Name: Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer methoden om eiwitaggregatie tijdens normale veroudering te bestuderen in Caenorhabditis elegans. Deze techniek helpt onderzoekers om veranderingen in eiwitoplosbaarheid met de leeftijd te detecteren en de rol van proteostase te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de DZNE en een Marie Curie internationale reïntegratietoelage (322120 naar D.C.D.)

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij rapporteren hier een methodologie te isoleren van hoogst-onoplosbaar eiwit-aggregaten van veroudering C. elegans onderworpen aan RNAi voor analyse van de Spectrometrie van de massa en het westelijke bevlekken. We laten zien dat verbetering van de proteostasis doordat IIS sterk leeftijd-afhankelijke proteÃ¯ne aggregatie voorkomt. Door het selecteren van specifieke aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan overexpress in C. elegans, is het mogelijk om te ontleden verder de mechanismen modulerende inh...

Eiwit misfolding en aggregatie worden herkend als een stempel van verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals AD, PD, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Frontotemporale dementie (FTD) en vele anderen. Bijvoorbeeld, α-synuclein assemblages in amyloïde fibrillen die zich ophopen als Lewy organen met name in de substantia nigra van PD-patiënten, terwijl in ALS patiënten TDP-43 of FUS misfold naar formulier cytoplasmatische aggregaten in degenererende motorische neuronen. In elk van deze neurodegeneratieve aandoeningen mislukken mechanismen onderhoud eiwit homeostase of proteostasis om te voorkomen dat de accumulatie van misfolded eiwitten, daarom leiden tot ziekte.
Proteostasis is van cruciaal belang om ervoor te zorgen de cellulaire functies en onder normale omstandigheden deze regulerende mechanismen strak controle over het tempo van de eiwitsynthese, vouwen en afbraak. Verschillende studies tonen aan dat met de vergrijzing, de mogelijkheid van vele cellen en organen voor het behoud van eiwit homeostase geleidelijk in het gedrang komt en de fysiologische verslechtering van de netwerken van de proteostasis met de leeftijd is een belangrijke verzwarende factor voor neurodegeneratieve ziekten (herzien in verwijzingen1,2,3). Het feit dat de controle van de kwaliteit van het eiwit en de cellulaire reactie op stress ongevouwen eiwitten in gevaar met de leeftijd komen suggereert dat eiwit misfolding en aggregatie zou een algemene gevolg van veroudering. Inderdaad, wij en anderen hebben aangetoond dat eiwitten aggregatie beperkt zich niet tot ziekte en in plaats daarvan deel van het proteoom zeer wasmiddel-onoplosbaar in leeftijd dieren4,5,6,7 wordt ,8,9,10. Rekentijd en in vivo onderzoek bleek dat deze fysiologische leeftijdsgebonden aggregaten lijken op ziekte aggregaten in verschillende aspecten5. De ontdekking van endogene, leeftijd-afhankelijke eiwitten aggregatie geeft ons de mogelijkheid om te ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, zonder gebruik te maken van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten reguleren. Op dit moment bestaat slechts beperkte informatie over de regulering van de wijdverbreide eiwit oplosbaarheid en over de gevolgen van deze disregulatie voor de gezondheid van het organisme.
De nematode C. elegans is een van de meest uitgebreid bestudeerde modelorganismen in onderzoek veroudering en deze dieren hebben een relatief korte levensduur vele karakteristieke veroudering eigenschappen waargenomen in hogere organismen tonen. De effecten van veroudering op de oplosbaarheid van eiwitten zijn bestudeerd in C. elegans door sequentiële biochemische fractionering gebaseerd op differentiële oplosbaarheid, die veel gebruikt wordt om uit te pakken van ziekte aggregaten op het gebied van neurodegeneratie onderzoek11 . Door kwantitatieve massaspectrometrie, werden verscheidene honderden eiwitten tot aggregatie-naar voren gebogen in C. elegans in de afwezigheid van ziekte5getoond. Hier beschrijven we in detail het protocol om te groeien van grote aantallen wormen in vloeibare cultuur en de sequentiële winning isoleren geaggregeerde eiwitten voor kwantificering massaspectrometrie en analyse door westelijke vlek. Omdat misfolded en aggregatie-naar voren gebogen eiwitten zich in leeftijd ophopen C. elegans gonaden en maskers veranderingen in andere somatische weefsels5,12,13, gebruiken we een mutant gonaden-minder te richten de analyse op eiwit oplosbaarheid in niet-reproductieve weefsels. De methode gepresenteerd maakt de analyse van zeer onoplosbare, grote aggregaten die onoplosbaar in 0,5% SDS en Ingehuld door relatief lage centrifugaal snelheid. U kunt ook een minder strenge extractie-protocol verzamelen ook kleinere en meer oplosbare aggregaten is gepubliceerd elders10. Daarnaast beschrijven we de methode gebruikt om te beoordelen aggregatie in vivo in C. elegans.
Over het algemeen kunnen deze methoden in combinatie met RNA-interferentie (RNAi) de rol van een gen van belang bij het moduleren van leeftijd-afhankelijke proteÃ¯ne aggregatie evalueren. Hiervoor beschrijven we de analyse van de fragmenten van jonge en oude wormen met en zonder knockdown van een specifieke proteïne van belang met behulp van RNAi. Deze methoden moeten een krachtig hulpmiddel om te bepalen welke onderdelen van het netwerk proteostasis reguleren eiwit oplosbaarheid. Verschillende interventies zoals verminderd insuline/insuline-achtige groei factor (IGF) 1 signalering (IIS) is gebleken dat C. elegans veroudering14dramatisch te vertragen. Levensduur trajecten veroorzaken vaak eiwit-kwaliteit controlemechanismen en dus deze trajecten kunnen worden actief beïnvloeden het tarief van aggregatie van eiwitten. Als voorbeeld tonen we verminderde inherente eiwit aggregatie in langlevende dieren op remming van het traject van IIS7.

<table><tbody><tr><td>Fernbach kweekfles&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex, Inhoud 2.800 ml, met 3 bufferingsindelingen</td></tr><tr><td>Schroefdop met membraan&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Roterende mixer</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>Trechter</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>Inhoud 1.000 ml</td></tr><tr><td>1 ml spuit&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Grijze naald, 27 G x &frac12; ", 0,4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>Membraanfilters 0,025 &micro;M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>pH-strook</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Complete Mini EDTA-vrije tabletten&nbsp;</td></tr><tr><td>Octoxynol-9&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonylfenylpolyethyleenglycol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>recombinant, RNase vrij</td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>oplossing</td></tr><tr><td>Totale eiwitblotkleuring</td><td>Thermofisher</td><td>S11791</td><td>Sypro Ruby eiwitblotkleuring</td></tr><tr><td>Totale eiwitgelkleuring</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby eiwitgelkleuring</td></tr><tr><td>TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride)</td><td>Serva</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade Gemodificeerde Trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering</td><td>Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima Max-XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Megafuge 40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator Plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>Centrifugale verdamper</td></tr><tr><td>Fluorescente stereo-microscoop M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Met Planapo 2,0x objectief</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Leica S6E</td></tr><tr><td>Microscoop met hoge vergroting Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Met PlanAPOCHROMAT 20x objectief en Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalyse software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyse van massaspectrometrie data</td><td>Protein Prospector</td><td></td><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td></tr><tr><td>E.coli stam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAi bacteriën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi bibliotheek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans mutanten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC, stamnaam: EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>Genotype: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>Della David's lab at DZNE T&uuml;bingen</td><td></td><td>Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>Della David's lab at DZNE T&uuml;bingen</td><td></td><td>Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td></tr></tbody></table>

methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

De prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), is in de laatste decennia gegroeid. Deze leeftijd-geassocieerde aandoeningen worden gekenmerkt door het verschijnen van eiwit-aggregaten met fibrillary structuur in de hersenen van deze patiënten. Precies de reden waarom normaal oplosbare eiwitten ondergaan blijft een aggregatie proces slecht begrepen. De ontdekking dat de aggregatie van eiwitten niet beperkt tot ziekteprocessen is en deel van het normale verouderingsproces schakelt alleen de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, regelen zonder het gebruik van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we methoden te onderzoeken die inherent zijn aan eiwit aggregatie in Caenorhabditis elegans door complementaire benaderingen. Ten eerste, we onderzoeken hoe om te groeien van grote aantallen van leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans om leeftijd dieren en presenteren we de biochemische procedures voor het isoleren van hoogst-onoplosbare-grote aggregaten. In combinatie met een gerichte genetische knockdown, is het mogelijk om te ontleden de rol van een gen van belang in de bevordering van of voorkomen van leeftijd-afhankelijke proteÃ¯ne aggregatie met behulp van een uitgebreide analyse met kwantitatieve massaspectrometrie of een kandidaat-gebaseerde analyse met antilichamen. Deze bevindingen worden vervolgens bevestigd door in vivo analyse met transgene dieren uiting van TL-gelabeld aggregatie-naar voren gebogen eiwitten. Deze methoden moeten helpen uitleggen waarom bepaalde eiwitten zijn gevoelig voor aggregaat met de leeftijd en uiteindelijk hoe deze eiwitten volledig functioneel te houden.

We gebruikten de methoden die hier gepresenteerd om te evalueren hoe langlevende dieren met een verminderde IIS moduleren leeftijd-afhankelijke proteÃ¯ne aggregatie. Door Western blot (zie stap 2.2, snel onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse), we geanalyseerd het totaal en het onoplosbare eiwitgehalte van jonge (dag 3 van volwassenheid) en leeftijd (dag 18 van volwassenheid) wormen op controle RNAi en op RNAi gericht op de insuline / IGF-1-like receptor- daf-2</em...

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Het algemene doel van dit experiment is om veranderingen in eiwitinoplosbaarheid met leeftijd in C.elegans te detecteren en om te evalueren hoe gerichte gen-knockdown van invloed is op deze verouderingsmarker. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van veroudering en proteostase te beantwoorden, zoals waarom organismen falen om een gezond proteoom met leeftijd te handhaven. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om eiwitaggregatie tijdens normale veroudering te bestuderen in de afwezigheid van ziekteprocessen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitaggregatie in C.elegans, kan deze ook worden aangepast aan andere modelorganismen, bijvoorbeeld om leeftijdsgerelateerde eiwitinoplosbaarheid bij muizen te bestuderen. Om de behandeling te beginnen, voeg 207,45 milliliter S Basal media toe met extra reagentia zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol tot een 2.800 milliliter Fernbach kweekfles. Voeg een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter Carbenicilline en één millimolair IPTG toe en sluit de fles met een membraanschroefdop.Haal de L1's uit de 25 graden Celsius incubator en breng ze over naar 15 milliliter

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an in vivo imaging-based assay to determine proteostasis decline due to aging. The assay uses Caenorhabditis elegans expressing polyglutamine YFP-fusion protein in body wall muscles to measure the age-associated aggregation of polyglutamine and induction of proteotoxicity, leading to paralysis.

Fluorescent Reporter-Based Paralysis Assay: A Technique to Assess Age-Associated Progressive Formation of Polyglutamine Fluorescent Reporter and Associated Paralysis in Caenorhabditis elegans

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.

Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.

Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Hier presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van solide plaat op basis van dieetbeperking...

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de...

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Leer methoden om eiwitaggregatie tijdens normale veroudering te bestuderen in Caenorhabditis elegans. Deze techniek helpt onderzoekers om veranderingen in eiwitoplosbaarheid met de leeftijd te detecteren en de rol van proteostase te begrijpen.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen