Name: Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Verken superresolutie-fluorescentiemicroscopie voor het in kaart brengen van eiwittransportroutes in levende primaire cilia van NIH-3T3-cellen. Deze methode onthult subdiffractie-dynamica essentieel voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Kristen Verhey (Universiteit van Michigan, Ann Arbor) en Dr. Gregory Pazour (medische faculteit van de University of Massachusetts) voor het verstrekken van sommige plasmiden. Het project werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 en GM122552 naar W.Y).

1. NIH-3T3 cel voorbereiding voor snelheid microscopie uit voorraad
<ol><li>1,5 weken vóór het experiment, een nieuwe cultuur van NIH-3T3 cellen herstellen uit een bevroren voorraad door ontdooien bij 37 ° C en de overdracht van de cellen in een maatkolf van 25 cm2 cel cultuur met 3 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 110 mg/mL natrium pyruvaat, 2 mM glutamine, foetale runderserum 10% en 1% penicilline/streptomycine.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Splitst u cellen op 80% confluentie, ongeveer elke twee dagen, ten minste driemaal voor experimentele dag om de homogeniteit van de celcyclus. Trypsinize cellen met 0,25% trypsine gedurende 2 minuten bij 37 ° C, gecombineerd trypsine en 2 mL medium te vervangen. Pipetteer het medium om breken van clusters van de cel, het gewenste aantal cellen verwijderen en totale hoeveelheid media brengen terug tot 3 mL. Opmerking: NIH-3T3 waren eerder genetisch gemanipuleerde om uit te drukken van NPHP-4, een eiwit dat de TZ26 lokaliseert, gesmolten in het C-terminus aan mCherry. mCherry is een fluorophore die kan worden opgewekt met 561 nm verlichting aan de TZ selectiviteit barrière kwantitatief te lokaliseren en oriënteren van de primaire cilia.</li>
	<li>Twee dagen voor het experiment, plaat de cellen in een 35 mm glazen bodem schotel op 60-70% confluentie met 1,5 mL hetzelfde medium als stap 1.1 en de cellen terug naar de incubator.</li>
	<li>Één dag voor het experiment, chemisch transfect de cellen met de gewenste plasmide. Meng 500-1000 ng van de gewenste plasmide (Zie de Opmerking hieronder) in een verhouding van de 1:2.5 met transfectiereagens in 0,25 mL verminderde serum media zonder antibiotica voor 30 min. Aspirate media uit de 35 mm glas onder schotel en het vervangen van de plasmide 0,25 mL / transfectie reagens mengeling plus een extra 1,25 milliliters verminderde serum media zonder antibiotica. Verminderde serum media heeft tot doel te vergemakkelijken van een geslaagde transfectie, inducerende primaire cilia groei, evenals het levend houden van de cellen lang genoeg voor het uitvoeren van experiment. Cellen aan de incubator voor het experiment op de volgende dag retourneren. Opmerking: Bij het uitvoeren van single-molecuul tracking van IFT20, een plasmide met die een genetisch gemodificeerde IFT20 in de C-terminus aan GFP gesmolten gebruikte25is. Bij het uitvoeren van single-molecuul volgen van SSTR3, een plasmide dat met een genetisch gemodificeerde SSTR3 gesmolten in de N-terminus een acceptor peptide (AP)-domein en C eindpunt aan GFP is gebruikte22. Naast de SSTR3-constructie, een plasmide met de Biotine ligase BirA moet mede worden uitgedrukt en de transfectie media moet worden aangevuld met 10 µM biotine. Biotine BirA vervolgens gekoppeld aan het domein van de AP van de nieuw samengestelde AP-SSTR3-GFP moleculen op het niveau van de ER. Alexa647 geconjugeerd met drie van de vier Biotine-bandplaatsen op daar, gemiddeld, kan vervolgens worden aangevuld tot de media voorafgaand aan imaging fluorescently label de AP-SSTR3-GFP moleculen op het buitenoppervlak van de cel22,27 . GFP en AlexaFluor647 worden gebruikt bij deze methode; andere tl sondes kunnen echter worden gebruikt als ze ook hebben hoge foto-stabiliteit en quantum opleveren.</li>
	<li>Als met behulp van de extern-label SSTR3 constructie, verwijderen de media van de glazen bodem schotel 1 h voor experiment, wassen van de cel 5 keer met 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1 mL van verminderde serum media aangevuld met 1 µM Alexa647 geconjugeerd daar.</li>
	<li>Niet meer dan 15 minuten voordat het experiment, verwijder medium van de glazen bodem schotel en wassen van de cellen transfected en gelabelde 5 keer met 1 mL PBS.</li>
	<li>1 mL van imaging buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) in de glazen bodem schotel plaatsen. Opmerking: In de beeldvorming buffer, cellen zijn levensvatbaar is voor niet langer dan 3 h. Daarom worden slechts 2 h van experimenten uitgevoerd op elk gerecht.</li>
</ol>2. snelheid microscopie
Opmerking: De snelheid microscopie setup bevat een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 1.4-NA 100 × olie-immersie apochromatische doelstelling, een 35 mW 633 nm hij-Ne laser, 50 mW vaste toestand 488-nm en 561-nm lasers, een winst op de chip vermenigvuldiging Charge-combinatie-apparaat camera en een Microscoop softwarepakket dat voor data acquisitie en verwerking (Figuur 1). Voor individueel kanaal imaging, GFP, mCherry en Alexa647 zijn opgewonden door 488 nm, 561 nm of 633 nm lasers, respectievelijk. Voor één molecuul volgen, wordt aanspreekpunt verlichting gebruikt voor het bijhouden van de individuele fluorescently gelabelde moleculen. Voor epifluorescence imaging, is een concave lens geplaatst in de laser verlichting pad naar het uitbreiden van de lichtbundel naar een uniforme gebied van verlichting. De fluorescentie-emissies zijn verzameld door de dezelfde doelstelling, gefilterd door een dichroïde filter (405/488/561/635) en een uitstoot-filter (405/488/561/635) en beeld met de bovenstaande CCD camera op 500 Hz voor enkel molecuul tracking of 2 Hz voor epifluorescence imaging.
<ol><li>Brengt de glasplaat van de bodem tot het stadium van de Microscoop en ga naar een cel die is de gewenste constructies goed uiten. Zodra een geschikt cel is gevonden, de NPHP4-mCherry plek aan de voet van de primaire cilia met de locatie op de imaging vliegtuig dat correspondeert met de laser's aanspreekpunt verlichting uitlijnen</li>
	<li>Opname van een epifluorescence van NPHP4-mCherry en IFT20-GFP of AP-SSTR3-GFP gebruikend de "Module"-functie in de "Camera" tabblad van het venster "Focus" als het softwarepakket digitale microscopie (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Deze beelden zal fungeren als een referentie voor de latere enkel molecuul locaties.</li>
	<li>Zodra de verwijzing beelden worden verkregen, lokaal verminderen de concentratie van gelabelde afzonderlijke moleculen. Foto-bleekmiddel de TZ met 1 mW laser verlichting voor 20 s of totdat de intensiteit van de fluorescentie dicht bij die van achtergrond fluorescentie is. Opmerking: Wanneer de exacte concentratie kan worden gecontroleerd, 0,1-1 nM label van afzonderlijke moleculen worden gebruikt.</li>
	<li>Ter voorbereiding van een enkel molecuul bijhouden, verminderen de laser verlichting op ~0.15 mW voor afzonderlijke moleculen aangeduid met GFP of ~0.5 mW voor moleculen aangeduid met Alexa647.</li>
	<li>Zodra de kracht van de laser en imaging parameters ingesteld, maximale winst en intensivering en 2 ms framesnelheid zijn, voor enkel molecuul imaging, gaan de juiste verlichting laser en opnemen van niet-photobleached, afzonderlijke moleculen aangeduid als ze worden vervoerd door de photobleached van de TZ door te klikken op de knop "Stream" in de "Camera" tabblad van het venster "Focus". Opmerking: Niet meer dan 2 min van video moet worden vastgelegd om te minimaliseren van de effecten van Ciliaire drift naar een te verwaarlozen niveau.</li>
	<li>Na het vastleggen van de video van één molecuul, verwerken van de video's met behulp van een 2D Gaussian montage-algoritme, zoals glimp door de Gelles Lab, die juist het zwaartepunt van elke één molecuul excitatie PSF in een omvattende ruimte van belang (AOI lokaliseert).</li>
	<li>Selecteer alle enkel molecuul locaties met precisie < 10 nm en het centrum van cilia gebaseerd op distributie van één molecuul locaties uitgerust met een 2D Gauss functie te corrigeren. Opmerking: Met behulp van 2D naar 3D-transformatie-algoritme, de 3D transportroutes van IFT20-GFP en AP-SSTR3 routes worden duidelijk weergegeven op Ciliaire axonemal of Ciliaire membraan, respectievelijk.</li>
</ol>3. 2D naar 3D-transformatie
<ol><li>Zodra de verschillende taalversies van de duizend voor doorvoer van moleculen (signaal-ruis verhouding > 11) in de cilium worden verzameld, selecteer de lengteas van de cilium als de X-dimensie. Maken van een histogram Y dimensie van de locaties en het verkrijgen van de bedragen van de bin in stappen van 10 nm. Opmerking: De 2D naar 3D-transformatie kan worden geëvalueerd door hand of software of programmeertaal. De auteurs hebben de transformatie geïmplementeerd in zowel Matlab en Python 2.7.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li>
<li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li>
<li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li>
<li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+transition+zone%3A+from+morphology+and+molecules+to+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li>
<li>Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li>
<li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope%3A+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639(2010).</li>
<li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%3A+tuning+in+to+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li>
<li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li>
<li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096(2015).</li>
<li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li>
<li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li>
<li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li>
<li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+to+the+ciliary+membrane%3A+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654(2013).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li>
<li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li>
<li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dit protocol beschrijft de toepassing van de microscopie van de snelheid op de primaire cilium, een cellulaire signalering organelle dat is sterk afhankelijk van efficiënte Eiwittransport. SNELHEID microscopie bieden hoge resolutie (< 10 nm) locaties voor fluorescently gelabelde moleculen als ze de aanspreekpunt verlichtingssterkte gecentreerd op de TZ passeren. Het is eerder toegepast om te bestuderen van de proteïne die handel tot en met de NPC6,7,<s...

Omdat verklaarde door Ernst Abbe in 1873, heeft de resolutie van de lichte microscopie van conventionele is geloofd te worden beperkt tot ongeveer 200 nm als gevolg van lichte diffractie van de objectieve1,2. Momenteel super resolutie de lichte microscopie technieken breken deze beperking en toestaan dat de vangst van dynamische afbeeldingen met een resolutie van de sub diffractie (< 200 nm). De technieken in het algemeen vallen in twee brede categorieën: gestimuleerd emissie uitputting (STED) microscopie gebaseerde benaderingen, die sub diffractie verlichting volume als gevolg van niet-lineaire optische reactie van fluorophores te in monsters3 genereren; en de lichte microscopie van photoactivated (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)-op basis van super resolutie technieken, die gebruik maken van wiskundige functies om de centroids van fluorophores te lokaliseren en vervolgens reconstrueren deze centroids naar formulier super resolutie beelden4,5. Momenteel, als gevolg van de relatief ongecompliceerde optische setup, zijn PALM en STORM uitgebreid werkzaam bij slechts een kleine ondergroep van fluorophores in elk frame van een lange video van een biologische preparaat te activeren. Dit zorgt voor de nauwkeurigere lokalisatie door 2D Gaussian aanbrengen van fluorescerende plaatse genoemd van het punt verspreiden functie (PSV), van fluorescently gelabelde proteïnen in elk frame van de video. De 2D locatie van elke fluorescently gelabelde molecuul kan vervolgens worden bovenop een enkele imaging vliegtuig naar een super-resolutie afbeelding van de biologische voorbereiding1,2te produceren. Terwijl de lokalisatie van deze single-molecuul, super resolutie benaderingen van microscopie zeker een revolutie teweeggebracht in hoe beeldvorming van biologische monsters werd uitgevoerd, zijn er nog uitdagingen moeten worden overwonnen. Bijvoorbeeld, kunnen STORM en PALM bereiken hun beste ruimtelijke resoluties na fixatie van biologische monsters en dus een statische weergave van de fluorescently gelabelde proteïnen, die is een soortgelijke beperking van elektronenmicroscopie. Bovendien, om te bereiken hoge ruimtelijke resolutie voor elke fluorescently-geëtiketteerden proteïne in levende cellen, moeten monsters worden beeld bij zeer lange framerates die niet kunnen vangen van eiwit dynamiek. Daarom moet deze belangrijkste technische hindernissen overwinnen.
Voor het verkrijgen van een hoge Spatio resolutie die is geschikt voor het opsporen van snelbewegende proteïnen of RNAs in levende cellen, hebben we super resolutie snelheid microscopie in ons laboratorium (Figuur 1)6,7, 8. verschillende grote technische vooruitgang in snelheid microscopie hebben eerder ingeschakeld ons om bij te houden met succes nucleocytoplasmic vervoer van kleine molecules, eiwitten, mRNA en virus via native nucleaire porie complexen (NPC)6, 7 , 8. kort, de volgende functies van snelheid microscopie worden gebruikt voor het bijhouden van snelbewegende macromoleculen via sub micrometer rotatie symmetrische structuren in levende cellen, zoals NPC's en primaire cilia: (1) een geneigd of een verticale verlichting PSF maakt de excitatie van afzonderlijke moleculen binnen een kleine diffractie-limit volume in het brandvlak (Figuur 1); (2) de geneigd PSF kan sterk voorkomen out-of-focus fluorescentie en dus de signal-to-noise verhouding te verbeteren. (3) de optische dichtheid van 100-500 kW / cm2 in de verlichting PSF maakt duizenden fotonen worden verzameld uit één fluorophores met snelle detectie snelheden (> 500 Hz). (4) de snelle detectie snelheid vermindert ook aanzienlijk de single-molecuul ruimtelijke lokalisatie fout (< 10 nm) bij het bepalen van de ruimtelijke trajecten van fluorescerende moleculen bewegen in levende cellen, omdat Moleculaire diffusie een van de belangrijkste factoren is veroorzaakt door onvolkomenheden van single-molecuul lokalisatie voor het bewegen van moleculen. (5) bekendere 2D naar 3D-transformatie-algoritmen kunnen wij leveren 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor moleculen in de NPC of de primaire cilium. Het is opmerkelijk dat onze conversieproces tussen de cartesiaanse en de cilindrische coördinatiesysteem wordt gebruikt voor het genereren van een 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaart in plaats van 3D single-molecuul tracking (Figuur 2). Eerder, elektronenmicroscopie gegevens is gebleken dat de NPC9,10 en de primaire cilium11 beide een rotatie symmetrische structuur hebben. In principe moeten willekeurig verspreiden moleculen bewegen door de NPC of primaire cilium ook rotatie symmetrische distributies. Zoals blijkt uit Figuur 2, een groot aantal willekeurig verspreiden moleculen in de cilinder rotatie symmetrische distributies op de dwarsdoorsnede bekijken als die zou genereren in de NPC, verder resulterend in een ongeveer eenvormige ruimtelijke distributie binnen elke zeer kleine subregio tussen twee naburige ringen(Figuur 2). Deze uniforme verdeling leidt dat de ruimtelijke spreiding langs θ dimensie in het cilindrische systeem constant is. Vervolgens kunnen de 3D-coördinaten (X, R, θ) worden vereenvoudigd om de 2D-coördinaten (R, X, constante). Eigenlijk is onze conversieproces tussen de Cartesische en cilindrische systemen van 2D (X, Y) aan 2D (R, X, constante). De constante θ, verwijst naar de ruimtelijke dichtheid p in Figuur 2E, wordt berekend met behulp van de vergelijking A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Uiteindelijk, single-molecuul tracking heeft een brede toepassing in biologisch onderzoek, dus het is logisch dat een overvloed aan technieken worden ontwikkeld om te vullen specifieke biologische niches12,13,14. Dit is het geval met snelheid microscopie. Eerder, wanneer in combinatie met een 3D-transformatie-algoritme, deze techniek werd ontwikkeld om op te lossen 3D transportroutes van doorvoer van de moleculen door de NPC's, een sub-diffraction en middelgrote rotatie symmetrische biologische structuur-6. In dit document, zijn primaire cilia uitstekende model organellen zo goed aangetoond. Primaire cilia zijn cilinder-, antenne-achtige organellen (~ 125 nm radius) dat van het oppervlak van de meeste zoogdieren cellen15,16,17 project. Zij zijn verantwoordelijk voor het ontvangen van externe signalen en verzenden van een intracellulair reactie meestal verband met groei en metabolisme15,16. Daarom, flux van structurele proteïnen, recycling van transmembraan receptors, en doorgeven van intracellulaire boodschappers zijn essentiële verantwoordelijkheden van primaire cilia. Bij het verbindingspunt tussen de primaire trilharen en de cel lichaam is een kritische selectiviteit barrière, genaamd de overgangszone of TZ, waardoor alle dit eiwit transport11,18,19, moet voorkomen 20. Naast de gating functie van de TZ, worden ten minste twee transportprocessen, intraflagellair vervoer en passieve diffusie, verondersteld te zijn die verantwoordelijk zijn voor het verkeer van eiwitten door middel van deze regio16,21, 22. vanuit een oogpunt van de menselijke gezondheid, het verlies van primaire cilia en verdere deregulering van de stroomafwaartse signalering is kenmerkend voor veel kankers. Daarnaast zijn veel genetische ziekten, zoals het syndroom van Bardet-Biedl en polycysteuze nierziekte, geassocieerd met defecte eiwit vervoer23. Zowel de grootte van het beperken van de sub diffractie en het complexe proces van selectieve eiwit transport via de TZ maken de primaire cilia een belangrijk doelwit voor deze techniek. In deze paper methoden zullen we laten zien dat het volgen van een Ciliaire transmembraan eiwit, Somatostatine receptor 3 (SSTR3)24, extern gelabeld met Alexa Fluor 647 en een onderdeel van IFT, IFT2025, gemarkeerd met een gesmolten GFP-molecuul.

<table><tbody><tr><td>25 cm2 weefselkweekschaaltje</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodemschaaltje</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-geconjugeerd streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He-Ne laser</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100&times; olie-immersie apochromatisch objectief</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100&times;</td><td></td></tr><tr><td>On-chip vermenigvuldigingsversterker gekoppelde-apparaatcamera</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>Dichroische filter</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilter</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>digitale microscopiesoftware</td></tr></tbody></table>

toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire cilium

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

De primaire cilium is een uitsteeksel microtubulus-gebaseerd op het oppervlak van vele eukaryotische cellen en een unieke aanvulling van eiwitten bevat die functie kritisch in cel beweeglijkheid en signalering. Aangezien cilia niet in staat hun eigen eiwit synthese zijn, moeten bijna 200 unieke Ciliaire eiwitten worden verhandeld tussen het cytosol en primaire cilia. Het is echter nog steeds een technische uitdaging om driedimensionale (3D) locaties van vervoer trajecten voor deze proteÃ¯nen in levende primaire cilia vanwege de beperkingen van de huidige kaart technieken. Om te veroveren de uitdaging, hebben onlangs we ontwikkeld en ingezet een snelle virtuele 3D super resolutie microscopie, zogenaamde single-punts rand-excitatie microscopie van de sub diffractie (snelheid), om de 3D ruimtelijke locatie van vervoer opleidingstrajecten te bepalen beide cytosolische en membraaneiwitten in primaire cilia van levende cellen. In dit artikel zullen we laten zien van de gedetailleerde opzet van snelheid microscopie, de voorbereiding van cellen uiten fluorescentie-eiwit-geëtiketteerden Ciliaire eiwitten, de real-time tracking van de single-molecuul van afzonderlijke proteÃ¯nen in levende cilium en de verwezenlijking van 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor Ciliaire eiwitten.

Deze sectie toont de gegevens uit het uitvoeren van snelheid microscopie in de TZ van primaire cilia te bestuderen van de transportroute van SSTR3 verbonden door een ~ 15 nm externe linker aan Alexa647 (Figuur 3A). Het serveert het tweeledige doel van de verificatie van de 3D-transformatie-algoritme. Alexa647 moeten alleen label het buitenoppervlak van de primaire cilium en dus de 3D transportroute een high-density transportroute op die locat...

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Het algemene doel van dit experiment is om eiwittransportroutes in primaire cilia te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het cilia-gebied, zoals verschillen in eiwittransportroutes in normale en functioneel gestoorde cilia. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze voldoende resolutie heeft om subdiffractie-eiwittransportroutes in levende cellen te zien.Om te beginnen, ontdooi ingevroren voorraad van speciaal ontworpen NIH-3T3-cellen op 37 graden Celsius, anderhalve week voor het experiment. Breng de ontdooide cellen over naar een 25 centimeter vierkante celkweekkolf met drie milliliter voorverwarmd medium. Houd de cellen op 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator.Kweek de cellen tot ze 80% confluency bereiken en splits de cellen dan. Om de cellen te splitsen, trypsiniseer ze met 0,25% Trypsine gedurende twee minuten op 37 graden Celsius. Na de korte incubatie, zuig de trypsine weg en vervang het met twee milliliter voorverwarmd kweekmedium.Pipet het medium om eventuele celclusters te breken, verwijder dan 75% van de cellen uit de kolf en breng het totale volume medium terug op drie milliliter. Splits de cel

application-high-speed-super-resolution-speed-microscopy-live-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

In dit onderzoek werd een gedetailleerde lichtmicroscopische techniek geoptimaliseerd voor real-time observatie en analyse van de beweging van CPEC cilia ex vivo samen met een elektronenmicroscopische methode voor ultrastructurele analyse.

Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen<em&gt; Ex Vivo</em

Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.

High-speed videomicroscopie-analyse voor eerstelijnsdiagnose van primaire ciliaire dyskinesie

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Verken superresolutie-fluorescentiemicroscopie voor het in kaart brengen van eiwittransportroutes in levende primaire cilia van NIH-3T3-cellen. Deze methode onthult subdiffractie-dynamica essentieel voor celbiologisch onderzoek.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

Meer video's verkennen