Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

Het algemene doel van deze methode is om de lokalisatie en verdeling van cardiale stamcellen kwantitatief te beoordelen tijdens de organogene van het hart. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van hartontwikkeling door ons in staat te stellen de lokalisatie van cardiale voorlopercellen te observeren tijdens normale embryonale ontwikkeling. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de volumetrische beelden kwantitatieve informatie kunnen opleveren over de dynamiek op weefselniveau en dat de analysepijplijn kan worden geautomatiseerd voor betere reproduceerbaarheid.

Hoewel deze methode informatie biedt over vroege cardiale organogene, kan deze ook worden toegepast op het algemene onderzoek naar vroege embryogenese of op de morfogenese van andere organen van belang. Op de ochtend van de achtste embryonale dag, desinfecteer de buik van de zwangere muis met 70%ethanol en maak een buiksnede door zowel de huid als de buikwand. Begin boven één eileider, verwijder voorzichtig het vet langs de zijkant van de baarmoeder tot aan de baarmoederhals.

Maak een incisie door de baarmoederhals en ga door tot het bovenste uiteinde van de andere eileider en snijd om de hele baarmoeder vrij te maken. Was het overtollige bloed uit de baarmoeder in een 10 centimeter schaal met vers PBS en snijd het mesometrium tussen elke deciduoom. Breng de embryo's over naar een zes centimeter schaal met vers PBS onder een dissectiemicroscoop en gebruik een fijne tang om het baarmoervlies van het deciduoomweefsel te verwijderen.

Snijd vervolgens voorzichtig de punt van de embryonale helft van het deciduoom om de embryo's zichtbaar te maken, knijp het deciduoom om voorzichtig de eerste embryo eruit te duwen en te trekken. Verwijder zoveel mogelijk extra embryonaal weefsel zonder de morfologie van het dier te beschadigen en gebruik een transferpijp om het embryo in een buisje van 1,5 milliliter met vers PBS op ijs te plaatsen. Wanneer alle embryo's zijn geoogst, zuig het PBS uit elke buis en spoel de embryo's met vers PBS.

Nadat het PBS grondig uit elke buis is gezuigd, fixeer de embryo's in 4% paraformaldehyde gedurende één uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten met vers PBS, en bewaar de embryo's vervolgens bij vier graden Celsius. Begin met het vervangen van het PBS door één milliliter blokkeerbuffer voor een vier uur durende incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, vervang de blokkeerbuffer door het juiste primaire antilichaammengsel en verdunde blokkeerbuffer voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend, zuig het overtollige antilichaam en was de embryo's drie keer gedurende één uur per wasbeurt in 0,1% Triton in PBS. Voeg na de derde wasbeurt het juiste secundaire antilichaammengsel toe aan de embryo's voor een drie uur durende incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten zoals net is gedemonstreerd. Vervolgens kleed de embryo's contra af met DAPI in PBS gedurende 10 minuten gevolgd door twee wasbeurten van vijf minuten, en suspendeer de embryo's vervolgens langzaam in anti-fade montage medium waardoor de embryo's ten minste één uur kunnen gelijkwaardig worden met periodieke zachte flikkeringen om de monsters in de oplossing te helpen vallen.

Voordat de embryo's worden gemonteerd, maak twee parallelle stapels van vijf tot zes lagen dubbelzijdig plakband met een afstand van 15 tot 20 millimeter op één microscoopglaasje per embryo en plaats een druppel van 15 microliter anti-fade medium op elke glasplaat tussen de plakbandstapels. Breng voorzichtig één embryo in elke druppel over en gebruik een dissectiemicroscoop en fijne pincet om de embryo's te positioneren met hun voorkant weg van de glasplaat en met hun lichaamsas in lijn met de lange as van de glasplaten. Om de dekglasjes te plaatsen, laat eerst één zijde van het glas rusten op één stapel dubbelzijdig plakband en gebruik pincet om het dekglas voorzichtig te laten zakken tot het contact maakt met de andere plakbandstapel.

Het is bijzonder belangrijk om de embryo's zorgvuldig te positioneren en te monteren. Embryo's die niet correct zijn gepositioneerd, zullen veel moeilijker te beeldvormen zijn en kunnen extra verwerking vereisen om goede kwantificeerbare gegevens te verkrijgen. Gebruik een pipette om extra anti-fade medium toe te voegen tussen de glasplaat en het dekglas om te voorkomen dat het monster uitdroogt tijdens het beeldvormen en selecteer het objectief met de hoogste beschikbare vergroting waarmee het hele cardiale halvemaangebied in één gezichtsveld kan worden vastgelegd.

Stel vervolgens de beeldvormingsparameters in met behulp van standaard beste beeldvormingspraktijken en gebruik Nyquist-bemonsteringssnelheden om de XYZ-voxelafmetingen van elk embryo te bepalen. Om de embryobeelden te analyseren, laad de ruwe beeldgegevenssets in de juiste beeldanalysesoftware en open het eerste bestand in de surpass-weergave. De gegevens worden in een 3D-weergave in de maximale intensiteitsprojectiemodus geladen.

Open het weergave-aanpassingsvenster en selecteer alleen het referentiekanaal. Pas de drempel van het beeld aan zoals nodig. Als de signaal-ruisverhouding te laag is voor segmentatie, pas dan de gamma aan.

Het volgen van de beste praktijken tijdens beeldacquisitie is cruciaal voor het verkrijgen van geschikte gegevens en zal afhangen van de specifieke microscoopopstelling die wordt gebruikt. Als aanpassingen aan de gamma nodig zijn, mogen deze afbeeldingen niet worden gebruikt voor het vergelijken van fluorescentie-intensiteiten. Gebruik het oppervlaktealgoritme dialoogvenster om een nieuw oppervlak voor het referentiekanaal te maken en vink het vakje aan voor alleen de oorsprong van interesse in het segment.

Pas de omgrenzingsbox regio aan zodat deze het gebied van interesse bevat zoals begrensd door de referentiekleurstof en selecteer het referentiekanaal uit het dropdown menu van de bronkanaal. Stel de gladheid in op de helft van de Z-voxelgrootte en gebruik de drempelregelaars om de ondergrens aan te passen naar de absolute intensiteit om ervoor te zorgen dat het oppervlak niet