Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium
16 januari 2018
Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.
Het algemene doel van dit experiment is om eiwittransportroutes in primaire cilia te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het cilia-gebied, zoals verschillen in eiwittransportroutes in normale en functioneel gestoorde cilia. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze voldoende resolutie heeft om subdiffractie-eiwittransportroutes in levende cellen te zien.
Om te beginnen, ontdooi ingevroren voorraad van speciaal ontworpen NIH-3T3-cellen op 37 graden Celsius, anderhalve week voor het experiment. Breng de ontdooide cellen over naar een 25 centimeter vierkante celkweekkolf met drie milliliter voorverwarmd medium. Houd de cellen op 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator.
Kweek de cellen tot ze 80% confluency bereiken en splits de cellen dan. Om de cellen te splitsen, trypsiniseer ze met 0,25% Trypsine gedurende twee minuten op 37 graden Celsius. Na de korte incubatie, zuig de trypsine weg en vervang het met twee milliliter voorverwarmd kweekmedium.
Pipet het medium om eventuele celclusters te breken, verwijder dan 75% van de cellen uit de kolf en breng het totale volume medium terug op drie milliliter. Splits de cellen minstens drie keer vóór het experiment om de homogeniteit van hun celcyclus te garanderen. Twee dagen voor het experiment, splits de cellen en plateer ze 60-70% confluency op een 35 millimeter glazen bodemplaat met 1,5 milliliter van hetzelfde kweekmedium.
Vervolgens, een dag voor het experiment, transfecteer de cellen chemisch met de gewenste plasmide. Meng 500-1000 nanogram van het plasmide in een een-op-2,5 verhouding met transfectiemiddel en 0,25 milliliter gereduceerd serummedium zonder antibiotica gedurende 30 minuten. Zodra het transfectiecomplex is gevormd, zuig het medium uit de 35 millimeter glazen bodemplaat en vervang het met het 0,25 millimeter transfectiemengsel en een extra 1,25 millimeter gereduceerd serummedium zonder antibiotica en plaats de plaat terug in de incubator.
Voor cellen met extern gelabeld SSTR3-construct, verwijder het medium van de glazen bodemplaat een uur voor het experiment. Was de cellen vijf keer met één milliliter PBS en voeg één milliliter gereduceerd serummedium toe dat is aangevuld met één micromolar Alexa 647-geconjugeerd streptavidin. Niet meer dan 15 minuten voor het experiment, verwijder het medium van de glazen bodemplaat en was de cellen vijf keer met één milliliter PBS.
Voeg vervolgens één milliliter van de beeldbuffer toe aan de glazen bodemplaat. Bevestig de glazen bodemplaat aan de stage in de microscoop. Zoek een GFP-expressiecel met behulp van de GFP-filterset en lokaliseer een cel die SSTR3-GFP goed tot expressie brengt in een primaire cilia.
Zodra een geschikte cel is gevonden, lijn de NPHP4-mCherry-stip aan de basis van de primaire cilia uit met de locatie op het beeldvlak die overeenkomt met de enkelpuntsverlichting van de laser. Gebruik de snap-functie in het cameratabblad van het focuscontrolevenster om een epifluorescentiebeeld van NPHP4-mCherry en SSTR3-eiwitten te maken die zijn gelabeld met groen fluorescerend eiwit. Zodra de referentiebeelden zijn verkregen, verlaag lokaal de concentratie van gelabelde enkele moleculen door de overgangszone 20 seconden lang met een laserverlichting van één milliwatt te fotobleken.
Om voor te bereiden op het volgen van enkele moleculen, verlaag het laserverlichtingsvermogen tot 0,5 milliwatt voor moleculen gelabeld met Alexa 647. Stel de versterking en intensificatie op maximaal en de beeldsnelheid op twee milliseconden. Klik vervolgens op de stream-knop in het cameratabblad van het focuscontrolevenster en activeer de geschikte verlichtingslaser.
Neem de niet-fotogebleekte gelabelde enkele moleculen op terwijl ze door het fotogebleekte gebied van de overgangszone worden getransporteerd. En vergeet niet om niet meer dan twee minuten video op te nemen om de effecten van ciliair drijfvermogen te voorkomen. Na het vastleggen van de enkele moleculen, verwerk de video's met behulp van een 2D Gauss-aanpassingsalgoritme, zoals Glimpse van het Gelles-lab, dat precies het centrum van het excitatiepunt, de spreidingsfunctie en een omvattend gebied van interesse van elke enkele molecuul lokaliseert.
Selecteer ten slotte alle enkele molecuullocaties met een nauwkeurigheid van beter dan 10 nanometer en corrigeer het centrum van de cilia op basis van de verdeling van enkele molecuullocaties die zijn aangepast aan een 2D Gauss-functie. Zoals beschreven in deze video, kan enkelpuntsverlichting worden gebruikt om een AF647-gelabeld SSTR3-molecuul te volgen door de overgangszone gemarkeerd door NPHP4-mCherry. Voor data-analyse is het superimposeren van de enkele molecuulvideo op de brede veldverlichting een nuttige validatiestap om ervoor te zorgen dat de laser goed is uitgelijnd en dat er een adequate signaal-ruisverhouding is.
Hier afgebeeld is een cel met een primaire cilium geïdentificeerd door de kleuring. IFT20 is een component van het intraflagellaire transportcomplex dat vracht vervoert langs microtubuli in primaire cilia, gemarkeerd door Arl13b-mCherry. Eenmaal geïdentificeerd, wordt snelheidsmicroscopie gebruikt om individuele IFT20-GFP-eiwitten te volgen.
Vervolgens wordt een 2D naar 3D transformatiealgoritme gebruikt om de ruimtelijke waarschijnlijkheidsdichtheidverdeling van het eiwit in primaire cilia langs een enkele dimensie te produceren. Dit hoge dichtheidsgebied localiseert waarschijnlijk met de axonemale microtubuli in overeenstemming met de bekende locatie van de intraflagellaire transportroute. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het monster nauwkeurig uit te lijnen met de laser om systematische fouten te minimaliseren.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkele moleculaire tracking kunt doen met snelheidsmicroscopie en u zult weten hoe u enkele moleculaire transportroutes in primaire cilia kunt verkrijgen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het in kaart brengen van de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van eiwittransportroutes in primaire cilia met behulp van superresolutiefluorescentiebeeldvorming. De experimentele opstelling en gegevensanalyses worden gedetailleerd beschreven om inzicht te geven in eiwittransport in levende cellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Fluorescentiebeeldvorming
Achtergrond
- Primaire cilia spelen een cruciale rol in cellulaire signalering.
- Het begrijpen van eiwittransportroutes kan verschillen tussen normale en disfunctionele cilia onthullen.
- Hoogwaardige beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van deze processen in levende cellen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het bredere begrip van ciliaire functie en disfunctie.
Doel van de studie
- Om eiwittransportroutes in primaire cilia te identificeren.
- Om verschillen in transportroutes tussen normale en disfunctionele cilia te onderzoeken.
- Om een nieuwe beeldvormingstechniek toe te passen voor verbeterde resolutie in levende celstudies.
Gebruikte methoden
- 3D superresolutiefluorescentiebeeldvorming.
- Voorbereiding van NIH-3T3 cellen voor levende beeldvorming.
- Ontdooien en kweken van cellen in gecontroleerde omstandigheden.
- Gegevensanalyse om eiwittransportroutes in kaart te brengen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol in kaart brengen van eiwittransportroutes in levende primaire cilia.
- Identificatie van belangrijke verschillen in transportroutes onder verschillende omstandigheden.
- Demonstratie van de effectiviteit van de beeldvormingstechniek.
- Inzichten in de dynamica van eiwittransport in cilia.
Conclusies
- De studie biedt een nieuw perspectief op eiwittransport in primaire cilia.
- Hoogwaardige beeldvorming kan kritische inzichten in ciliaire functie onthullen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om ciliaire disfunctie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
