Een eenvoudige benadering voor het opwekken van experimentele Autoimmune Neuritis in C57BL/6 muizen voor functionele en neuropathologische evaluaties
9 november 2017
Dit verslag schetst een eenvoudige benadering om succesvol experimentele autoimmune neuritis (EAN) met behulp van de myeline proteïne nul peptide180-199 (P0) in combinatie met de Freund compleet adjuvans en kinkhoest toxine. We presenteren een verfijnde paradigma staat nauwkeurig de beoordeling van de omvang van functionele tekorten en Neuropathologie die zich voordoen in deze EAN.
Het algemene doel van deze procedure is om succesvol Experimentele Auto-immuun Neuritis of EAN te induceren in een muismodel voor de functionele en pathologische analyse van het ziekteproces. Het EAN-model kan worden gebruikt om sleutelvragen met betrekking tot perifere neuropathie aan te pakken. Het is ook een prachtig model om mogelijk de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen te onderzoeken.
Het grote voordeel van deze aanpak is dat het een eenvoudig en objectief functioneel testparadijg biedt dat kan worden toegepast bij het gebruik van het EAN-model in de muis. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Sang Won Yoo, die een bachelorstudent is in het neurotrofine en myelinebiologielab aan de Universiteit van Melbourne. Drie dagen voor de ziekte-inductie, zet het apparaat voor motorfunctiebeoordeling aan en schakel de lichtknop in.
Pak de muis op en laat hem op een bak met rood voedselkleurstof zakken. Plaats de muis in het loopgedeelte en stel de snelheid van de loopband in op 15 centimeter per seconde. Zet de loopband aan en klik op opnemen om het gangfunctiebeeldsysteem te gebruiken om de loopbeweging van de muis gedurende 36 seconden vast te leggen.
Na 36 seconden, stopt u de opname en de loopband en slaat u het videobestand van de oefenloop in de aangewezen map op. Eén dag vóór de eerste immunisatie, gebruikt u een spuit van 0,5 milliliter uitgerust met een 30-1/2 gauge naald om 1,6 microgram per milliliter Pertussis toxine toe te dienen in 250 microliter muis isotone PBS IP aan geanesthetiseerde zes tot acht weken oude mannelijke C57BL/6 muizen. Beoordeel vervolgens de muizen op klinische tekenen van EAN op een schaal van nul tot vier volgens de tabel en voer een motorfunctiebeoordeling uit zoals zojuist gedemonstreerd.
De volgende dag, combineer gelijke volumes van vers bereide oplossingen van peptide in 0,9%saline en 20 milligram per milliliter Mycobacterium tuberculosis in complete Freund's adjuvant in een bead beader en meng de oplossingen op de maximale snelheid gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Laad een spuit uitgerust met een 23 gauge naald met het inoculum en draai en schud de spuit voordat u alle lucht in de spuitschacht leegmaakt. Voordat u het inoculum toedient, verwijdert u het haar net lateraal van de middenlijn tussen de schouderbladen en desinfecteert u de blootgestelde huid met 70%ethanol.
Gebruik vervolgens een paar Adson forceps om de huid vast te grijpen en breng 50 microliter van de oplossing toe aan de met Pertussis toxine geïnjecteerde muis via een subcutane injectie. De volgende ochtend toedient u 1,2 microgram per milliliter Pertussis toxine in 250 microliter PBS IP zoals zojuist gedemonstreerd, gevolgd door nog een injectie van 1,2 microgram per milliliter Pertussis toxine IP 48 uur later. Drie dagen na de derde Pertussis-injectie, toedient u nogmaals 50 microliter van vers bereid inoculum op dezelfde injectieplaats als voorheen en bewaakt u de klinische score en motorfunctie van de dieren twee keer per week tot het einde van het experiment.
P0 180-199 peptide-geïnduceerde EAN in C57BL/6 muizen leidt tot een monofasische ziekte met een klinisch score-begin van zes dagen na de eerste immunisatie en een maximale score-ernst op 25 dagen na de eerste immunisatie, gevolgd door enige klinische scoreverbetering op 40 dagen na de eerste immunisatie. De muizen beginnen te falen bij een eenvoudige looptaak al zo vroeg als zes dagen na de eerste immunisatie met weinig capaciteit om een eenvoudige loopbandlooptaak te voltooien op 35 dagen na immunisatie die geen verbetering in loopcapaciteit vertoont op 55 dagen na de eerste immunisatie. De onderzoek van semi-dunne secties van de heupzenuwen van peptide-geïnduceerde EAN-muizen onthullen gebieden van demyelinisatie in vergelijking met heupzenuwen van leeftijdsgematchte gezonde controles.
Hoge vermoging transmissie-elektronenmicroscopie beelden maken de identificatie van specifieke neuropathologische kenmerken mogelijk, zoals demyelinisatie, schade aan de myeline-lamellen en tekenen van axonenstress zoals mitochondriale zwelling. Deze dieren vertonen ook acute axonale schade zoals blijkt uit traumatisch verhoogde beta-amyloïde precursor-eiwitexpressie in de heupzenuwen die niet wordt waargenomen in leeftijdsgematchte gezonde controleweefsels. Een verbreding van de knooppunten en een verstoring van de paraknooppunten worden ook waargenomen.
Eenmaal onder de knie, kunnen de subcutane injecties worden uitgevoerd binnen ongeveer vijf tot tien minuten per muis met minimale kans op injectiefouten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het erg belangrijk dat u de injectieplaats observeert om ervoor te zorgen dat al het inoculum binnen de injectieplaats blijft en dat er niets uitlekt. Video-opname van loopbandgang is geweldig omdat het andere parameters mogelijk maakt, zoals zwaaifase of stappenlengte en deze maatregelen kunnen belangrijk worden bij het testen van de werkzaamheid van nieuwe therapieën.
Na het bekijken van deze video, zou u een heel goed begrip moeten hebben van hoe u EAN in C57BL/6 mannelijke muizen kunt induceren. Bovendien zou u een heel goed begrip moeten hebben van hoe u subcutane injecties veilig en nauwkeurig kunt plaatsen en ervoor kunt zorgen dat er geen injectiefout optreedt. Vergeet niet dat er, wanneer u met naalden en inoculum werkt, een kans op letsel bestaat, vooral bij het gebruik van scherpe voorwerpen.
Dus om elke kans op letsel te voorkomen, is het een heel goed idee om altijd de forceps te gebruiken en nooit huid of weefsel met de hand vast te grijpen en ook wegwerpspuiten te gebruiken, nooit opnieuw te sluiten in het proces.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methodologie om experimentele autoimmune neuritis (EAN) te induceren in een muismodel met behulp van het myeline-proteïne nul (P0) 180-199 peptide, samen met het complete adjuvans van Freund en pertussistoxine. Het doel is om een functionele en pathologische analyse van perifere neuropathie te vergemakkelijken, waardoor inzicht wordt verkregen in het ziekteproces en mogelijke behandelingen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Auto-immuunziekten
- Perifere neuropathie
Achtergrond
- Experimentele auto-immuunneuritis (EAN) is een model voor het bestuderen van perifere neuropathie.
- Het model is praktisch voor het beoordelen van nieuwe therapeutische middelen.
- Functionele tests tijdens de studie helpen bij een objectieve evaluatie.
- Belangrijke gedragsonderzoeken omvatten de motorische functie en klinische scoring.
Doel van de studie
- Om EAN efficiënt te induceren in C57BL/6-muizen voor onderzoeksdoeleinden.
- Om de mate van functionele tekorten en neuropathologie te analyseren.
- Om een reproduceerbaar protocol vast te stellen voor toekomstige studies naar perifere neuropathie.
Gebruikte methoden
- Het platform maakt gebruik van een loopband en een beeldvormingssysteem voor de gangfunctie voor functionele beoordelingen.
- Het model richt zich op mannelijke C57BL/6 muizen voor het proces van EAN-inductie.
- Er zijn geen multi-omics workflows vermeld in de studie.
- Het protocol omvat verschillende subcutane injecties met specifieke intervallen na immunisatie.
- Beoordelingen van de motorische functie worden meerdere keren tijdens de studie uitgevoerd om de progressie van de ziekte te monitoren.
Belangrijkste resultaten
- De studie bevestigt een monofasisch ziekteverloop waarbij de klinische symptomen hun piek bereiken 25 dagen na immunisatie.
- Significante functionele achteruitgangen in de uitvoering van motorische taken worden waargenomen van dag zes tot dag 35.
- Neuropathologische analyse toont demyelinisatie en axonale schade aan bij behandelde muizen in vergelijking met de controlegroep.
- Een verhoogde expressie van beta-amyloïde precursor-eiwit wijst op acute axonale beschadiging.
Conclusies
- Deze studie biedt een helder en efficiënt protocol voor het induceren van EAN, wat het begrip van neuropathologie faciliteert.
- Inzichten in het ziekteproces ondersteunen toekomstig onderzoek naar potentiële behandelingen voor perifere neuropathie.
- Deze bevindingen verbeteren het begrip van auto-immuunmechanismen die het perifere zenuwstelsel beïnvloeden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt de inductie van experimentele auto-immuunneuritis in C57BL/6-muizen mogelijk, een stam met een uitgebreid aanbod aan genetische instrumenten, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie van therapeutische kandidaten die zich richten op perifere demyelinisatie. Het model biedt kwantitatieve functionele en neuropathologische read-outs die het voorspellend vertrouwen vergroten bij de preklinische evaluatie van myelineherstel en neuroprotectieve strategieën. De reproduceerbaarheid en compatibiliteit met transgene benaderingen positioneren dit als een translationele tool voor targetvalidatie in onderzoek naar auto-immuun perifere neuropathie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar pathogene mechanismen bij auto-immuun perifere neuropathie mogelijk via induceerbare, peptide-gestuurde immuunactivatie in een genetisch hanteerbare gastheer.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van de C57BL/6-achtergrond, waardoor integratie met knockout-, knock-in- en reportermodellen mogelijk is voor het beperken van risico's bij causale targets.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing van immuun-gemedieerde zenuwbeschadigingsroutes, wat helpt bij vroege go/no-go-beslissingen voor immunomodulerende of remyeliniserende kandidaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare functionele achteruitgang via loopbandanalyse van de gang, wat longitudinale monitoring van motorische tekorten als farmacodynamische biomarker mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde klinische scoring (schaal 0–4) en getimede immunisaties ondersteunen reproduceerbare ziekte-inductie over onderzoekscohorten heen.
- Klaarheid voor assay: Compatibel met geblindeerde neuropathologische beoordeling, inclusief semi-dunne doorsneden en elektronenmicroscopie, om de target-interactie van neuroprotectieve verbindingen te valideren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Recapituleert belangrijke neuropathologische kenmerken van menselijke perifere demyelinisatie, inclusief axonale schade aangetoond door verhoogd bèta-amyloïd precursor-eiwit, wat de mechanistische relevantie ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Maakt evaluatie van therapeutische kandidaten mogelijk over verschillende ziektefasen, van het begin (dag 6) tot de piek (dag 25) en het herstel (dag 40), wat bijdraagt aan de optimalisatie van dosis en timing.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Faciliteert de beoordeling van de effectiviteit van myelineherstel en neuroprotectie, waardoor de biologische onzekerheid vóór IND-ondersteunende studies wordt verminderd.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische efficiëntietests, in het bijzonder voor biologische geneesmiddelen of kleine moleculen die gericht zijn op het moduleren van auto-immuunresponsen of het bevorderen van de axonale integriteit bij perifere neuropathie.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistisch wegnemen van risico's door gecontroleerde inductie van PNS-specifieke autoimmuniteit mogelijk te maken om targets die betrokken zijn bij immuun-zenuwinteracties te valideren.
- Screening: Biedt een gestandaardiseerd platform voor het beoordelen van effecten van verbindingen op de motorische functie en neuropathologie, met outputs die geschikt zijn voor high-content imaging en scoring.
- Analytics: Genereert longitudinale functionele gegevens (gangparameters, paslengte, zwaaifase) en eindpunt-histopathologische metrieken voor comparatieve analyse tussen behandelingsgroepen.
- Translational Research: Sluit aan bij preklinische validatie door het modelleren van chronisch-recidiverende kenmerken en axonale pathologie die relevant zijn voor menselijke perifere neuropathieën.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar immunologie-neurobiologieplatform voor iteratieve toetsing van therapeutische hypothesen over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in modellen voor perifere neuropathie door het mogelijk maken van een precieze, reproduceerbare inductie van immuun-gemedieerde demyelinisatie en axonale stress.
- Operationele waarde: Een gedefinieerd schema voor immunisatie en boosting, gecombineerd met gestandaardiseerde functionele tests, verbetert de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en vermindert de variabiliteit.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door vroegtijdig kwantificeerbaar bewijs te leveren van targetmodulatie in een ziekte-relevant systeem.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten die effecten vertonen op zowel functionele resultaten als neuropathologische eindpunten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van muizen, technieken voor subcutane injectie en perfusiefixatie voor neuropathologische analyse.
- Afhankelijk van toegang tot loopband-ganganalyzesystemen en apparatuur voor semi-dunne coupes en elektronenmicroscopie.
- Noodzaakt gestandaardiseerde training voor klinische scoring en geblindeerde beoordeling om dataconsistentie tussen verschillende operators te waarborgen.
- Vereist aanpassing van de peptideconcentratie en de adjuvansformulering bij extrapolatie naar andere muizenstammen vanwege variabele immuunresponsen.
- Beperkt tot een monofasisch ziekteverloop; modelleert mogelijk geen relapsing-remitting of chronisch progressieve vormen van perifere neuropathie zonder aanpassing van het protocol.
