Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Het algemene doel van de dot-assay is om het migratoire fenotype van gehechte, cohesieve cellagen te beoordelen als reactie op micro-omgevingssignalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het kankeronderzoek, zoals hoe cytokinen of groeifactoren de mobiliteit van tumorcellen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van de dot-assay is dat deze eenvoudig uit te voeren is en reproduceerbare resultaten oplevert.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in celmobiliteit, leent het zich ook voor een reeks vervolgonderzoeken, zoals het kleuren van cellen om de groeikoloniemorfologie en celverspreiding te beoordelen, immunokleuring, eiwit- en DNA- of RNA-analyse, of het injecteren van cellen in dieren. Om te beginnen, ontdooi muizencollageen vier op ijs en verdun het met 50 micromolars HCL om drie milliliter van een oplossing van 10 microgram per milliliter collageen vier te bereiden. Voeg 250 microliter collageen vier oplossing toe aan de putjes van 12-puts glazen bodemplaatjes en plaats ze in een geschikte, goed afsluitbare plastic doos.

Plaats een natte papieren handdoek over en rond de platen om een vochtige kamer te maken en sluit de doos. Daarna incubeer de platen een nacht bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, om niet-geabsorbeerd collageen en buffer te verplaatsen, gebruik gedeïoniseerd water om de platen twee keer te spoelen, waarbij het water naar de rand van het putje wordt geleid, in plaats van de rand gevormd door de onderkant en de dekglas.

Laat de platen aan de lucht drogen in een laminaire stromingskast en gebruik ze onmiddellijk of bewaar ze maximaal vijf dagen op vier graden Celsius. Om een celsuspensie te bereiden, gebruik cellen die zijn gekweekt in een 60 millimeter weefselkweekbakje in DMEMF12 medium, aangevuld met 5% paardenserum tot 80%confluence. Gebruik calcium- en magnesiumvrij DPBS om de cellen eenmaal te spoelen, voeg vervolgens 500 microliter kamertemperatuur trypsine EDTA toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in 5%CO2 in een bevochtigde atmosfeer gedurende drie tot vijf minuten.

Suspendeer de losgemaakte cellen in 4,5 milliliter kweekmedium om de trypsine-activiteit te stoppen en gebruik een hemocytometer om een aliquot van 20 microliter van de celsuspensie te tellen. Trek de resterende cellen in een 50 milliliter conische buis door centrifugatie bij 200 keer de zwaartekracht gedurende drie minuten. Zuig vervolgens het supernatant af en resuspendeer de cellen in kweekmedium tot drie keer 10 tot de zes cellen per milliliter.

Om de cellen in het midden van elke dekglas van de met collageen vier gecoate 12-puts glazen bodemplaat te plateren, plaats een druppel van 10 microliter celsuspensie, zorg ervoor dat de coating niet wordt geraakt of bekrast. Platering van een niet-cirkelvormige druppel zal geen cirkelvormige celplaat opleveren, en als de coating wordt geraakt of bekrast, zal dit de cellen ervan weerhouden goed te hechten. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer gedurende 30 minuten om de cellen te laten hechten.

Controleer vervolgens op hechting onder een omgekeerde microscoop. Was de putjes voorzichtig twee keer met één milliliter kweekmedium om niet-gehechte cellen te verwijderen, voeg vervolgens één milliliter kweekmedium toe aan elke put. Controleer onder een omgekeerde microscoop dat er geen zwevende cellen aanwezig zijn, anders was de putjes opnieuw.

Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius in 5%CO2 in een bevochtigde atmosfeer om goed gedefinieerde cellagen te verkrijgen. Gebruik een omgekeerde microscoop om alle putjes te controleren om er zeker van te zijn dat celkolonies goed zijn gegroeid. Markeer indien nodig ongeschikte putjes en gebruik ze niet.

Label elk putje van de plaat op de juiste wijze voor elke onderzochte conditie. Voer elke conditie in duplicaat of triplicate uit. Ververs het medium om de cellen uit te hongeren in DMEMF12 met 0,1% paardenserum, drie uur voordat de cellen worden gestimuleerd.

Stimuleer vervolgens de cellen door EGF of andere gewenste bemiddelaars toe te voegen. Gebruik een micropipet van één microliter of schudden de plaat voorzichtig om het medium te mengen. Incubeer de plaat gedurende één tot vier dagen om randverplaatsing en randcontour te observeren.

Voer de H en E-kleuring uit door de cellen twee keer met PBS te wassen en ze ongeveer twee minuten te fixeren. Voeg hematoxine toe voor ongeveer twee minuten om de kernen te kleuren. Was de cellen met kraanwater gedurende vijf tot tien minuten, totdat de kernen blauw zijn.

Kleur vervolgens het cytoplasma met eosina gedurende twee minuten voordat je de cellen met gedeïoniseerd water afspoelt. Laat de plaat aan de lucht drogen en draai hem vervolgens om en gebruik een liniaal om de diameter van de dot te meten. Ofwel, maak foto's van de plaat met een camera en gebruik ImageJ om de dot-diameter te analyseren.

Voer tijdsverloopmicroscopie uit door de incubatormicroscoop aan te zetten en de temperatuur in te stellen op 37 graden Celsius. Vul de bevochtiger met DH2O en pas vervolgens de CO2 aan naar 5% Zorg ervoor dat de incubatorkamer is bevochtigd en dat de gemotoriseerde tafel vrij kan bewegen. Sluit vervolgens de incubatorkamer en laat de microscoop aanpassen aan 37 graden Celsius.

Plaats de plaat op de tafel van de incubatormicroscoop en stel de tafellijst in, neem vervolgens twee tegenover elkaar liggende randen en het midden van elke celdot op. Gebruik een 10X objectief om elke drie minuten gedurende 15 tot 24 uur foto's te maken. Download de gegevens en ga verder met beeldanalyse in een programma naar keuze, zoals Matlab.

Aanvankelijk onthulde fasecontrastbeeldvorming van celdoten dat invasieve, longkolonievorming van borstkankercellen een mesenchymal fenotype behouden na stimulatie met EGF. Er worden echter vaker enkele cellen waargenomen die het blad verlaten in EGF-gestimuleerde celdoten. De respons van longkolonievorming van borstkankercellen op