Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten
November 8th, 2017
Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.
Het algemene doel van dit array-gebaseerde protocol voor comparatieve genomische hybridisatie is om snel kopienummervariaties te identificeren in mutanten van de legumplant Medicago truncatula die zijn geïnduceerd door bombardement met snelle neutronen. Deze methode helpt om belangrijke vragen in het veld van legumbiologie te beantwoorden. Zoals het vergemakkelijken van de identificatie van empathogenen op een lage site die betrokken is bij het reguleren van knobbeltjesontwikkeling bij legums.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het van hoog aanzien is en gevoelig is in het detecteren van kopienummervariaties zoals deletiemutaties in de neutronenbombardement mutanten van de legumplant Medicago truncatula. Ik zal samen met Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows uit het Genetic Lab, deze procedure demonstreren. Vries snel een gram jong bladweefsel, verzameld van enkele planten, in vloeibare stikstof.
Gebruik vervolgens een vijzel en stamper en maal het bevroren bladweefsel tot fijn poeder in de vloeibare stikstof. Gebruik een DNA-isolatiekit om de wild type en mutante genomische DNA-monsters uit het fijne poeder te extraheren. Gebruik 500 microliter centrifugeerbuisjes om één microgram van elk wild type en mutante genomisch DNA te verdunnen met twee keer gedestilleerd water tot een eindvolume van 20 microliter.
Voeg vervolgens vijf microliter willekeurige primer toe aan de centrifugeerbuisjes. Vorm snel de buisjes en plaats ze na een snelle draai om in een thermocycler gedurende 10 minuten om de DNA-monsters te denatureren bij 98 graden Celsius. Verwijder na 10 minuten de buisjes uit de thermocycler en plaats ze onmiddellijk vijf minuten op ijswater.
Bereid vervolgens twee labelmixen voor en voeg 25 microliter labelmix toe als een en twee aan de wild type en mutante DNA-buisjes. Pipetteer het DNA en de labelmix drie keer en draai de buisjes vervolgens kort. Na het draaien, incubeer de buisjes in de thermocycler gedurende twee uur op 37 graden Celsius en vervolgens 20 minuten op 65 graden Celsius om het exo Klenow-enzym te inactiveren.
Voeg vervolgens 430 microliter One X TE-buffer toe en meng de inhoud in elke buis. Draai vervolgens kort de buisjes en breng de oplossing in de buisjes over naar zuiveringskolommen met twee milliliter verzamelbuisjes. Centrifugeer de zuiveringskolommen gedurende 10 minuten bij 14.000 keer G en gooi het doorstroomwater weg.
Voeg 480 microliter One X TE-buffer toe aan elke kolom en centrifugeer opnieuw gedurende 10 minuten bij 14.000 keer G. Gooi het doorstroomwater weg. Breng elk van de wild type en mutante gelabelde DNA's vanaf de bodem van de kolom over naar nieuwe centrifugeerbuisjes.
Na het meten van het volume van elk van de gelabelde DNA's met de pipet, pas het eindvolume aan tot 80 microliter met One X TE-buffer en meet vervolgens de concentratie van de gelabelde DNA's in een spectrofotometer. Meng vervolgens gelijke volumes van mutante en wild type DNA's om sondes te hybridiseren op een microarray-chip voor comparatieve hybridisatie. Breng het eindvolume tot 160 microliter met One X TE-buffer.
Bereid vervolgens de hybridisatieoplossing voor en pipetteer deze drie keer om drie agentia goed te mengen met gemengd DNA. Na kort draaien van de buisjes, incubeer ze in een thermocycler gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius en 20 minuten bij 37 graden Celsius. Vergeet niet om de temperatuur in te stellen op 67 graden Celsius om de hybridisatieoven vier uur voorafgaand aan de hybridisatie voor te verwarmen.
Plaats vervolgens een afdichtingsschuif op de basis van de hybridisatiekamer en laad 490 microliter van de hybridisatieoplossing erop na 20 minuten incubatie bij 37 graden Celsius in de thermocycler. Om de hybridisatiekamer te vormen, bedek de afdichtingsschuif met de Medicago truncatula-genoommicroarray-chip, bedek vervolgens de hybridisatiekamer en draai deze stevig vast met de klemmen. Incubeer de geassembleerde hybridisatiekamer in de hybridisatieoven gedurende 40 tot 48 uur bij 67 graden Celsius.
Bereid ondertussen twee schuifwasbakken voor met 250 milliliter Wasbuffer Een, bewaard op kamertemperatuur. Maak vervolgens een schuifwasbak met Wasbuffer Twee, bewaard op 37 graden Celsius. Bereid vervolgens een schuifwaspot met 70 milliliter acetonitril en een andere schuifwaspot met 70 milliliter stabilisatie- en opnameoplossing voor.
Plaats beide schuifwaspotten in een afzuigkap op kamertemperatuur. Verwijder na incubatie de hybridisatiekamer uit de hybridisatieoven en maak de klemmen los om de deksel te openen. Verwijder vervolgens de microarray-chip in de afdichtingsschuif en plaats deze op de schuifwasbak met Wasbuffer Een.
Isoleer de microarray-chip van de dekschuif. Breng vervolgens de microarray-chip over naar de tweede schuifwasbak met Wasbuffer Een. Roer de oplossing zachtjes met een roerbaartje op een magnetische roerplaat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Plaats de microarray-chip op de schuifwasbak met voorverwarmde Wasbuffer Twee en roer met de roerbaartje om de oplossing gedurende één minuut bij 37 graden Celsius te wassen. Verwijder de microarray-chip en plaats deze in de acetonitril bevattende schuifwaspot in een afzuigkap om gedurende 30 seconden te wassen. Breng de microarray-chip over naar de schuifwaspot met stabilisatie- en droogoplossing en was opnieuw gedurende 30 seconden.
Verwijder voorzichtig de chip en droog deze gedurende één minuut in de afzuigkap. Scan de microarray-chip met een scanner met een resolutie van twee micrometer. Een signaalmappingsoftware werd gebruikt als interface om de verdeling van genormaliseerde log twee verhoudingen van mutant versus wild type signalen over acht chromosomen te analyseren.
Voor putatieve deleties wordt een waarde van de log twee verhouding gelijk aan of minder dan min twee punt vijf standaarddeviaties beschouwd. Segmentatieanalyse van de software toont een geschatte deletieregio van 22 kilobase op chromosoom vier, weergegeven in de grafiek. Analyse van de deletiegrenzen geflankeerd door de microarray-sondes
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de stappen voor het uitvoeren van een volledige genoom array-gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) analyse om kopienummervariaties in planten te identificeren, specifiek in Medicago truncatula. De methode is bijzonder nuttig voor onderzoekers die legume biologie en knobbelontwikkeling bestuderen.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Plant Genetica
- Vergelijkende Genomica
- Legume Biologie
Achtergrond
- Kopienummervariaties zijn cruciaal voor het begrijpen van genetische diversiteit.
- Fast neutron bombardement induceert mutaties in planten.
- Medicago truncatula dient als modelorganisme voor legume studies.
- Het identificeren van mutaties kan landbouwkundige vooruitgang helpen.
Doel van Studie
- Om kopienummervariaties in mutanten van Medicago truncatula te identificeren.
- Om onderzoek naar knobbelontwikkeling in leguminosen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van genetische mechanismen in planten te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Volledige genoom array-gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie (CGH).
- Verzamelen van bladweefsel van enkele planten.
- Bevrijden van monsters in vloeibaar stikstof voor bewaring.
- Analyse van kopienummervariaties in geïnduceerde mutanten.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle identificatie van deletiemutaties in mutanten.
- Gedeemstreerde gevoeligheid van de CGH-techniek.
- Bijgedragen aan inzichten in genetische regulatie van knobbelontwikkeling.
- Het protocol gevalideerd voor toekomstige onderzoekstoepassingen.
Conclusies
- Het CGH-protocol is effectief voor het bestuderen van genetische variaties in planten.
- Het identificeren van kopienummervariaties kan leiden tot vooruitgang in legume biologie.
- Deze methode kan worden toegepast op andere plantensoorten voor soortgelijke studies.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables rapid detection of copy number variations in plant mutants, supporting target validation in species not amenable to insertional mutagenesis. It provides a scalable approach for functional genomics in legume biology, facilitating hypothesis testing and phenotypic screening. The platform enhances predictive confidence in early discovery by characterizing structural variants that may influence gene function and pathway activity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying deletion and duplication events in target genes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct detection of structural variants in mutant collections.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking copy number changes to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated genomic DNA samples for downstream hybridization and quantitative signal analysis.
- Reproducibility: Standardizes labeling and hybridization conditions to ensure consistent copy number variation detection.
- Scalability: Enables high-throughput screening of mutant libraries using array-based comparative genomic hybridization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects mutant characterization to phenotypic validation in legume models, supporting biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene function by linking structural variants to nodulation pathways, reducing uncertainty in target validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming the presence and boundaries of deletion mutations in candidate genes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from mutant screening to lead identification, enabling rapid characterization of induced variants prior to functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying copy number alterations that may disrupt gene dosage or regulatory networks.
- Screening: Delivers quantitative log-two ratio outputs that allow comparison of mutant versus wild-type genomic profiles.
- Analytics: Enables segmentation analysis to define deletion borders and estimate variant size, aiding in precise variant calling.
- Translational Research: Connects genomic findings to phenotypic outcomes, such as nodulation defects, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for analyzing mutant populations across multiple plant species and mutagenesis strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by providing direct evidence of gene copy number changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized DNA labeling, hybridization, and washing protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on labor-intensive map-based cloning for mutant characterization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mutants with confirmed structural variants for further study.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction, labeling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to high-density genome arrays and hybridization ovens with precise temperature control.
- Necessitates standardized protocols for DNA quality and concentration to ensure comparable signal intensities.
- Involves handling of hazardous reagents such as acetonitrile, requiring fume hood use and personal protective equipment.
- Limited to species with available whole-genome microarray platforms; adaptation may be needed for non-model organisms.
