Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans
November 26th, 2017
Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.
Het algemene doel van dit experiment is om veranderingen in eiwitinoplosbaarheid met leeftijd in C.elegans te detecteren en om te evalueren hoe gerichte gen-knockdown van invloed is op deze verouderingsmarker. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van veroudering en proteostase te beantwoorden, zoals waarom organismen falen om een gezond proteoom met leeftijd te handhaven. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om eiwitaggregatie tijdens normale veroudering te bestuderen in de afwezigheid van ziekteprocessen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitaggregatie in C.elegans, kan deze ook worden aangepast aan andere modelorganismen, bijvoorbeeld om leeftijdsgerelateerde eiwitinoplosbaarheid bij muizen te bestuderen. Om de behandeling te beginnen, voeg 207,45 milliliter S Basal media toe met extra reagentia zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol tot een 2.800 milliliter Fernbach kweekfles. Voeg een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter Carbenicilline en één millimolair IPTG toe en sluit de fles met een membraanschroefdop.
Haal de L1's uit de 25 graden Celsius incubator en breng ze over naar 15 milliliter buisjes. Centrifugeer de L1's bij 1.900 keer g gedurende drie minuten. Na het centrifugeren, verwijder de supernatant.
Tel onder een microscoop de L1's per twee microliter en bereken het gemiddelde van de getallen verkregen uit minimaal negen druppels. Voeg vervolgens 50.000 wormen toe voor de jonge wormencollectie en 100.000 wormen voor de oudere wormencollectie in vier Fernbach kweekflessen voorbereid in de vorige stap. Voeg vervolgens controle RNAi-bacteriën en RNAi-bacteriën voor het gen van belang toe, proportioneel aan het aantal wormen.
Na het toevoegen van bacteriën, vul de wormencultuur aan met S Basal om het totale volume op 300 milliliter te brengen. Incubeer de wormencultuur bij 25 graden Celsius in een schuddende incubator met 150 rpm tot verzameling. Verzamel jonge wormen op dag twee of drie om basale niveaus van eiwitoplosbaarheid te meten.
Giet de wormen van een fles in een afscheidingsnelheid en laat de wormen gedurende 10 minuten sedimenteren bij kamertemperatuur. Nadat de wormen zijn gezakt, open de stopkraan en druppel de wormen in één 50 milliliter buisje. Splits vervolgens de wormenpellet in twee 15 milliliter buisjes.
Vul de buisjes aan tot 15 milliliter met M9 en centrifugeer de wormen. Om de wormen te wassen, verwijder de supernatant en vul de buis tot 15 milliliter met M9. Herhaal de centrifugatie. Zodra het wassen voltooid is, breng de wormen over in twee 50 milliliter buisjes en gebruik ijskoud M9 om het totale volume op 20 milliliter te brengen.
Om bacteriën en dode wormen te verwijderen, voeg de twee 20 milliliter verdunde wormenpellets toe aan twee 50 milliliter buisjes gevuld met 20 milliliter ijskoud 60% sucrose. Centrifugeer snel de buisjes. Verwijder met een 25 milliliter pipet voorzichtig maximaal 15 milliliter van de bovenste wormenlaag.
Plaats de bovenste wormenlaag direct in 37 milliliter M9 plus octoxynol-9 bereid op ijs. Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 2.700 keer g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius versnelling negen en vertraging zeven. Na het weggooien van de supernatant, breng de pellet over in vier 15 milliliter buisjes en was ze twee keer met ijskoud M9 plus octoxynol-9.
Centrifugeer vervolgens de buisjes. Verwijder de supernatant en vul de buisjes op tot de 15 milliliter markering met ijskoud M9 plus octoxynol-9. Was de wormen met ijskoud M9 en combineer de vier buisjes in twee buisjes.
Vul de buisjes op tot 15 milliliter en centrifugeer. Verwijder de supernatant, vul de twee buisjes op met M9 bij kamertemperatuur tot een totaal volume van vier milliliter en roteer ze op een nuterende mixer bij 25 graden Celsius gedurende 40 minuten. Na het nuteren, was de wormen twee keer met ijskoud M9 plus octoxynol-9.
Was ze vervolgens twee keer met M9 en breng de wormen over in één buisje. Was de wormen in de reassembly of RAB hoge zout extractiebuffer zonder remmers voor verzameling. Verwijder de supernatant tot er geen vloeistof meer bovenop de wormenpellet zit.
Schat vervolgens het volume van de wormenpellet en voeg een identiek volume RAB met remmers toe. Bereid een 50 milliliter buisje half gevuld met vloeibare stikstof op droog ijs voor en gebruik een Pasteur pipet om de wormen op te nemen en langzaam in de buis te druppelen. Laat de vloeibare stikstof verdampen en bewaar de bevroren wormen bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking.
Koel de mortel af met vloeibare stikstof en voer de dierdisruptie uit op droog ijs. Breng de bevroren wormen over naar de voorgekoelde mortel en vermaal ze gedurende 2,5 minuten. Voeg 100 milliliter vloeibare stikstof toe aan het poeder en vermaal het nog eens gedurende 2,5 minuten.
Gebruik een microscoop om te controleren of de wormlichamen in kleine stukjes zijn gebroken. Breng vervolgens het poeder over in twee milliliter buisjes en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Weeg op droog ijs twee keer 350 milligram gemalen wormen per tijdstip en per RNAi-bacterie af in twee milliliter buisjes.
Om de hoge zout oplosbare eiwitten te verwijderen, voeg twee volumes per gewicht van al bereid RAB met remmers, één millimolair PMSF, 200 eenheden per milliliter DNase I en 100 microgram per milliliter RNase A toe aan elke buis en los het poeder op in ijs. Trek de suspensie 15 keer op in een één milliliter spuit en incubeer deze gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer bij 18.400 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Door de vetlaag heen en verzamel de supernatant die hoge zout oplosbare eiwitten bevat in één twee milliliter buisje per voorwaarde. Verwijder het vet en gooi het weg. Doe hoge
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt eiwitaggregatie tijdens normaal veroudering in het modelorganisme C. elegans. De methode maakt het mogelijk om onoplosbare eiwitaggregaten en de impact van proteostase op veroudering te onderzoeken.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Verouderingsonderzoek
Achtergrond
- Eiwitaggregatie is een belangrijk kenmerk van veroudering.
- C. elegans dient als een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van veroudering.
- Het begrijpen van proteostase is cruciaal voor inzichten in leeftijdsgerelateerde ziekten.
- Deze methode kan worden aangepast voor gebruik in andere organismen, zoals muizen.
Doel van het onderzoek
- Om veranderingen in eiwitinlosbaarheid met leeftijd in C. elegans te detecteren.
- Om de invloed van gerichte genknockdown op eiwitaggregatie te evalueren.
- Om aan te pakken waarom organismen moeite hebben om een gezond proteoom te behouden naarmate ze ouder worden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van S Basal media met specifieke reagentia.
- Gebruik van Carbenicilline en IPTG in het kweekproces.
- Bewaking van eiwitaggregatie over tijd.
- Toepassing van genknockdowntechnieken om effecten op verouderingsmarkers te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van eiwitaggregatiepatronen in verouderende C. elegans.
- Beoordeling van hoe genknockdown de eiwitoplosbaarheid verandert.
- Inzichten in de mechanismen van proteostasefalen met de leeftijd.
- Mogelijkheden voor bredere toepassingen in verouderingsonderzoek over soorten heen.
Conclusies
- De methode biedt een robuust kader voor het bestuderen van verouderingsgerelateerde eiwitaggregatie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van het verouderingsproces en proteostase.
- Toekomstig onderzoek kan deze aanpak uitbreiden naar andere modelorganismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Studying inherent protein aggregation during normal aging provides a disease-agnostic framework for evaluating proteostasis mechanisms relevant to neurodegenerative target validation. This approach enables mechanistic de-risking of hypotheses linking protein solubility to functional decline in aging populations. Insights support early discovery decisions by identifying genetic modifiers that maintain proteome integrity without relying on ectopic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses about genes that promote or prevent age-dependent protein insolubility.
- Operational Value: Use quantitative mass spectrometry or antibody-based analysis to dissect gene function in aggregation pathways.
- Predictive Value: Identify targets whose modulation delays aggregation, supporting portfolio triage based on mechanistic confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare age-synchronized worm populations to generate reproducible insoluble protein fractions for compound screening.
- Quantitative Output: Measure changes in highly insoluble large aggregates as a functional readout of proteostasis modulation.
- Scalability: Enable large-scale worm culture and biochemical isolation for consistent compound evaluation across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Link inherent aggregation mechanisms to age-associated proteinopathies without confounding disease transgene expression.
- Translational Continuity: Validate findings in vivo using fluorescent-tagged aggregation-prone proteins to confirm biochemical results.
- Risk-Adjusted Advancement: Use aggregation delay in long-lived mutants as a biomarker for target engagement and proteostasis enhancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing a quantitative, genetically tractable readout of proteostasis decline that informs lead identification and target prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene knockdown effects on inherent aggregation, clarifying pathway involvement in aging-related insolubility.
- Screening: Enables assay development based on insoluble protein isolation, offering a standardized, quantitative phenotype for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Generates mass spectrometry and immunoblot data to compare insoluble protein profiles across conditions, enabling objective comparison of interventions.
- Translational Research: Connects biochemical aggregation data to in vivo puncta formation in transgenic models, supporting biomarker alignment and mechanistic validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing proteostasis modifiers across multiple targets and therapeutic areas related to aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by distinguishing aggregation-promoting from aggregation-preventing genetic factors.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible isolation of highly insoluble proteins enabling cross-functional data comparison.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in proteostasis-targeted programs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to maintain protein solubility during aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture, age synchronization, and biochemical fractionation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation, mass spectrometry, and fluorescence microscopy for aggregate analysis.
- Necessitates standardization of worm harvesting and lysis protocols across labs to ensure reproducible insoluble protein yields.
- Involves adaptation considerations when transferring the biochemical fractionation to other model systems like mouse tissue.
- Limited by the need for large worm numbers and extended culture times for aged collections, affecting throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Liquid Culture for Treatment with RNAi Starting at L1
2:40
Collection of Young and Aged Worms Subjected to RNAi in Liquid Culture
6:14
Disruption of Animals
6:58
Isolation of SDS-insoluble Proteins for Mass Spectrometry
10:03
Results: Reduced IIS Prevents Age-dependent Protein Aggregation
11:26
Conclusion
