Invasie-assay met behulp van 3D-matrices

Wetenschappers hebben 3D-modellen ontwikkeld om celinvaisie- en migratieprocessen nauwkeuriger te bestuderen. Terwijl de meeste traditionele celkweeksystemen 2D zijn, bestaan cellen in onze weefsels in een 3D-netwerk van moleculen dat bekend staat als de extracellulaire matrix of ECM. Hoewel veel van de mechanistische processen die nodig zijn voor celmobiliteit in 2D en 3D vergelijkbaar zijn, presenteren factoren zoals de verminderde stijfheid van ECM in vergelijking met plastic oppervlakken, de toevoeging van een derde dimensie voor migratie en de fysieke belemmering van bewegen door het gaas van lange polymeren in de ECM, allemaal verschillende uitdagingen voor de cel in vergelijking met tweedimensionale migratie.

Deze video introduceert kort de basisfunctie en structuur van de ECM, evenals de mechanismen waarmee cellen erdoorheen moduleren en migreren. Vervolgens bespreken we een algemeen protocol dat wordt gebruikt om endotheelcel-invaisie te bestuderen. Ten slotte belichten we verschillende toepassingen van 3D-matrices om verschillende biologische vragen te bestuderen.

Laten we beginnen met het onderzoeken van de samenstelling van de ECM en hoe cellen ermee interageren.

De ECM vervult vele functies, zoals het bieden van ondersteuning voor cellen, het faciliteren van intercellulaire communicatie en het scheiden van weefsels. De samenstelling van ECM varieert tussen verschillende weefsels en heeft verschillende biologische eigenschappen, maar kan worden ingedeeld in twee brede typen. Het basaal membraan dient om weefsels te verankeren en te scheiden, terwijl het interstitiële matrix de cellen binnen een weefsel omringt en ondersteunt. Het interstitiële matrix bestaat meestal uit het vezelige eiwit collageen, maar omvat ook elastine en fibronectine.

Er zijn verschillende biologische processen nodig voor cellen om door de ECM te migreren. De eerste is cel-matrix-adhesie, die betrokken is bij transmembraaneiwitten die integrinen worden genoemd. Deze verbinden de ECM met het interne skelet van de cel, bekend als het cytoskelet.

Een ander proces is de structurele herschikking van het cytoskelet van de cel. Dit leidt tot de vorming van gespecialiseerde structuren genaamd invadopodia, die uitsteeksels van de cel in zijn omringende matrix zijn. De laatste stap is ECM-modulatie. Dit omvat doorgaans afbrekende moleculen die matrixmetalloproteasen of MMP's worden genoemd, die zich ophopen in de invadopodia en de omringende ECM afbreken, waardoor celaantasting wordt vergemakkelijkt. 3D-matrix-invaisie-assays stellen wetenschappers in staat om dit complexe proces te visualiseren en te bestuderen.

Nu u vertrouwd bent met ECM en de interactie ervan met cellen, laten we een protocol doorlopen voor het bestuderen van ECM-invaisie door endotheelcellen om tubuli te vormen. Door endotheelcellen in een 3D-omgeving te kweken, kan men het biologische proces van bloedvatgroei simuleren, ook wel aangeduid als angiogenese, wat belangrijk is tijdens zowel normale ontwikkeling als kanker.

Eerst worden endotheelcellen gekweekt, en een enkele celsuspensie wordt bereid door de cellen te behandelen met proteasen zoals trypsine en ze door een gaasfilter te laten gaan om celklonters te breken. De 3D-matrix, meestal samengesteld uit collageen, fibrine, laminine of meer complexe combinaties van deze componenten - die ofwel in het laboratorium kunnen worden bereid of van commerciële leveranciers kunnen worden besteld - wordt vervolgens op ijs ontdooid. Aangezien de meeste ECM-preparaten bij hogere temperaturen polymeriseren, is het handig om ook andere apparatuur en reagentia koud te houden. De celsuspensie wordt gemengd met de ontdooid matrixoplossing om cellen in te bedden, en deze mix wordt in een celkweekincubator geplaatst waar de hogere temperatuur ervoor zorgt dat de matrix polymeriseert.

Eenmaal de matrix met cellen is ingesteld, wordt kweekmedium dat angiogeen factoren bevat, toegevoegd aan de matrixschaal. Met behulp van time-lapse microscopiesoftware kunnen individuele cellen worden gevolgd om hun migratie door de matrix te observeren. De resulterende beelden worden geanalyseerd en cellenposities worden gebruikt om de bewegingsrichting en -afstand in micrometer te berekenen. Deze waarden kunnen vervolgens worden uitgezet om de locomotieve activiteit te bepalen - de gemiddelde migratiesnelheid van de cellen. Ten slotte wordt de vorming van buisnetwerken waargenomen en geanalyseerd met behulp van visualisatiesoftware om kenmerken zoals knooppunten, buizen en lussen te identificeren.

Laten we nu een paar toepassingen van 3D-matrices in specifieke experimenten verkennen.

Celmigratie wordt gemedieerd door actieve modulatie van het cellulaire cytoskelet. In dit experiment werden collageenmatrices bereid en gemengd met een kleurstof die rood fluorescerend eiwit bevat om visualisatie mogelijk te maken. Individuele celsferoïden, die vrij zwevende celklompjes zijn, werden geïsoleerd en ingebed in de collageenmatrix. Na incubatie werden de ingebedde cellen gekleurd voor specifieke cytoskeletcomponenten en geïmagerd door middel van fluorescentiemicroscopie. Onderzoekers observeerden cytoskeletcomponenten en hun veranderingen terwijl cellen door de ECM migreerden.

Wetenschappers kunnen ook bestuderen hoe de eigenschappen van de ECM de migratie beïnvloeden. Met behulp van een concentrisch gelsysteem, waarbij cellen zijn ingebed in een binnenste gelmatrix omringd door buitenste matrices met verschillende concentraties, kunnen wetenschappers cellen volgen met behulp van time-lapse microscopie om hun migratie van de binnenste gel naar de aanvankelijk celvrije buitenste gel te bestuderen. Onderzoekers observeerden dat de grotere stijfheid van gels met hogere concentraties resulteerde in toenames in zowel celverplaatsing als de totale afstand van celmigratie.

Ten slotte kunnen matrix-invaisie-assays worden uitgevoerd in een levend dier om angiogenese in een orgaanspecifiek context te bestuderen. Hier werden fibrinegels - die vaak worden gebruikt in weefselengineering vanwege hun biologisch afbreekbare aard - gegenereerd, gevolgd door implantatie in muizenlongen waar de gels op hun plaats werden gehouden door een 'lijm' gemaakt van het eiwit fibrinogeen. Celmigratie en vorming van nieuwe bloedvaten werd gedurende de volgende 7 tot 30 dagen toegestaan, waarna de longen en fibrinegels werden geoogst, gefixeerd en gesneden. Beeldvorming van deze secties