Name: Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer de dot-assay om de migratie van cohesieve celbladen te analyseren in reactie op micro-omgevingsfactoren. Deze methode biedt reproduceerbare resultaten voor kankeronderzoek naar celmotiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, en Carole Parent bedanken voor het lezen en commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health.

1. coating van gerechten (dag 1)
Opmerking: Zorg ervoor dat u niet laat vingerafdrukken of vuil op de bodem van de plaat bij het verwerken van het.
<ol><li>Muis collageen IV op ijs ontdooien en Verdun het met 50 mM HCl (pH 1.3) ter voorbereiding van 3 mL van een 10 µg/mL collageen IV oplossing. Opmerking: Collageen neerslaat bij 37 ° C. Het is daarom belangrijk om de collageen-oplossing bij een lage temperatuur tijdens het ontdooien en het werken met het. Herhaalde bevriezen-ontdooien cycli door de voorbereiding van gepaste afmetingen aliquots voorkomen en op te slaan bij-80 ° C.</li>
	<li>250 µL collageen IV oplossing toevoegen aan elk putje van 12-well glazen bodem platen en plaats hen in een gepaste afmetingen, strakke-sluiting plastic doos. Plaats van natte papieren handdoek over en rondom de platen voor de vervaardiging van een vochtige kamer en sluit het. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur. Opmerking: Als u alleen het groeigebied moet worden bekleed, volstaat alleen betrekking hebben op de cover slip, die is aan de onderkant van de plaat, met collageen oplossing gehecht (Zie Figuur 1A, B voor een schematische voorstelling van de plaat).</li>
	<li>Volgende ochtend, spoel platen met gedeïoniseerd H2O tweemaal te verwijderen niet-geabsorbeerd collageen en buffer. Direct het water tot aan de rand van de plaat goed, niet op de rand gevormd door de onderkant van de plaat en het dekglaasje aan (als water is afgepipetteerde in dit gebied die het zal splash). Het drogen van de platen in de laminaire flow kap. Platen onmiddellijk gebruik of bewaren bij 4 ° C voor maximaal 5 dagen. Opmerking: Verschillende cellijnen kunnen vereisen verschillende coating, zoals fibronectine of collageen ik.</li>
</ol>2. plating de Dot Assay (dag 2)
<ol><li>
Voorbereiding van de celsuspensie
	<ol>
<li>Cellen die zijn geteeld in een schotel van 60 mm weefselkweek in DMEM/F12 medium aangevuld met 5% paard serum tot 80% samenkomst om te bereiden celsuspensie, gebruiken</li>
		<li>Spoel de cellen met de calcium - en magnesium-free Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) eens, voeg 500 µL trypsine-EDTA (kamertemperatuur) en Incubeer de cellen gedurende 3-5 min. in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer.</li>
		<li>Opschorten van de vrijstaande cellen in 4.5 mL gestolde voedingsbodem om te stoppen trypsine-activiteit en een 20 tellen µL aliquoot gedeelte van de celsuspensie in een hemocytometer.</li>
		<li>De resterende cellen in een conische tube van 15 mL pellet door centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in een kweekvloeistof tot 3 x 106 cellen/mL. Opmerking: Om andere coating substraten en/of cellijnen, de optimale celdichtheid moet worden ingesteld in een verdunningsreeks. 3 x 106 cellen/mL wordt aanbevolen als uitgangspunt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beplating cellen
	<ol>
<li>Plaats een druppel 10 µL celsuspensie in het midden van elke slip van de cover van de collageen IV gecoat glas 12-well bodemplaat zonder aanraken of krabben van de coating (Figuur 1A, B). Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C, bevochtigde sfeer, om de cellen te koppelen. Controleer in een omgekeerde Microscoop of de cellen zijn aangesloten. Opmerking: Dit kan worden best gezien aan de rand van de daling, waar vorming van een enkelgelaagde kan worden waargenomen (Figuur 1C). Indien nodig, incubeer tot de plaat 3 h. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de broedstoof hoog genoeg is, zoals de druppels snel kunnen uitdrogen. Als een vermindering van het volume daling tijdens deze stap wordt waargenomen, PBS aan de ruimten tussen de putten te verhogen van de vochtigheid toevoegen.</li>
		<li>Zachtjes was de putjes met 1 mL gestolde voedingsbodem tweemaal te verwijderen van de niet-ingeschrevenen cellen. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem toe aan elk putje. Controleer in een omgekeerde Microscoop of geen zwevende cellen blijven, anders was de putjes goed weer. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer, verkrijgen van welomschreven cel bladen. Opmerking: De zwevende cellen zijn waarschijnlijk opnieuw koppelen aan de plaat en ongewenste cel kolonies vormen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. stimuleren van de cellen (dag 3)
<ol><li>Controleer alle putjes met behulp van een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat cel kolonies zijn behoorlijk gegroeid. Indien nodig, mark ongeschikt wells en kan ze niet gebruiken.</li>
	<li>Label elk putje van de plaat op de juiste wijze voor elke voorwaarde onderzocht. Elke voorwaarde in dubbele of drievoud uitgevoerd.</li>
	<li>Wijzigen van het medium om te verhongeren de cellen in de DMEM/F12 met 0,1% paard serum (hongerende medium) 3 h voordat cellen worden gestimuleerd.</li>
	<li>Stimuleren van de cellen door toevoeging van EFG (5 ng/mL eindconcentratie) of andere gewenste bemiddelaars/mediators en meng voorzichtig het medium gebruik van een micropipettor van 1 mL of door zwenken van de plaat.</li>
	<li>Incubeer de plaat voor 1-4 dagen te observeren van verplaatsing van de rand en rand contour zoals beschreven in punt 4.1 of time-lapse imaging uit te voeren zoals beschreven in paragraaf 4.2.</li>
</ol>4. visualisatie van kolonies van de cel en de cel migratie
<ol><li>
De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring voor het meten van de groei van de kolonie (dag 4-7)
	<ol>
<li>Fix cellen in 70% ethanol (1 mL/putje) voor ~ 2 min.</li>
		<li>Vlek kernen met haematoxyline (1 mL/putje), ~ 2 min.</li>
		<li>Wassen cellen met leidingwater (1 mL/putje) tot kernen zijn blauw, 5-10 min.</li>
		<li>Vlek cytoplasma met eosine (1 mL/putje), ~ 2 min.</li>
		<li>Spoel af met gedeïoniseerd water (1 mL/putje). Opmerking: De haematoxyline en eosine oplossingen kunnen worden verzameld en gebruikt meerdere malen totdat de kleuring wordt vaag.</li>
		<li>Luchtdroog plaat.</li>
		<li>Draai de plaat en de dot-diameter meten met een liniaal. Als alternatief, neem foto's van de plaat met een camera, en analyseren van de diameter van de dot in ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-lapse microscopie (dag 3)
	<ol>
<li>De incubator Microscoop inschakelen en aanpassen van de temperatuur tot 37 ° C. Vul de luchtbevochtiger met dH2O. verkleinen/vergroten de CO2 tot 5%. Zorg ervoor dat de zaal incubator is bevochtigde en dat de gemotoriseerde fase zich vrij kan bewegen. Sluit de incubator kamer en laat de Microscoop te passen tot 37 ° C. Opmerking: De Microscoop (Zie de tabel van materialen) gebruikt hier moet worden verwarmd tot 37 ° C gedurende ten minste 3 uur, voordat de cellen zijn beeld om te voorkomen dat het drijven van de focus.</li>
		<li>Plaats de plaat in het werkgebied van de incubator Microscoop en instellen van de fase-lijst. Afbeelding twee tegengestelde randen en het centrum van elke cel stip(Figuur 1).</li>
		<li>Neem beelden elke 3 minuten, voor 15-24 h met gebruikmaking van de 10 X doelstelling. Downloaden van de gegevens en ga verder met beeldanalyse in een programma van keuze, bijvoorbeeldImageJ of Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).</li>
<li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li>
<li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li>
<li>Bazellières, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).</li>
<li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li>
<li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2C+HGF%2C+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501(2013).</li>
<li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li>
<li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li>
<li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2057-1739/2/2/025001/meta">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).</li>
<li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li>
<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Tijdens de progressie van de tumorcellen migreren uit de buurt van het weefsel van oorsprong metastaseren naar verre locaties15te vallen van het omringende weefsel. Migratie van cellen uit de buurt van de kolonie van een cel kan worden waargenomen in de dot-bepaling. Hier, wordt de stip bepaling geïllustreerd door het analyseren van de trekkende fenotype van menselijke borstkankercellen in reactie op EGF.
Nauwkeurige en repliceerbaar om resultaten te verkrijgen verschil...

Migratie testen worden veel gebruikt om te evalueren van de invasieve en gemetastaseerde potentieel van tumor cellen in vitro. Meestal, wordt de wond of kras assay gebruikt ter beoordeling van de migratie van epitheliale bladen in een cel gewist gebied1,2,3. Voor het uitvoeren van de kras assay, cellen zijn vergulde in een enkelgelaagde en een "scratch" of cel-vrije zone wordt gemaakt met een pipet tip. De kras assay is gemakkelijk aan opstelling met algemeen beschikbare weefselkweek leveringen en multi goed platen, waardoor voor de verwerking van meerdere monsters kan worden uitgevoerd. Echter, zoals de kras is gemaakt, cellen zijn fysiek verwijderd uit de enkelgelaagde en vaak ondergaan celdood. Extracellulaire matrix gekoppeld aan de plaat is bovendien vaak beschadigd tijdens het krassen. Ook het gebruik van silicium wordt ingevoegd (zoals Ibidi kamers4) of van stencils5,6,7 kan leiden tot mechanische verstoring van de cellen en de gedeeltelijke opheffing van matrix eiwitten gebruikt voor coating de platen. Een ander nadeel van tests toezicht op sluiting van wonden of krassen is hun beperkte tijdsverloop, zoals cel migratie kan alleen worden geanalyseerd totdat de kras is gesloten.
Bij het uitvoeren van de bepaling van de stip, zijn cellen vergulde als een circulaire kolonie op een bekleed of niet gestreken plaat8. De reden voor deze beplating strategie is het verkrijgen van cel bladen met gedefinieerde randen, die kunnen migreren of binnenvallen in de omliggende gebieden met cel-vrij zonder verstoring van de cultuur door verwijdering van cellen of inzetstukken. Het algemene doel van de bepaling van de dot is te observeren van de migratie van cel bladen zoals gemeten door de verplaatsing van de rand of kolonie diameter, alsmede uitvoeren time-lapse imaging voor het analyseren van de trekkende fenotype van cellen in een hogere spatio-temporele resolutie.
Cel migratie kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van microenvironmental signalen zoals chemokines, cytokines en groeifactoren zoals EGF. EFG is een groeifactor dat oefent haar biologische effecten via binding aan de receptor, EGF receptor9, en verhoogt de invasieve en metastatische gedrag van de tumor cellen4,9,10. Hier, de stip-test wordt gebruikt om te studeren EGF gestimuleerd cel migratie in een menselijke invasieve, Long kolonievormende borst kanker cel lijn (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>MCF10CA1a cellen</td><td>Karmanos Research Institute</td><td>N/A</td><td>cellen gebruikt voor het testen</td></tr><tr><td>muis collageen IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>gebruikt om platen te coaten</td></tr><tr><td>trypsine / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>gebruikt om cellen van weefselcultuurplaten te verwijderen</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>gebruikt om cellen te wassen</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>gebruikt als kweekmedium</td></tr><tr><td>paardenserum</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>gebruikt om kweekmedium aan te vullen</td></tr><tr><td>12 wel glazen bodemplaat</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>gebruikt om cellen voor beeldvorming te laten groeien</td></tr><tr><td>EGF (epidermale groeifactor, humaan recombinant)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>gebruikt om cellen te stimuleren</td></tr><tr><td>vetzuurvrije BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>gebruikt om buffer voor EGF te maken</td></tr><tr><td>hematoxyline</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>gebruikt om kolonies te kleuren</td></tr><tr><td>eosine</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26051-10</td><td>gebruikt om kolonies te kleuren</td></tr><tr><td>37 &#176;C, 5% CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>model MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver met incubatorkamer en gemotoriseerde standaard</td><td>Zeiss</td><td>model Axio Observer.Z1</td><td>gebruikt voor time lapse beeldvorming</td></tr><tr><td>ORCA Flash LT sCMOS camera</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>gebruikt voor timelapse beeldvorming in combinatie met Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>software gebruikt voor time lapse beeldvorming</td></tr><tr><td>inversie microscoop</td><td>Olympus</td><td>model IX70</td><td>gebruikt om cellen te tellen en om kolonies in weefselkweek te controleren</td></tr><tr><td>kunststof doos</td><td>Lock&amp;Lock</td><td>N/A</td><td>gebruikt als vochtige kamer (elke kunststof doos met strakke sluiting die past bij de platen kan worden gebruikt)</td></tr></tbody></table>

met behulp van de dot-assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Hoewel er complexe organismen verschijnen statische, zijn hun weefsels onder een continue omzet. Als cellen leeftijd, verplaatsen sterven, en zijn vervangen door nieuwe cellen, cellen binnen weefsels in een strak georkestreerde wijze. Tijdens de ontwikkeling van de tumor, dit evenwicht wordt verstoord, en tumorcellen laat het epithelium van oorsprong te vallen van de lokale communicatie, te reizen naar verre locaties, en uiteindelijk gemetastaseerde tumoren op verre locaties. De stip-bepaling is een eenvoudige, tweedimensionale onbeperkte migratie assay, te beoordelen van de netto verkeer van cel bladen in een cel-vrije zone, en te analyseren parameters van cel migratie met behulp van time-lapse imaging. Hier, de bepaling van de dot is aangetoond door middel van een mens invasieve, Long kolonievormende borst kanker cellijn, MCF10CA1a, voor het analyseren van de cellen trekkende reactie op epidermale groeifactor (EGF), waarvan bekend is dat het kwaadaardig potentieel van borstkankercellen vergroten en de trekkende fenotype van cellen wijzigen.

De bepaling van de dot (Figuur 1) hier gepresenteerd werd uitgevoerd met behulp van invasieve, Long kolonievormende borstkankercellen (MCF10CA1a) als een modelsysteem. De stip-assay levert zeer reproduceerbaar cel stippen zelfs in de hand van beginners, waardoor het een handig en eenvoudig worden gerealiseerd assay (Figuur 1D). De stip-bepaling in combinatie met hij kleuring, of time-lapse imaging en latere parti...

Cel migratie is essentieel voor de ontwikkeling, weefsel onderhoud en reparatie en tumorvorming en wordt gereguleerd door groeifactoren, chemokines en cytokinen. Dit protocol beschrijft de stip assay, een twee-dimensionale, onbeperkte migratie test om te beoordelen van de trekkende fenotype van geschakelde, samenhangende cel bladen in reactie op microenvironmental signalen.

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Het algemene doel van de dot-assay is om het migratoire fenotype van gehechte, cohesieve cellagen te beoordelen als reactie op micro-omgevingssignalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het kankeronderzoek, zoals hoe cytokinen of groeifactoren de mobiliteit van tumorcellen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van de dot-assay is dat deze eenvoudig uit te voeren is en reproduceerbare resultaten oplevert.Hoewel deze methode inzicht kan geven in celmobiliteit, leent het zich ook voor een reeks vervolgonderzoeken, zoals het kleuren van cellen om de groeikoloniemorfologie en celverspreiding te beoordelen, immunokleuring, eiwit- en DNA- of RNA-analyse, of het injecteren van cellen in dieren. Om te beginnen, ontdooi muizencollageen vier op ijs en verdun het met 50 micromolars HCL om drie milliliter van een oplossing van 10 microgram per milliliter collageen vier te bereiden. Voeg 250 microliter collageen vier oplossing toe aan de putjes van 12-puts glazen bodemplaatjes en plaats ze in een geschikte, goed afsluitbare plastic doos.Plaats een natte papieren handdoek over en rond de platen om een vochtige kamer te maken en sluit de doos. Daarna incubeer de platen een nacht bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, om niet-geabsorbeerd collageen en buffer te verplaatsen, gebruik gedeïoniseerd water om de platen twee keer te spoelen, waarbij het water naar de rand van het putje wordt geleid, in plaats van de rand gevormd door de onderkant en de dekglas.Laat de platen aan de lucht drogen in een laminaire stromingskast en gebruik ze onmiddellijk of bewaar ze maximaal vijf dagen op vier graden Celsius. Om een celsuspensie te bereiden, gebruik cellen die zijn gekweekt in een 60 millimeter weefselkweekbakje in DMEMF12 medium, aangevuld met 5% paardenserum tot 80%confluence. Gebruik calcium- en magnesiumvrij DPBS om de cellen eenmaal te spoelen, voeg vervolgens 500 microliter kamertemperatuur trypsine EDTA toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in 5%CO2 in een bevochtigde atmosfeer gedurende drie tot vijf minuten.Suspendeer de losgemaakte cellen in 4,5 milliliter kweekmedium om de trypsine-activiteit te stoppen en gebruik een hemocytometer om een aliquot van 20 microliter van de celsuspensie te tellen. Trek de resterende cellen in een 50 milliliter conische buis door centrifugatie bij 200 keer de zwaartekracht gedurende drie minuten. Zuig vervolgens het supernatant af en resuspendeer de cellen in kweekmedium tot drie keer 10 tot de zes cellen per milliliter.Om de cellen in het midden van elke dekglas van de met collageen vier gecoate 12-puts glazen bodemplaat te plateren, plaats een druppel van 10 microliter celsuspensie, zorg ervoor dat de coating niet wordt geraakt of bekrast. Platering van een niet-cirkelvormige druppel zal geen cirkelvormige celplaat opleveren, en als de coating wordt geraakt of bekrast, zal dit de cellen ervan weerhouden goed te hechten. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer gedurende 30 minuten om de cellen te laten hechten.Controleer vervolgens op hechting onder een omgekeerde microscoop. Was de putjes voorzichtig twee keer met één milliliter kweekmedium om niet-gehechte cellen te verwijderen, voeg vervolgens één milliliter kweekmedium toe aan elke put. Controleer onder een omgekeerde microscoop dat er geen zwevende cellen aanwezig zijn, anders was de putjes opnieuw.Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius in 5%CO2 in een bevochtigde atmosfeer om goed gedefinieerde cellagen te verkrijgen. Gebruik een omgekeerde microscoop om alle putjes te controleren om er zeker van te zijn dat celkolonies goed zijn gegroeid. Markeer indien nodig ongeschikte putjes en gebruik ze niet.Label elk putje van de plaat op de juiste wijze voor elke onderzochte conditie. Voer elke conditie in duplicaat of triplicate uit. Ververs het medium om de cellen uit te hongeren in DMEMF12 met 0,1% paardenserum, drie uur voordat de cellen worden gestimuleerd.Stimuleer vervolgens de cellen door EGF of andere gewenste bemiddelaars toe te voegen. Gebruik een micropipet van één microliter of schudden de plaat voorzichtig om het medium te mengen. Incubeer de plaat gedurende één tot vier dagen om randverplaatsing en randcontour te observeren.Voer de H en E-kleuring uit door de cellen twee keer met PBS te wassen en ze ongeveer twee minuten te fixeren. Voeg hematoxine toe voor ongeveer twee minuten om de kernen te kleuren. Was de cellen met kraanwater gedurende vijf tot tien minuten, totdat de kernen blauw zijn.Kleur vervolgens het cytoplasma met eosina gedurende twee minuten voordat je de cellen met gedeïoniseerd water afspoelt. Laat de plaat aan de lucht drogen en draai hem vervolgens om en gebruik een liniaal om de diameter van de dot te meten. Ofwel, maak foto's van de plaat met een camera en gebruik ImageJ om de dot-diameter te analyseren.Voer tijdsverloopmicroscopie uit door de incubatormicroscoop aan te zetten en de temperatuur in te stellen op 37 graden Celsius. Vul de bevochtiger met DH2O en pas vervolgens de CO2 aan naar 5% Zorg ervoor dat de incubatorkamer is bevochtigd en dat de gemotoriseerde tafel vrij kan bewegen. Sluit vervolgens de incubatorkamer en laat de microscoop aanpassen aan 37 graden Celsius.Plaats de plaat op de tafel van de incubatormicroscoop en stel de tafellijst in, neem vervolgens twee tegenover elkaar liggende randen en het midden van elke celdot op. Gebruik een 10X objectief om elke drie minuten gedurende 15 tot 24 uur foto's te maken. Download de gegevens en ga verder met beeldanalyse in een programma naar keuze, zoals Matlab.Aanvankelijk onthulde fasecontrastbeeldvorming van celdoten dat invasieve, longkolonievorming van borstkankercellen een mesenchymal fenotype behouden na stimulatie met EGF. Er worden echter vaker enkele cellen waargenomen die het blad verlaten in EGF-gestimuleerde celdoten. De respons van longkolonievorming van borstkankercellen op

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Onderzoek naar vroege migratie van endotheelcellen (EEC) is belangrijk om de pathofysiologie van bepaalde ziekten te begrijpen en om mogelijk nieuwe strategieën voor therapeutische interventie te identificeren. Het volgende protocol beschrijft technieken om celmigratie te beoordelen die zijn aangepast voor het onderzoek van EEC.

Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Een protocol voor de kwantitatieve evaluatie van 3D-celmigratie binnen en in het grensvlak van granulaire hydrogels wordt hier gepresenteerd.

Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

Leer de dot-assay om de migratie van cohesieve celbladen te analyseren in reactie op micro-omgevingsfactoren. Deze methode biedt reproduceerbare resultaten voor kankeronderzoek naar celmotiliteit.

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Meer video's verkennen