Name: Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer hoe u array-gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie toepast om kopie-nummer variaties te detecteren in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten. Deze methode ondersteunt onderzoek naar knolontwikkeling in peulgewassen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering van dit werk wordt geleverd ten dele door een subsidie van NSF plantenonderzoek genoom (IOS-1127155).

Opmerking: afbeelding 1 ziet u de vijf stappen voor de array CGH protocol. Ze zijn: 1) voorbereiding van plantaardig materiaal; 2) isolatie van DNA-monsters van hoge kwaliteit; 3) labelen en zuivering van DNA-monsters; 4) hybridisatie, wassen, en scannen van gehele genoom arrays; en 5) CGH data-analyse. M. truncatula hele genoom betegeling matrices bevatten een totaal 971,041 unieke oligo sondes gericht op meer dan 50.000 genen of modellen van het gen in het genoom (Zie tabel van materialen). De unieke sondes worden verdeeld ongeveer elke 150 basenparen (bp) in de exonic regio's en 261 bp in intronic gebieden van het genoom van M. truncatula.
 1. voorbereiding van plantaardig materiaal <ol><li>Scarify wild type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) en mutant zaden van de FN6191 met geconcentreerd zwavelzuur gedurende 8 minuten (Zie Tabel van materialen). Verwijderen en verwijderen van zwavelzuur aan een vloeibaar afval container.</li>
	<li>Zaden met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water Spoel driemaal.</li>
	<li>Oppervlak steriliseren zaden met 20% bleekwater oplossing gedurende 10 minuten</li>
	<li>Zaden met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water Spoel driemaal.</li>
	<li>Winkel zaden bij 4 ° C gedurende 3 dagen. Na vernalisatie, overdracht en ontkiemen van zaden in de bodem voor een week in de zaal van een groei met 16/8 uur licht/donker cyclus en 150 µE/m 2/s intensiteit licht.</li>
	<li>Overplanten zaailingen aan 1 gallon potten en ze groeien in een kas met 16/8 uur licht/donker cyclus, 150 µE/m 2/s lichtintensiteit voor drie tot vier weken. Verzamelen van monsters van het jonge blad van de planten voor DNA isolatie.</li>
</ol> 2. Isolatie van hoge kwaliteit DNA-monsters <ol><li>1 g van het jonge blad weefsel van een enkele plant nemen en het in vloeibare stikstof onmiddellijk bevriezen.</li>
	<li>Bevroren blad weefsel in vloeibare stikstof met een mortier en een stamper aan fijne poeder vermalen.</li>
	<li>Isoleren van genomic DNA met een DNA-isolatie kit (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Resuspendeer gezuiverd DNA-monsters in 50 µL van gesteriliseerde met autoclaaf dubbele gedeïoniseerd H 2 O (ddH 2 van O) of 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).</li>
	<li>Maatregel DNA concentraties met een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Evalueren 260 nm/280 nm en 260 nm/230 nm ratio's van de DNA-monsters. 
	Opmerking: Hoge kwaliteit DNA-monsters moeten een 260 nm/280 nm verhouding &#8805; 1.8 en een 260 nm/230 nm verhouding &#8805; 2.0.</li>
	<li>Verder evalueren DNA-monsters door draait ze in 1% agarose gel. 
	Opmerking: Hoge kwaliteit DNA-monsters moeten ultrahoog moleculair gewicht en moeten niet worden besmet door RNA. Idealiter moet de uiteindelijke concentratie van DNA-monsters ~ 150 ng/µL.</li>
</ol> 3. DNA Labeling en zuivering <ol><li>verdunnen 1 µg genomic DNA monsters met ddH 2 O tot een eindvolume van 20 µL in een centrifugebuis 500 µL.</li>
	<li>Toevoegen 5 µL van een willekeurige primer (Zie Tabel van materialen) aan de buis.</li>
	<li>Vortex kort de buis en leg het in een thermocycler Incubeer te denatureren van DNA bij 98 ° C gedurende 10 minuten</li>
	<li>De slang uit de thermocycler en zet het meteen op ijswater om te relaxen gedurende 5 minuten</li>
	<li>Voorbereiden twee labeling mixen zoals aangegeven in tabel 1.</li>
	<li>Voeg toe 25 µL van labeling mixen 1 en 2 op verwijzing DNA en monster DNA-buizen, respectievelijk.</li>
	<li>Meng de labeling mix en DNA door pipetteren driemaal en draai de buizen kort.</li>
	<li>Zet de buizen in een thermocycler te incuberen bij 37 ° C gedurende 2 uur, waarna bij 65 ° C gedurende 20 min naar de inactivering van de exo-Klenow enzym (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Toevoegen 430 µL 1 x TE buffer aan elke buis.</li>
	<li>Mix van de inhoud en de buizen kort draaien.</li>
	<li>Overdracht de oplossing in de buis in een kolom van de zuivering met een verzameling van 2 mL tube (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Centrifuge de zuivering kolom 14.000 x g gedurende 10 minuten</li>
	<li>Negeren van de pass through-oplossing.</li>
	<li>Toevoegen 480 µL 1 x TE buffer aan elke kolom.</li>
	<li>Centrifuge de kolom opnieuw 14.000 x g gedurende 10 minuten</li>
	<li>Negeren van de Pass Through-oplossing.</li>
	<li>Overbrengen van de gelabelde DNA-monster, dat op het onderste gedeelte van de kolom naar een nieuwe centrifugebuis blijft.</li>
	<li>Meten van de omvang van de gelabelde DNA-monster met behulp van een precisiepipet en het eindvolume brengen 80 µL met 1 x TE buffer.</li>
	<li>Meten van de concentratie van de gelabelde DNA-monster met behulp van een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Mengen van een gelijke hoeveelheid van gelabelde monster DNA en verwijst naar DNA en brengen het eindvolume 160 µL met 1 x TE buffer.</li>
	<li>Toevoegen 256 µL van 2 x kruising buffer, 50 µL van menselijk DNA van het Cot-1 en 50 µL van 10 × aCGH blokkerende agent (Zie Tabel van materialen) en meng ze door goed voor driemaal pipetteren.</li>
	<li>Draai de buizen kort en leg ze in een thermocycler aan Incubeer bij 98 ° C gedurende 10 minuten</li>
	<li>Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 20 minuten</li>
</ol> 4. Hybridisatie, wassen, en scannen van de genoom matrices <ol><li>vooraf warm de oven hybridisatie 67 ° C ten minste 4 uur vóór de aanvang van de hybridisatie.</li>
	<li>Plaats een pakking dia op de basis van een hybridisatie kamer.</li>
	<li>Load 490 µL van hybridisatie oplossing van stap 3.23 op de dia die pakking.</li>
	<li>Dekking van de dia van de pakking met een Medicago truncatula genoom microarray chip te vormen een hybridisatie kamer.</li>
	<li>Zetten de hybridisatie kamer covers en draai de kamer stevig met klemmen.</li>
	<li>Zet de geassembleerde hybridisatie kamer in de kruising oven en Incubeer bij 67 ° C voor 40-48 h.</li>
	<li>Voorbereiden drie dia afwas: twee met 250 mL buffer wassen ik bewaard bij kamertemperatuur en één met het wassen van de buffer II bewaard bij 37 ° C.</li>
	<li>Voorbereiden twee dia wassen van kruiken: één met 70 mL acetonitril en één met 70 mL stabilisatie en drogen oplossing; Bewaar beide in een zuurkast bij kamertemperatuur (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>De hybridisatie kamer Verwijder uit de oven en verwijder de kamer klemmen en cover.</li>
	<li>Verplaatsen de microarray chip- en pakking Schuif naar een schotel dia wassen met wash buffer ik en scheiden van de spaander van de dia deksel.</li>
	<li>Zet de microarray chip bij de tweede dia wassen schotel met was buffer ik en zachtjes circuleren de oplossing met een roer-bar op een plaat van de magnetische roer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten</li>
	<li>Overdracht de microarray chip naar de derde dia wassen met voorverwarmde wassen buffer II schotel en wassen het zachtjes met een roer-bar op een plaat van de magnetische roer bij 37 ° C gedurende 1 min.</li>
	<li>De microarray chip overbrengen in een dia pot met acetonitril in een zuurkast te wassen en wassen voor 30 s.</li>
	<li>De microarray chip overbrengen in een dia pot met stabilisatie wassen en drogen van de oplossing en wassen voor 30 s.</li>
	<li>Neem de chip langzaam en droog het voor 1 min.</li>
	<li>Scan de microarray chip met behulp van een scanner (Zie Tabel van materialen) onder 2 µm resolutie. Instellen van de parameters wilt opslaan meerdere afbeeldingen en hele dia scans. Kanalen 1 en 2 winsten op 100% instelt en annuleren van de automatische winst.</li>
</ol> 5. CGH gegevensanalyse <ol><li>Extract de Cy3 en Cy5 fluorescentie intensiteiten voor elke sonde op de array gebruikmakend van scansoftware (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Gebruik segmentatie analyse van de software te detecteren kopie aantal variaties (CNVs) tussen het monster DNA en DNA van de referentie. Een drempel van het segment gemiddelde log 2 monster/verwijzing verhouding ± 2,5 standaarddeviaties gebruiken voor het bepalen van CNVs.</li>
	<li>Inspecteren van de verdeling van de log 2 monster/verwijzing ratio's over het hele genoom gebruikend een signaal mapping software (Zie Tabel of Materials).</li>
</ol>

<ol><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genome+release+%28version+Mt4.0%29+for+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312(2014).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+H+%22Floriculture%2C+Ornamental+and+Plant+Biotechnology%3A+Advances+and+Topical+Issues%22">Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues</a>. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+components+of+the+ethylene-response+pathway+identified+in+a+screen+for+weak+ethylene-insensitive+mutants+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).</li>
<li>Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RGA+gene+encodes+a+transcriptional+regulator+repressing+the+gibberellin+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway.</a> Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).</li>
<li>Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleteagene%3A+a+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+gene+knockout+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants.</a> Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).</li>
<li>Bolon, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+genomic+analyses+of+a+fast+neutron+mutant+population+resource+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean.</a> Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).</li>
<li>Men, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43443373_Fast_Neutron_Mutagenesis_of_Soybean_Glycine_soja_L_Produces_a_Supernodulating_Mutant_Containing_a_Large_Deletion_in_Linkage_Group_H">Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H.</a> Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).</li>
<li>Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+deficiency+caused+by+fast+neutron+mutagenesis+of+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus.</a> J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+reverse+genetics+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants.</a> Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).</li>
<li>Bourcy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+DNF2+is+a+PI-PLC-XD-containing+protein+required+for+bacteroid+persistence+and+prevention+of+nodule+early+senescence+and+defense-like+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+phytol%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions.</a> New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dissected+leaf+morphology+by+a+Cys%282%29His%282%29+zinc+finger+transcription+factor+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).</li>
<li>Ge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+seed+size+and+quality+by+manipulating+BIG+SEEDS1+in+legume+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).</li>
<li>Kalo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+signaling+in+legumes+requires+NSP2%2C+a+member+of+the+GRAS+family+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators.</a> Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).</li>
<li>Oldroyd, G. E., Long, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nodulation-signaling+pathway+2%2C+a+gene+of+Medicago+truncatula+involved+in+Nod+actor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling.</a> Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+compound+leaf+development+in+Medicago+truncatula+by+fused+compound+leaf1%2C+a+class+M+KNOX+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene.</a> Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).</li>
<li>Tsujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+TOBAMOVIRUS+MULTIPLICATION+%28TOM%29+2+locus+encodes+a+transmembrane+protein+that+interacts+with+TOM1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1.</a> EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nodule-specific+protein+secretory+pathway+required+for+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis.</a> Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).</li>
<li>Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+array-based+comparative+genomic+hybridization+to+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics.</a> J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).</li>
<li>Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+shapes+genome-wide+patterns+of+copy-number+polymorphism+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster.</a> Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).</li>
<li>Gong, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+rapid+cloning+of+an+ion+accumulation+deletion+mutant+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).</li>
<li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+functional+impact+of+DNA+copy+number+variation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat.</a> Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).</li>
<li>Haun, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li>
<li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li>
<li>Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+%28oaCGH%29+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402(2007).</li>
<li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis%3A+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li>
<li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development%3A+Gene+identification+by+transcript-based+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li>
<li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381(2008).</li>
<li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expression+arrays+for+copy+number+detection%3A+an+example+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).</li>
<li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li>
<li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+esn1+defines+a+genetic+locus+involved+in+nodule+senescence+and+symbiotic+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation.</a> Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).</li>
<li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li>
<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

We hebben een arraygebaseerd CGH platform ontwikkeld voor de detectie en karakterisatie van snelle neutronen bombardement (FNB)-geïnduceerde mutanten in M. truncatula cv. Jemalong A17. Om aan te tonen het gebruik van de array CGH methode voor het opsporen van genmutaties, we aCGH analyse van de mutant FN6191, die tentoongesteld van een hyper-nodulatie fenotype in tegenstelling tot wild type planten, wanneer geënt met S. meliloti Sm1021uitgevoerd. Voor segmentatie analyse, werd een segment beschouwd als ...

Peulvruchten (Fabaceae) is de derde grootste familie van tweezaadlobbige planten, met vele economisch belangrijke soorten zoals sojabonen (Glycine max) en luzerne (Medicago sativa). Peulvruchten planten kunnen communiceren met stikstof-vaststelling bodem bacteriën, Rhizobium om root knobbeltjes waarin de atmosferische dinitrogen is gereduceerd tot ammoniak voor gebruik door de waardplant genoemd. Als zodanig, teelt van peulvruchten gewassen vereist weinig inbreng van stikstof meststoffen en draagt aldus bij aan duurzame landbouw. Peulvruchten gewassen produceren bladeren en zaden met een hoog eiwitgehalte, bijeenkomen uitstekend ruwvoer en graan gewassen. Gecultiveerde peulvrucht soorten hebben echter over het algemeen complex genoom structuren, functionele studies van genen die spelen een sleutelrol in peulvruchten-specifieke processen omslachtig maken. Medicago truncatula is wijd goedgekeurd als een soort model voor peulvruchten studies vooral omdat (1) het heeft een diploïde genoom met een relatief kleine haploïde genoom grootte (~ 550 Mbp); (2) planten kunnen stabiel worden omgezet voor gene functionele studies; en (3) het is nauw verwant aan alfalfa (M. sativa), de koningin van voedergewassen en vele andere economisch belangrijke gewassen voor translationeel onderzoek. Onlangs, het genoom van M. truncatula cv Jemalong A17 geweest vrijgegeven1,2. Annotatie van het genoom laat zien dat er meer dan 50.000 voorspelde genen of modellen van het gen in het genoom. Om te bepalen van de functie van de meeste van de genen in de M. truncatula is genoom een uitdagende taak. Ter vergemakkelijking van functionele studies van genen, een uitgebreide verzameling van mutanten in het bereik van meer dan 150.000 M1 lijnen is gegenereerd met behulp van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snelle neutronen, een energierijke ionisatie mutageen, is gebruikt bij het genereren van mutanten in vele plantensoorten met inbegrip van Arabidopsis5,6, rijst (Oryza sativa)7, tomaat (Solanum lycopersicum), sojabonen (Glycine soja; G. max)8,9, gerst (Hordeum vulgare), en Lotus japonicus10. Een groot deel van mutaties afgeleid van FNB mutagenese zijn als gevolg van DNA deleties die variëren in grootte van een paar basenparen op mega basenpaar9,11. Vele fenotype-geassocieerde genen met succes zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. eerder, moleculaire klonen van de onderliggende genen van FNB mutanten vertrouwd op een kaart gebaseerde benadering, die is tijdrovend en beperkt het aantal mutanten te worden gekenmerkt op moleculair niveau. Onlangs, verscheidene gratis benaderingen, met inbegrip van transcriptie gebaseerde methoden, genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) voor DNA kopie nummer variatie detectie, en hele genoom sequencing, plavuizen zijn tewerkgesteld te vergemakkelijken de karakterisering van schrapping mutanten in verschillende organismen, met inbegrip van dieren en planten20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Om te vergemakkelijken de karakterisatie van FNB mutanten in M. truncatula, een geheel-genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) is platform ontwikkeld en gevalideerd. Zoals gemeld in dierlijke systemen, maakt het platform CGH arraygebaseerd de ontdekking van kopie aantal variaties (CNVs) op het niveau van de hele genoom in M. truncatula FNB mutanten. Bovendien, letsels kunnen worden bevestigd door PCR en schrapping grenzen kunnen worden geïdentificeerd door sequentiebepaling. Over het geheel genomen is de matrix CGH platform een efficiënte en effectieve hulpmiddel bij het identificeren van de laesies in M. truncatula FNB mutanten. Hier, worden de matrix CGH procedure en PCR karakterisering van schrapping grenzen in een M. truncatula FNB mutant geïllustreerd.
Het volgende protocol voorziet experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van volledige genoomanalyse arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) van exemplaaraantal variaties in planten. Als voorbeeld, werd Medicago truncatula FN6191 mutant gebruikt om te identificeren schrapping regio's en de kandidaat-genen mutant fenotypen is gekoppeld. M. truncatula FN6191 mutant, oorspronkelijk geïsoleerd van een snelle neutronen schrapping bombardement-geïnduceerde gemuteerde collectie32 (Zie Tabel of Materials), een hyper-nodulatie fenotype tentoongesteld na inoculatie met de bodem bacterie, Sihorhizobium meliloti heeft Sm1021, in tegenstelling tot wild type planten.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula genoomarray, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td><td>In house</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (referentie)</td><td>In house</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag DNA Labeling Kit</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Willekeurige primer</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Stabilisatie- en droogoplossing</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip hybridisatiekit</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatiekamer, roestvrij staal</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatie oven</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Zuiveringskolommen</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Laserscanner</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>Signal Map 1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>Signalmap1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

een array gebaseerde vergelijkende genomic hybridisatie platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde medicago truncatula mutanten

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutanten zijn onschatbare waarde genetische hulpbronnen voor gene functie studies. Voor het genereren van mutant collecties, kunnen drie soorten mutagene agentia worden gebruikt, met inbegrip van biologische zoals T-DNA of transposon, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) chemische of fysische zoals ionisatie straling. Het soort mutatie waargenomen varieert afhankelijk van de mutagene stof gebruikt. Mutaties omvatten ionisatie straling geïnduceerde mutanten, verwijdering, duplicatie of omlegging. Terwijl T-DNA of op basis van transposon mutagenese beperkt tot de soorten die vatbaar voor transformatie is zijn, kan chemische of fysische mutagenese worden toegepast op een breed scala van soorten. De karakterisering van mutaties afgeleid van chemische of fysische mutagenese traditioneel is echter afhankelijk van een kaart-gebaseerde klonen benadering die arbeid intensief en tijdrovend is. Hier, laten we zien dat een high-density genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) platform kan worden toegepast om efficiënt detecteren en karakteriseren van kopie aantal variaties (CNVs) in mutanten afgeleid van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in Medicago truncatula, een peulvrucht soorten. Volledige genoomanalyse van de reeks toont aan dat er meer dan 50.000 genen of gene modellen in M. truncatula. Bij de huidige, FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula zijn afgeleid van meer dan 150.000 M1 lijnen, die van onschatbare waarde plantgenetische hulpbronnen voor functionele studies van genen in de genoom. Het platform van de aCGH hier beschreven is een doeltreffend instrument voor het karakteriseren van FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula.

Figuur 2 geeft de distributie van genormaliseerde log2 verhoudingen van mutant versus WT signalen over het hele genoom. Analyse van CGH gegevens bleek benaderend 22 kb schrapping op chromosoom 4, die de gehele SUNN gene33 en diverse andere omvat geannoteerde genen in de mutant FN6191 (Figuur 2, Figuur 3). De kandidaat-verwijderde regio werd gecoverd door 73...

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Het algemene doel van dit array-gebaseerde protocol voor comparatieve genomische hybridisatie is om snel kopienummervariaties te identificeren in mutanten van de legumplant Medicago truncatula die zijn geïnduceerd door bombardement met snelle neutronen. Deze methode helpt om belangrijke vragen in het veld van legumbiologie te beantwoorden. Zoals het vergemakkelijken van de identificatie van empathogenen op een lage site die betrokken is bij het reguleren van knobbeltjesontwikkeling bij legums.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het van hoog aanzien is en gevoelig is in het detecteren van kopienummervariaties zoals deletiemutaties in de neutronenbombardement mutanten van de legumplant Medicago truncatula. Ik zal samen met Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows uit het Genetic Lab, deze procedure demonstreren. Vries snel een gram jong bladweefsel, verzameld van enkele planten, in vloeibare stikstof.Gebruik vervolgens een vijzel en stamper en maal het bevroren bladweefsel tot fijn poeder in de vloeibare stikstof. Gebruik een DNA-isolatiekit om de wild type en mutante genomische DNA-monsters uit het fijne poeder te extraheren. Gebruik 500 microliter centrifugeerbuisjes om

an-array-based-comparative-genomic-hybridization-platform-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

In dit artikel presenteren we het protocol dat wordt beschreven als High-Resolution smelt analyse (HRM) gebaseerde doel geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING). Deze methode maakt gebruik van fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex en is geschikt voor screening met hoge doorvoer van zowel inbrengen/deletie (Indel) als single base substition (SBS).

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

Leer hoe u array-gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie toepast om kopie-nummer variaties te detecteren in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten. Deze methode ondersteunt onderzoek naar knolontwikkeling in peulgewassen.

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten (Video) | JoVE Journal

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Meer video's verkennen