Inductie en Micro-CT beeldvorming van cerebrale Cavernous misvormingen in Mouse Model
4 september 2017
Dit protocol toont de inductie van cerebrale cavernous malformatie ziekte in een muismodel en gebruik contrast enhanced micro computertomografie voor het meten van de laesie Last. Deze methode verbetert de waarde van gevestigde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire basis en mogelijke therapieën voor cerebrale cavernous misvorming en andere cerebrovasculaire ziekten.
Het algemene doel van deze procedure is om cerebrale caverneuze malformaties bij neonatale muizen te induceren en de ziektelast te meten met behulp van micro-CT. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van cerebrale vaatziekten, zoals cerebrale caverneuze malformaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat de ziektelast van cerebrale caverneuze malformaties bij neonatale muizenmodellen nauwkeuriger en efficiënter kan worden bepaald in vergelijking met bestaande methoden.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het induceren van cerebrale caverneuze malformaties en de stappen voor micro-CT-analyse moeilijk te leren zijn, omdat het ervaring en het gebruik van geavanceerde software vereist. Begin met het oplossen van 4-HT in 100% ethanol tot een concentratie van 10 milligram per milliliter. Bereid 30 microliter alaquads voor en bewaar deze vervolgens bij minus 80 graden Celsius.
Op de dag van gebruik, verdun de alaquads met 4-HT in koolzaadolie tot 0,5 milligram per milliliter. Gebruik vervolgens een insulinesyringe om 50 microliter 4-HT intragastrisch te injecteren in P1 neonatale pups om experimentele CCM-laesies te induceren. Begin met de monstervoorbereiding door een 10 milliliter spuit gevuld met drie milliliter 2% paraformaldehyde en PBS, uitgerust met een 29 gauge naald, te vullen.
Voer vervolgens intracardiale perfusie uit op een geeuthaniseerde P8 pup door de naald in het ventrikel van het muizenhart in te brengen en langzaam het volledige volume paraformaldehyde te injecteren. Nadat je met een schaar het hoofd hebt losgemaakt, verwijder je de huid van het hoofd en scheurt u de schedel af met behulp van pincetten om de hersenen in hun geheel te dissecteren in 4% paraformaldehyde en PBS. Bevestig de hersenen 's nachts bij 4-HT graden Celsius.
De volgende dag los je de achterhersenen los met behulp van pincetten en spoel je ze af met PBS-oplossing. Incubeer vervolgens de achterhersenen gedurende 48 uur in Lugol's jodiumoplossing. Droog de achterhersenen vervolgens kort in de lucht om overtollig Lugol's jodiumoplossing te verwijderen.
Vervolgens verpak je de Lugol's jodium gekleurde achterhersenen in 0,65 microliter microcentrifugebuizen en verzegel je ze volledig met plastic paraffinefolie om weefselkrimp te voorkomen. Plaats de microcentrifugebuizen in vijf milliliter plastic buizen met sponzen om te voorkomen dat ze tijdens het scannen bewegen. Monteer de buis met een achterhersenen verticaal op een aluminium houder in het micro-CT-systeem.
Stel de scanparameters in. Gebruik 540 projecties en een blootstellingstijd van twee seconden met bronvoorwaarden van 50 kilovolt en 10 watt om de tomografische datasets te verkrijgen. Radiografiën van de scan worden automatisch gereconstrueerd door hardware-gebaseerde projectiereconstructiesoftware, geleverd door het micro-CT-systeem, waardoor een beeldserie van 16-bits axiale plakken ontstaat.
Lugol's jodium gecontrasteerde micro-CT detecteerde voldoende CCM-laesies. Gescande röntgenbeelden werden gereconstrueerd om 3D-beelden van de muizenhersenen te produceren, wat de visualisatie van volledige laesies in het hersenparenchym mogelijk maakte, op verschillende diepten en oriëntaties, en de beoordeling van de structuur in 3D-locatie van laesies in de hersenen. Deze tabel toont een voorbeeld van kwantitatief resultaat van de gelabelde individuele laesies.
Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van vaatziekten de weg geëbaand om mechanismen en therapeutische opties voor cerebrale caverneuze malformaties in muizenmodellen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je CCM-laesies in muizenmodellen kunt induceren, en hoe je de CCM-laesielast kunt verkrijgen en analyseren met de micro-CT-techniek.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de inductie van cerebrale caverneuze malformatie bij pasgeborenen muizen en maakt gebruik van micro-CT om de laesielast te meten. Deze methode vergroot het inzicht in de moleculaire basis en potentiële therapieën voor cerebrale caverneuze malformaties en andere cerebrovasculaire aandoeningen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Vasculaire biologie
- Muismodellen
Achtergrond
- Cerebrale caverneuze malformaties (CCM's) zijn vasculaire laesies die kunnen leiden tot significante neurologische problemen.
- Bestaande methoden om de ziektelast in muismodellen te meten zijn vaak inefficiënt.
- Micro-CT biedt een niet-invasieve manier om laesies te visualiseren en te kwantificeren.
- Inzicht in CCM's kan leiden tot nieuwe inzichten in andere cerebrovasculaire aandoeningen.
Doel van de studie
- Om cerebrale caverneuze malformaties op te wekken bij neonatale muizen.
- Om de ziektelast nauwkeurig te meten met behulp van micro-CT.
- Om methodologieën voor het bestuderen van cerebrovasculaire aandoeningen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het oplossen van 4-HT in ethanol om een oplossing te maken voor het induceren van CCM's.
- Het bereiden van aliquoten voor bewaring bij -80 °C.
- Het gebruik van contrastversterkte micro-CT voor beeldvorming.
- Visuele demonstratie van het inductie- en analyseproces.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige en efficiënte bepaling van de CCM-ziektelast mogelijk.
- Micro-CT zorgt voor een heldere visualisatie van de laesies in de muismodellen.
- De inductie van CCM's is succesvol bereikt bij neonatale muizen.
- Deze benadering kan verder onderzoek naar potentiële therapieën faciliteren.
Conclusies
- Dit protocol verhoogt de waarde van muismodellen voor het bestuderen van CCM's.
- Micro-CT is een krachtig instrument voor het beoordelen van de last van cerebrovasculaire ziekten.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om therapeutische opties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Kwantitatieve micro-CT-beeldvorming van cerebrale caverneuze malformaties (CCM's) in genetisch gemodificeerde muizenmodellen maakt een nauwkeurige beoordeling van de laesiebelasting mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en targetvalidatie in onderzoek naar cerebrovasculaire aandoeningen. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij het testen van therapeutische hypothesen in een vroeg stadium en informeert de portfolioselectie door robuuste, reproduceerbare kwantificering van laesies te bieden. De integratie van hoge-resolutie beeldvorming met genetische ziektemodellen positioneert deze workflow als een kritiek omslagpunt voor translationele continuïteit in vasculaire biologie-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Maakt een grondige analyse van de CCM-genfunctie en de betrokkenheid van signaalpaden in ziektemodellen mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het kwantificeren van laesievorming na gerichte gen deletie.
- Biedt functionele validatie van targets via directe meting van ziekte-relevante fenotypes.
- Vergemakkelijkt voorspellende zekerheid bij het selecteren of deprioriteren van moleculaire targets voor verdere studie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde muismodellen en beeldvormingsprotocollen vast voor downstream compound screening.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve laesiemetrieken die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en beoordeling van de reproduceerbaarheid.
- Maakt schaalbare, high-throughput evaluatie van therapeutische interventies in preklinische settings mogelijk.
- Ondersteunt betrouwbare vergelijking van experimentele condities door consistente beeldvormingsoutputs.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische modellen uit met de menselijke ziektegenetica voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Waarborgt de continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische validatie van therapeutische hypothesen.
- Vermindert het translationele risico door kwantitatieve eindpunten te bieden voor ziekteprogressie en de effectiviteit van interventies.
- Versterkt het mechanistische begrip van cerebrovasculaire pathologie die relevant is voor klinische translatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde genetische manipulatie en kwantitatieve fenotypering in muismodellen mogelijk te maken, wat de identificatie van lead-verbindingen en de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van nulhypothesen en de verduidelijking van signaalpaden door middel van inductie en kwantificering van genetische letsels.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-resultaten voor de evaluatie van verbindingen en de gereedheid van assays.
- Analytics: Levert volumetrische en numerieke gegevens over letsels ter ondersteuning van statistische vergelijkingen tussen experimentele groepen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische modellen met ziekterelevante eindpunten voor preklinische continuïteit.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor diverse cerebrovasculaire onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert laesiekwantificering en imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door het verstrekken van robuuste preklinische gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van programma's voor vasculaire ziekten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met genetische muismodellen en micro-CT-beeldvormingsprotocollen.
- Vereist toegang tot micro-CT-instrumentatie met een hoge resolutie en gespecialiseerde analyse-software.
- Vereist standaardisatie van beeldvormingsparameters en datainterpretatie tussen teams.
- Kan aanpassing van protocollen vereisen voor verschillende genetische achtergronden of letseltypen.
- Afhankelijk van nauwkeurige monstervoorbereiding en beeldvormingscondities om de datakwaliteit te waarborgen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
