Celoppervlak biotinylering assay
Labelen van celoppervlakte-eiwitten met biotin biedt een krachtig hulpmiddel om cellulaire transportroutes te bestuderen die betrokken zijn bij de regulatie van membraaneiwitten. Een cel handhaaft een nauwkeurig gereguleerd set eiwitten aan het oppervlak, zodat het extracellulaire informatie kan ontvangen en reageren via verschillende signaalroutes. Endocytose, een proces van inslikken, wordt gezien als betrokken bij de regulatie van deze celoppervlakte-eiwitten door hun internalisatie te veroorzaken. Daarom helpt het labelen van deze eiwitten voordat ze worden geendocyteerd met agentia zoals biotin wetenschappers om hun internalisatie te kwantificeren en hun rollen in cellulaire routes te bestuderen.
In deze video bespreken we de principes en methodologie van celoppervlakte-biotinylatie-assays en verkennen we enkele manieren waarop wetenschappers deze methode vandaag aanpassen.
Bekijken we eerst de principes achter de celoppervlakte-biotinylatie-assay.
Zoals eerder vermeld, gebruiken cellen endocytische routes om de ruimtelijk-tijdelijke dichtheid en verdeling van oppervlakte-eiwitten te reguleren. Geïnternaliseerde eiwitten worden via specifieke cellulaire routes getransporteerd, waarna ze ofwel naar het lysosoom kunnen worden afgevoerd voor afbraak, ofwel teruggestuurd naar het celoppervlak voor aanhoudende activiteit. Celoppervlakte-biotinylatie is ontworpen om deze processen te meten.
De tag die in deze assay wordt gebruikt, biotin - ook bekend als vitamine H - is een kleine, wateroplosbare molecuul. Een veel gebruikte afgeleide van biotin voor oppervlaktelabeling-experimenten is de sulfo-NHS-SS-biotin, die bestaat uit de sulfaatgroep, de N-hydroxysuccinimide-estergroep, de disulfidebinding en natuurlijk biotin. Laten we deze enorme structuur vereenvoudigen door biotin te vervangen door de letter 'B'.
De sulfaatgroep in deze structuur geeft een sterke lading die deze vorm van biotin membraanimpermeabel maakt. Het labelen van celoppervlakte-eiwitten gebeurt door sulfo-NHS-SS-biotin toe te voegen aan cellen die worden bewaard bij een temperatuur die restrictief is voor endocytose. De NHS-groep reageert met de primaire aminen op oppervlakte-eiwitten en vormt covalente bindingen.
Vervolgens worden de gelabelde cellen verplaatst naar een temperatuur die permissief is voor endocytose, waarbij een deel van de gelabelde eiwitten worden geïnternaliseerd. Ten slotte worden de cellen teruggebracht naar de restrictieve temperatuur om endocytose te stoppen. Om geïnternaliseerde eiwitten specifiek te kwantificeren, wordt een hydrofiel, membraanimpermeabel reducerend middel - zoals L-glutathion - toegevoegd. Dit reageert met de disulfidebindingen op niet-geendocytoseerd sulfo-NHS-SS biotin en klieft biotin-groepen af. Op dit punt zijn de resterende gebiotinyleerde eiwitten diegene waarvan de labels werden beschermd tegen het reducerende middel omdat ze eerder zijn geïnternaliseerd.
Cellen worden vervolgens gelyseerd en de geendocytoseerd gebiotinyleerde eiwitten worden geïsoleerd om te worden gekwantificeerd. Isolatie wordt meestal uitgevoerd door cellysaten toe te voegen aan synthetische bedden bedekt met streptavidine. Aangezien streptavidine een extreem hoge affiniteit heeft voor biotin, hechten de gebiotinyleerde eiwitten zich aan de gecoate bedden. Een reeks wasstappen om verontreinigende eiwitten te verwijderen en ten slotte een elutiestap, wordt uitgevoerd om gebonden eiwitten vrij te maken. De doeleiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd met technieken zoals Western blotting.
Nu u de concepten achter de biotinylatie-assay kent, bekijken we een gegeneraliseerd protocol dat laat zien hoe deze procedure kan worden uitgevoerd om de endocytose van oppervlakte-eiwitten te meten.
Begin met gekweekte cellen afgekoeld tot 4°C. Plaats ze op ijs om de temperatuur te behouden die restrictief is voor endocytose. Vervolgens wordt het membraan-impermeabele sulfo-NHS-SS-biotin-reagens toegevoegd en worden de cellen in het donker gedurende ongeveer 30 minuten geïncubeerd. Dit geeft voldoende tijd om biotin-labels covalent aan de oppervlakte-eiwitten te hechten. Cellen worden vervolgens van het ijs verwijderd en gedurende ongeveer 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Bij deze temperatuur worden gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten geendocyteerd. Na incubatie worden de cellen afgekoeld tot 4°C en wordt een hydrofiel reducerend middel zoals L-glutathion toegevoegd. Dit reageert met disulfidebindingen en geeft biotin-groepen vrij van gelabelde, niet-geendocytoseerd eiwitten.
Vervolgens worden cellen gelyseerd door centrifugatie, waardoor celmembranen worden gebroken en gebiotinyleerde eiwitten worden blootgesteld. Hierna worden lysaten toegevoegd aan streptavidine-gecoate bedden en worden gebiotinyleerde eiwitten gebonden. Beads worden gewassen met koud fosfaatgebufferd zout en geëlueerd met een buffer die detergenten en reducerende middelen bevat. Deze reagentia denatureren gebonden eiwitten van de beads en maken hun herstel in de eluaat mogelijk. Eiwitten in de eluaat worden gescheiden op basis van hun moleculaire massa door middel van gelelektroforese. Ten slotte maken Western blotting en sondering van de blot met eiwitspecifieke antilichamen de visualisatie van het doeleiwit mogelijk. Het percentage geendocytoseerd eiwit kan worden gekwantificeerd aan de hand van de resulterende banddichtheden.
Nu u de methodologie van celbiotinylatie begrijpt, bekijken we hoe deze wordt gebruikt in specifieke experimenten.
De meest voorkomende toepassing van dit biotinylatieprotocol is om de endocytische snelheid van specifieke celoppervlakte-eiwitten te meten. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het evalueren van de internalisatie van dopaminetransporter of DAT. Door het standaardprotocol te volgen, waren wetenschappers in staat om het percentage geendocytoseerd DAT te meten. Dit is een representatief immunoblot dat baan T toont, overeenkomend met de 'totale' hoeveelheid eiwit vóór internalisatie, baan S is voor'stripped' monsters waarbij cellen nooit door endocytose werden toegestaan, maar werden behandeld met een reducerend middel, en baan I vertegenwoordigt resultaten van 'geïnternaliseerde' eiwitten.
Naast het
Een cel kan de hoeveelheid specifieke eiwitten op zijn celmembraan reguleren door middel van endocytose, waarna celoppervlakte-eiwitten effectief word…
Labelen van celoppervlakte-eiwitten met biotin biedt een krachtig hulpmiddel om cellulaire transportroutes te bestuderen die betrokken zijn bij de regulatie van membraaneiwitten. Een cel handhaaft een nauwkeurig gereguleerd set eiwitten aan het oppervlak, zodat het extracellulaire informatie kan ontvangen en reageren via verschillende signaalroutes. Endocytose, een proces van inslikken, wordt gezien als betrokken bij de regulatie van deze celoppervlakte-eiwitten door hun internalisatie te veroorzaken. Daarom helpt het labelen van deze eiwitten voordat ze worden geendocyteerd met agentia zoals biotin wetenschappers om hun internalisatie te kwantificeren en hun rollen in cellulaire routes te bestuderen.
In deze video bespreken we de principes en methodologie van celoppervlakte-biotinylatie-assays en verkennen we enkele manieren waarop wetenschappers deze methode vandaag aanpassen.
Bekijken we eerst de principes achter de celoppervlakte-biotinylatie-assay.
Zoals eerder vermeld, gebruiken cellen endocytische routes om de ruimtelijk-tijdelijke dichtheid en verdeling van oppervlakte-eiwitten te reguleren. Geïnternaliseerde eiwitten worden via specifieke cellulaire routes getransporteerd, waarna ze ofwel naar het lysosoom kunnen worden afgevoerd voor afbraak, ofwel teruggestuurd naar het celoppervlak voor aanhoudende activiteit. Celoppervlakte-biotinylatie is ontworpen om deze processen te meten.
De tag die in deze assay wordt gebruikt, biotin - ook bekend als vitamine H - is een kleine, wateroplosbare molecuul. Een veel gebruikte afgeleide van biotin voor oppervlaktelabeling-experimenten is de sulfo-NHS-SS-biotin, die bestaat uit de sulfaatgroep, de N-hydroxysuccinimide-estergroep, de disulfidebinding en natuurlijk biotin. Laten we deze enorme structuur vereenvoudigen door biotin te vervangen door de letter 'B'.
De sulfaatgroep in deze structuur geeft een sterke lading die deze vorm van biotin membraanimpermeabel maakt. Het labelen van celoppervlakte-eiwitten gebeurt door sulfo-NHS-SS-biotin toe te voegen aan cellen die worden bewaard bij een temperatuur die restrictief is voor endocytose. De NHS-groep reageert met de primaire aminen op oppervlakte-eiwitten en vormt covalente bindingen.
Vervolgens worden de gelabelde cellen verplaatst naar een temperatuur die permissief is voor endocytose, waarbij een deel van de gelabelde eiwitten worden geïnternaliseerd. Ten slotte worden de cellen teruggebracht naar de restrictieve temperatuur om endocytose te stoppen. Om geïnternaliseerde eiwitten specifiek te kwantificeren, wordt een hydrofiel, membraanimpermeabel reducerend middel - zoals L-glutathion - toegevoegd. Dit reageert met de disulfidebindingen op niet-geendocytoseerd sulfo-NHS-SS biotin en klieft biotin-groepen af. Op dit punt zijn de resterende gebiotinyleerde eiwitten diegene waarvan de labels werden beschermd tegen het reducerende middel omdat ze eerder zijn geïnternaliseerd.
Cellen worden vervolgens gelyseerd en de geendocytoseerd gebiotinyleerde eiwitten worden geïsoleerd om te worden gekwantificeerd. Isolatie wordt meestal uitgevoerd door cellysaten toe te voegen aan synthetische bedden bedekt met streptavidine. Aangezien streptavidine een extreem hoge affiniteit heeft voor biotin, hechten de gebiotinyleerde eiwitten zich aan de gecoate bedden. Een reeks wasstappen om verontreinigende eiwitten te verwijderen en ten slotte een elutiestap, wordt uitgevoerd om gebonden eiwitten vrij te maken. De doeleiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd met technieken zoals Western blotting.
Nu u de concepten achter de biotinylatie-assay kent, bekijken we een gegeneraliseerd protocol dat laat zien hoe deze procedure kan worden uitgevoerd om de endocytose van oppervlakte-eiwitten te meten.
Begin met gekweekte cellen afgekoeld tot 4°C. Plaats ze op ijs om de temperatuur te behouden die restrictief is voor endocytose. Vervolgens wordt het membraan-impermeabele sulfo-NHS-SS-biotin-reagens toegevoegd en worden de cellen in het donker gedurende ongeveer 30 minuten geïncubeerd. Dit geeft voldoende tijd om biotin-labels covalent aan de oppervlakte-eiwitten te hechten. Cellen worden vervolgens van het ijs verwijderd en gedurende ongeveer 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Bij deze temperatuur worden gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten geendocyteerd. Na incubatie worden de cellen afgekoeld tot 4°C en wordt een hydrofiel reducerend middel zoals L-glutathion toegevoegd. Dit reageert met disulfidebindingen en geeft biotin-groepen vrij van gelabelde, niet-geendocytoseerd eiwitten.
Vervolgens worden cellen gelyseerd door centrifugatie, waardoor celmembranen worden gebroken en gebiotinyleerde eiwitten worden blootgesteld. Hierna worden lysaten toegevoegd aan streptavidine-gecoate bedden en worden gebiotinyleerde eiwitten gebonden. Beads worden gewassen met koud fosfaatgebufferd zout en geëlueerd met een buffer die detergenten en reducerende middelen bevat. Deze reagentia denatureren gebonden eiwitten van de beads en maken hun herstel in de eluaat mogelijk. Eiwitten in de eluaat worden gescheiden op basis van hun moleculaire massa door middel van gelelektroforese. Ten slotte maken Western blotting en sondering van de blot met eiwitspecifieke antilichamen de visualisatie van het doeleiwit mogelijk. Het percentage geendocytoseerd eiwit kan worden gekwantificeerd aan de hand van de resulterende banddichtheden.
Nu u de methodologie van celbiotinylatie begrijpt, bekijken we hoe deze wordt gebruikt in specifieke experimenten.
De meest voorkomende toepassing van dit biotinylatieprotocol is om de endocytische snelheid van specifieke celoppervlakte-eiwitten te meten. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het evalueren van de internalisatie van dopaminetransporter of DAT. Door het standaardprotocol te volgen, waren wetenschappers in staat om het percentage geendocytoseerd DAT te meten. Dit is een representatief immunoblot dat baan T toont, overeenkomend met de 'totale' hoeveelheid eiwit vóór internalisatie, baan S is voor'stripped' monsters waarbij cellen nooit door endocytose werden toegestaan, maar werden behandeld met een reducerend middel, en baan I vertegenwoordigt resultaten van 'geïnternaliseerde' eiwitten.
Naast het
Labelen van celoppervlakte-eiwitten met biotin biedt een krachtig hulpmiddel om cellulaire transportroutes te bestuderen die betrokken zijn bij de regulatie van membraaneiwitten. Een cel handhaaft een nauwkeurig gereguleerd set eiwitten aan het oppervlak, zodat het extracellulaire informatie kan ontvangen en reageren via verschillende signaalroutes. Endocytose, een proces van inslikken, wordt gezien als betrokken bij de regulatie van deze celoppervlakte-eiwitten door hun internalisatie te veroorzaken. Daarom helpt het labelen van deze eiwitten voordat ze worden geendocyteerd met agentia zoals biotin wetenschappers om hun internalisatie te kwantificeren en hun rollen in cellulaire routes te bestuderen.
In deze video bespreken we de principes en methodologie van celoppervlakte-biotinylatie-assays en verkennen we enkele manieren waarop wetenschappers deze methode vandaag aanpassen.
Bekijken we eerst de principes achter de celoppervlakte-biotinylatie-assay.
Zoals eerder vermeld, gebruiken cellen endocytische routes om de ruimtelijk-tijdelijke dichtheid en verdeling van oppervlakte-eiwitten te reguleren. Geïnternaliseerde eiwitten worden via specifieke cellulaire routes getransporteerd, waarna ze ofwel naar het lysosoom kunnen worden afgevoerd voor afbraak, ofwel teruggestuurd naar het celoppervlak voor aanhoudende activiteit. Celoppervlakte-biotinylatie is ontworpen om deze processen te meten.
De tag die in deze assay wordt gebruikt, biotin - ook bekend als vitamine H - is een kleine, wateroplosbare molecuul. Een veel gebruikte afgeleide van biotin voor oppervlaktelabeling-experimenten is de sulfo-NHS-SS-biotin, die bestaat uit de sulfaatgroep, de N-hydroxysuccinimide-estergroep, de disulfidebinding en natuurlijk biotin. Laten we deze enorme structuur vereenvoudigen door biotin te vervangen door de letter 'B'.
De sulfaatgroep in deze structuur geeft een sterke lading die deze vorm van biotin membraanimpermeabel maakt. Het labelen van celoppervlakte-eiwitten gebeurt door sulfo-NHS-SS-biotin toe te voegen aan cellen die worden bewaard bij een temperatuur die restrictief is voor endocytose. De NHS-groep reageert met de primaire aminen op oppervlakte-eiwitten en vormt covalente bindingen.
Vervolgens worden de gelabelde cellen verplaatst naar een temperatuur die permissief is voor endocytose, waarbij een deel van de gelabelde eiwitten worden geïnternaliseerd. Ten slotte worden de cellen teruggebracht naar de restrictieve temperatuur om endocytose te stoppen. Om geïnternaliseerde eiwitten specifiek te kwantificeren, wordt een hydrofiel, membraanimpermeabel reducerend middel - zoals L-glutathion - toegevoegd. Dit reageert met de disulfidebindingen op niet-geendocytoseerd sulfo-NHS-SS biotin en klieft biotin-groepen af. Op dit punt zijn de resterende gebiotinyleerde eiwitten diegene waarvan de labels werden beschermd tegen het reducerende middel omdat ze eerder zijn geïnternaliseerd.
Cellen worden vervolgens gelyseerd en de geendocytoseerd gebiotinyleerde eiwitten worden geïsoleerd om te worden gekwantificeerd. Isolatie wordt meestal uitgevoerd door cellysaten toe te voegen aan synthetische bedden bedekt met streptavidine. Aangezien streptavidine een extreem hoge affiniteit heeft voor biotin, hechten de gebiotinyleerde eiwitten zich aan de gecoate bedden. Een reeks wasstappen om verontreinigende eiwitten te verwijderen en ten slotte een elutiestap, wordt uitgevoerd om gebonden eiwitten vrij te maken. De doeleiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd met technieken zoals Western blotting.
Nu u de concepten achter de biotinylatie-assay kent, bekijken we een gegeneraliseerd protocol dat laat zien hoe deze procedure kan worden uitgevoerd om de endocytose van oppervlakte-eiwitten te meten.
Begin met gekweekte cellen afgekoeld tot 4°C. Plaats ze op ijs om de temperatuur te behouden die restrictief is voor endocytose. Vervolgens wordt het membraan-impermeabele sulfo-NHS-SS-biotin-reagens toegevoegd en worden de cellen in het donker gedurende ongeveer 30 minuten geïncubeerd. Dit geeft voldoende tijd om biotin-labels covalent aan de oppervlakte-eiwitten te hechten. Cellen worden vervolgens van het ijs verwijderd en gedurende ongeveer 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Bij deze temperatuur worden gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten geendocyteerd. Na incubatie worden de cellen afgekoeld tot 4°C en wordt een hydrofiel reducerend middel zoals L-glutathion toegevoegd. Dit reageert met disulfidebindingen en geeft biotin-groepen vrij van gelabelde, niet-geendocytoseerd eiwitten.
Vervolgens worden cellen gelyseerd door centrifugatie, waardoor celmembranen worden gebroken en gebiotinyleerde eiwitten worden blootgesteld. Hierna worden lysaten toegevoegd aan streptavidine-gecoate bedden en worden gebiotinyleerde eiwitten gebonden. Beads worden gewassen met koud fosfaatgebufferd zout en geëlueerd met een buffer die detergenten en reducerende middelen bevat. Deze reagentia denatureren gebonden eiwitten van de beads en maken hun herstel in de eluaat mogelijk. Eiwitten in de eluaat worden gescheiden op basis van hun moleculaire massa door middel van gelelektroforese. Ten slotte maken Western blotting en sondering van de blot met eiwitspecifieke antilichamen de visualisatie van het doeleiwit mogelijk. Het percentage geendocytoseerd eiwit kan worden gekwantificeerd aan de hand van de resulterende banddichtheden.
Nu u de methodologie van celbiotinylatie begrijpt, bekijken we hoe deze wordt gebruikt in specifieke experimenten.
De meest voorkomende toepassing van dit biotinylatieprotocol is om de endocytische snelheid van specifieke celoppervlakte-eiwitten te meten. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het evalueren van de internalisatie van dopaminetransporter of DAT. Door het standaardprotocol te volgen, waren wetenschappers in staat om het percentage geendocytoseerd DAT te meten. Dit is een representatief immunoblot dat baan T toont, overeenkomend met de 'totale' hoeveelheid eiwit vóór internalisatie, baan S is voor'stripped' monsters waarbij cellen nooit door endocytose werden toegestaan, maar werden behandeld met een reducerend middel, en baan I vertegenwoordigt resultaten van 'geïnternaliseerde' eiwitten.
Naast het
Q1: What is biotin and why is it used in cell-surface labeling experiments?
Biotin, also known as vitamin H, is a small, water-soluble molecule ideal for labeling cell surface proteins. The sulfo-NHS-SS-biotin derivative used in these assays contains a sulfo group that imparts strong charge, making it membrane impermeant so it labels only surface proteins. This allows scientists to track protein internalization without the label entering the cell prematurely.
Q2: How does temperature control regulate the biotinylation assay protocol?
The assay uses temperature shifts to control endocytosis timing. Cells are maintained at 4°C, a restrictive temperature preventing endocytosis, during initial biotin labeling. They are then moved to 37°C, a permissive temperature allowing endocytosis of labeled proteins. Finally, cells return to 4°C to halt endocytosis, ensuring precise measurement of internalized proteins during the defined window.
Q3: What role does L-glutathione play in distinguishing internalized from surface proteins?
L-glutathione is a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent that cleaves disulfide bonds on the biotin label. It removes biotin from unendocytosed surface proteins but cannot penetrate the cell membrane to reach internalized proteins. This selective cleavage leaves only biotinylated proteins that were protected inside the cell, enabling quantification of internalized proteins.
Q4: How are biotinylated proteins isolated and identified in the cell-surface biotinylation assay?
After cell lysis, biotinylated proteins are isolated using streptavidin-coated beads, which bind biotin with extremely high affinity. Following washing steps to remove contaminants, proteins are eluted using detergents and reducing agents. The recovered proteins are then separated by gel electrophoresis and analyzed using Western blotting with protein-specific antibodies for visualization and quantification.
Q5: What can scientists learn by measuring dopamine transporter endocytosis using biotinylation?
By applying the cell-surface biotinylation assay to dopamine transporter (DAT), scientists can quantify the percentage of DAT proteins internalized from the cell membrane. This measurement reveals how cells regulate neurotransmitter transporter availability and can show how drugs like protein kinase C activators affect transporter internalization, providing insights into cellular signaling and drug responses.
Q6: How can the biotinylation assay be modified to measure protein recycling?
To measure recycling, researchers perform the standard biotinylation protocol, then add steps after cleaving biotin from unendocytosed surface proteins. They raise temperature back to 37°C to allow internalized, biotin-tagged proteins to recycle back to the membrane. By comparing internalized protein amounts before and after recycling, scientists quantify the percentage of proteins recycled, as demonstrated with CFTR channel protein studies.
Q7: Why is the cell-surface biotinylation assay important for studying endocytosis and exocytosis pathways?
The biotinylation assay directly measures how cells regulate surface protein density through an introduction to endocytosis and exocytosis mechanisms. By tracking labeled proteins through internalization, degradation, and recycling pathways, scientists can quantify the spatiotemporal distribution of membrane proteins and understand how cells respond to extracellular signals and regulate cellular transport processes.
Videos from this collection: