04-3</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>12125-02-9</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>SWC0140326</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>62-76-0</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7757-82-6</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>dinatriumwaterstoffosfaat</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10039-32-4</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>ureum</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>57-13-6</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-14-5</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10034-99-8</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10035-04-8</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>kunstmatige urine</td></tr><tr><td>citroenzuur</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>77-92-9</td><td>kunstmatige urine en mobiele fase</td></tr><tr><td>EDTA dinatriumzout</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>34124-14-6</td><td>mobiele fase</td></tr><tr><td>monometallisch natriumorthofosfaat</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7558-80-7</td><td>kunstmatige urine en mobiele fase</td></tr><tr><td>1-heptaansulfonzuurnatriumzout</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>22767-50-6</td><td>mobiele fase</td></tr><tr><td>natriumhydroxide</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>1310-73-2</td><td>mobiele fase</td></tr><tr><td>fenylboorzuurkolom(PBA-kolom)</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>PBA-extractie</td></tr><tr><td>Inertsil&reg; ODS-3 5 &micro;m 4,6&times;150 mm kolom</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>HPLC-kolom voor scheiding</td></tr><tr><td>SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER</td><td>Shimadzu Corporation, Japan</td><td>SIL-20AC</td><td>auto-injectie voor eluans</td></tr><tr><td>SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography</td><td>Shimadzu Corporation, Japan</td><td>LC-20AD</td><td>HPLC-pomp</td></tr><tr><td>SHIMADZU L-ECD-60A elektrochemische detector</td><td>Shimadzu Corporation, Japan</td><td>L-ECD-60A</td><td>detector voor de analyten</td></tr><tr><td>ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System</td><td>Micromeritics, USA</td><td></td><td>oppervlakte- en porositeitsanalyzer&nbsp;</td></tr></tbody></table>

een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie catecholamine neurotransmitters en hun metabolieten

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

De extractie en analyse van catecholamine neurotransmitters in biologische vloeistoffen is van groot belang bij de beoordeling van de functie van het zenuwstelsel en de verwante ziekten, maar hun nauwkeurige meting is nog steeds een uitdaging. Vele protocollen zijn beschreven voor de meting van de neurotransmitter door een scala aan instrumenten, met inbegrip van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC). Echter, er zijn tekortkomingen, zoals gecompliceerde operatie of hard-to-detect meerdere doelen, die niet kunnen worden voorkomen, en op dit moment de dominante analysetechniek is nog steeds HPLC gekoppeld aan gevoelige elektrochemische of fluorimetrische detectie, wijten aan de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Hier, wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de voorbehandeling en de opsporing van catecholamines met hogedruk-vloeistofchromatografie met elektrochemische detection (HPLC-ECD) in echte urine monsters van zuigelingen, met behulp van samengestelde nanofibers electrospun samengesteld van polymere kroon ether met polystyreen als adsorberende, ook bekend als de methode verpakt-vezel vaste fase extractie (PFSPE). We laten zien hoe urine monsters kunnen gemakkelijk worden precleaned door een nanofiber boordevol solid phase-kolom, en hoe de analyten in de steekproef kan snel worden verrijkt, gedesorbeerde, en ontdekt op een ECD-systeem. PFSPE vereenvoudigt de voorbehandeling procedures voor biologische monsters, waardoor minder tijd, kosten, en vermindering van het verlies van doelen.
Globaal, dit werk illustreert een eenvoudige en handige protocol voor solid-phase extraction gekoppeld aan een systeem van HPLC-ECD voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters (epinefrine (E), noradrenaline (NE), dopamine (DA)) en twee van hun metabolieten (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) en 3,4-dihydroxy-Fenylazijnzuur (DOPAC)) in urine van zuigelingen. De gangbaar protocol werd toegepast voor de beoordeling van de verschillen van urine catecholamines en hun metabolieten tussen risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles. Vergelijkende analyse bleek een significant verschil in urine MHPG tussen de twee groepen, waaruit blijkt dat de catecholamine metabolieten mogelijk een belangrijke kandidaat-marker voor vroegtijdige diagnose van gevallen in gevaar voor schade aan de hersenen bij zuigelingen.

Dit protocol is een eenvoudige en handige PFSPE-methode om de voorbehandeling van de monsters van de urine en verrijken van vijf catecholamines voor detectie via een HPLC-ECD-systeem; een diagram van het proces is afgebeeld in Figuur 1. Het protocol bevat voornamelijk vier stappen-activeren, laden, spoelen, en eluerende - in combinatie met een kleine hoeveelheid van de PCE-PS nanofibers en een eenvoudige solid-fase extractie-apparaat. De morfologie van de PCE...

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Het algemene doel van deze procedure is om drie monoamine neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen gelijktijdig te bepalen via een eenvoudige vaste-fase-extractie gekoppeld aan hoogdrukunvloeistofchromatografie met elektrochemische detectie. Deze methode kan onstabiele doelverbindingen in een volledig monster voorspellen en bepalen met eenvoudige bediening in een korte tijd. Uw voorbeelden kunnen eenvoudig voorgereinigd worden door een nauwe vezel gevulde vaste-fase quorum, en de analyten in het monster kunnen gemakkelijk worden verrijkt, opgelost en gedetecteerd op een elektrochemisch-detectiesysteem.We kwamen eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat extractie en analyse van catecholamine neurotransmitters in biologische vloeistoffen cruciaal is bij het beoordelen van de weerstandsfunctie en de bijbehorende ziekten. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen omdat blootstelling aan licht moet worden vermeden, en de prebehandelingstijd zo kort mogelijk moet zijn. Bij het demonstreren van de procedure hebben we Lanlan Wei en Qing Han, twee promovendi uit ons laboratorium.Om te beginnen, bereidt u een stockoplos

a-convenient-method-for-extraction-analysis-with-high-pressure-liquid

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Een protocol voor het gebruik van reactieflow hoogprestatievloeistofchromatografie kolommen voor methoden die post-kolom derivatisatie (PCD) toepassen, wordt gepresenteerd.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Een methode voor het soort identificatie van botanische materiaal door directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie en multivariate statistische analyse wordt gepresenteerd.

Rapid High-throughput Species Identificatie van Botanical Material gebruik van Direct Analysis in Real Time met hoge resolutie massaspectrometrie

Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

We presenteren een methode voor snelle massaspectrometrie (MS)/massaspectrometrie (MS)-gebaseerde annotatie en classificatie van tropaanalkaloïden, nuttig voor zowel voorlopige dereplicatie van tropane-bevattende monsters als de ontdekking van nieuwe alkaloïden voor isolatie.

Toepassingen van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie in onderzoek naar natuurlijke producten: tropaanalkaloïden als casestudy

Leer een betrouwbare methode voor de extractie en analyse van catecholamine-neurotransmitters en hun metabolieten in urine van zuigelingen met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten (Video) | JoVE Journal

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Meer video's verkennen