FM-kleurstoffen in vesikelrecycling
FM-kleurstoffen zijn membraankleurstoffen die veel worden gebruikt om blaasjesrecycling te beeldhouwen. Dit is het proces waarbij een cel blaasjes vormt uit zijn eigen membraan om de celgrootte te behouden, dure eiwitten opnieuw te gebruiken en achtereenvolgens moleculen naar de extracellulaire ruimte te vervoeren. Dit proces wordt het meest bestudeerd bij neuronale synapsen, waar het betrokken is bij de afgifte van neurotransmitters. Naast het onderzoeken van blaasjesrecycling, worden FM-kleurstoffen gebruikt om verschillende andere fenomenen te bestuderen, zoals secretie in chromaffine cellen en celmembraanreparatie na verwonding.
Deze video zal zich richten op het gebruik van FM-kleurstoffen in een experiment dat blaasjesrecycling bestudeert. We zullen een stapsgewijs protocol doorlopen dat FM-kleurstoffen gebruikt om het recyclingproces in gestimuleerde neuronen te kwantificeren. Ten slotte zullen we enkele voorbeeldexperimenten bespreken, die deze unieke molecuul op verschillende manieren gebruiken.
Voordat we beginnen met de procedure, laten we eerst de biochemische eigenschappen van FM-kleurstoffen bekijken, wat ons zal helpen hun functie in blaasjesrecyclingexperimenten te begrijpen.
Structureel zijn FM-kleurstoffen styrylmoleculen die hun naam ontlenen aan de wetenschapper die ze heeft gesynthetiseerd - Fei Mao. Deze kleurstoffen hebben drie belangrijke structurele kenmerken: hoofd, staart en brug. De brug bestaat uit twee aromatische ringen met een variabele dubbele bindingsregio tussen hen. Dit hele gedeelte creëert de fluorofoor.
Het is de aard van elke fluorofoor dat wanneer deze wordt getroffen door binnenkomend licht bij een bepaalde excitatiegolflengte, de atomen die energie absorberen en zijn elektronen naar een geëxciteerde toestand verhogen. Deze elektronen keren terug naar de grondtoestand door energie vibratieloos uit te zenden, en uiteindelijk als licht van een emissiegolflengte. De hydrofobe staart laat het FM-molecuul toe om in de lipide dubbellagen van het celmembraan te partitioneren, en de hydrofiele kop heeft een lading die de lokalisatie ervan beperkt tot de buitenste membraanlaag.
Daarom is de enige manier waarop het de cel in kan gaan via endocytose. FM-kleurstoffen zijn acuut omgevingsgevoelig en vertonen zwakke fluorescentie in polaire oplosmiddelen, maar sterke fluorescentie in hydrofobe omgevingen zoals membranen. Dit creëert hoog contrast membraanlabeling die kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Deze eigenschappen maken FM-kleurstoffen specifiek geschikt om blaasjesrecycling bij synapsen te beoordelen. In het kort omvat het proces het incuberen van de culturen met FM-kleurstof. Sommige van de FM-moleculen worden aan de membranen gehecht, wat hun fluorescentie-intensiteiten aanzienlijk verhoogt. Vervolgens initieert een stimulus het membraaninternalisatieproces. Daarom worden sommige FM-moleculen gevangen in het blaasjesmembraan, en de rest van de buiten gelokaliseerde kleurstofmoleculen worden weggespoeld.
Bij een tweede stimulatie versmelten geïnternaliseerde gekleurde blaasjes met het celmembraan om hun inhoud vrij te geven, en de kleurstof deelt snel uit, wat resulteert in een snelle afname van de fluorescentie-intensiteit. Dit uitkleuren kan worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Nu u bekend bent met de biochemische principes van FM-kleurstoffen, laten we een procedure bekijken over hoe u een experiment uitvoert om blaasjesrecycling van synapsen te onderzoeken met behulp van deze kleurstoffen.
Schoon, gezond monster van neuronale culturen op deksels worden van tevoren bereid. Deze cellen worden verplaatst naar een FM-kleurstofoplossing, waardoor de membranen worden gelabeld. Het monsterdeksel wordt vervolgens gemonteerd op de beeldvormingskamer van de microscoop.
Om vloeistofmanieringen zoals wasbeurten mogelijk te maken, worden vloeistofinvoer- en uitvoerlijnen bevestigd om een afgesloten perfusiekamer te vormen. Monteer de kamer op het platform van een fluorescentiemicroscoop. Bevestig draden aan de kamer en sluit ze aan op de elektrische stimulator. Eenmaal aangesloten, worden de excitatie- en emissiefilters ingesteld volgens de gebruikte FM-kleurstof.
Kleurstofbelasting in blaasjes via endocytose wordt geïnduceerd met behulp van een elektrische stimulatie. Na stimulatie worden zenuwuiteinden gedurende een korte periode gedurende een korte periode hersteld. Vervolgens wordt extracellulaire kleurstof afgewassen met buffer; dit minimaliseert ook de achtergrondfluorescentie. Het is belangrijk om de excitatie-intensiteit minimaal te houden omdat FM-kleurstoffen vatbaar zijn voor fotobleken, wat het verzwakken van de fluorescentie-intensiteit is als gevolg van langdurige excitatie. Na de korte incubatie worden initiële beelden verkregen. Vervolgens wordt exocytose geïnduceerd met een tweede elektrische signaal.
Na het meten van fluorescentie op verschillende tijdstippen na stimulatie, kunnen de zenuwuiteinden aan het einde uitputtend worden gestimuleerd om alle vrij te maken kleurstof te ontladen. De resterende fluorescentie die daarna overblijft, wordt beschouwd als de achtergrondfluorescentie-intensiteit. Vervolgens wordt de intrinsieke fluorescentie van elk beeld gemeten met behulp van de "Gebieden van belang" tool in een niet-synaptisch gebied van het beeld. De achtergrondfluorescentie en de intrinsieke fluorescentie worden vervolgens afgetrokken van de fluorescentie-intensiteit van elk tijdstip om genormaliseerde fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, die vervolgens wordt uitgezet tegen de tijd. De afname in intensiteit in de loop van de tijd vertegenwoordigt uitkleuring, wat een indirecte maat is voor blaasjesrecycling.
Nu we de methodologie hebben besproken, laten we eens kijken hoe FM-kleurstoffen worden gebruikt in specifieke experimenten.
We bespraken het protocol met behulp van FM-kleurstoffen in gestimuleerde neuronen. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het bestuderen van spontane blaasjesrecycling. Dit deden ze met behulp van het gevestigde protocol in combinatie met een beeldvormingssysteem dat gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te detecteren. De resultaten vertegenwoordigen een afname van de fluorescentie
FM-kleurstoffen zijn een klasse van fluorescerende moleculen die belangrijke toepassing hebben gevonden bij het bestuderen van het vesikelrecyclingpro…
FM-kleurstoffen zijn membraankleurstoffen die veel worden gebruikt om blaasjesrecycling te beeldhouwen. Dit is het proces waarbij een cel blaasjes vormt uit zijn eigen membraan om de celgrootte te behouden, dure eiwitten opnieuw te gebruiken en achtereenvolgens moleculen naar de extracellulaire ruimte te vervoeren. Dit proces wordt het meest bestudeerd bij neuronale synapsen, waar het betrokken is bij de afgifte van neurotransmitters. Naast het onderzoeken van blaasjesrecycling, worden FM-kleurstoffen gebruikt om verschillende andere fenomenen te bestuderen, zoals secretie in chromaffine cellen en celmembraanreparatie na verwonding.
Deze video zal zich richten op het gebruik van FM-kleurstoffen in een experiment dat blaasjesrecycling bestudeert. We zullen een stapsgewijs protocol doorlopen dat FM-kleurstoffen gebruikt om het recyclingproces in gestimuleerde neuronen te kwantificeren. Ten slotte zullen we enkele voorbeeldexperimenten bespreken, die deze unieke molecuul op verschillende manieren gebruiken.
Voordat we beginnen met de procedure, laten we eerst de biochemische eigenschappen van FM-kleurstoffen bekijken, wat ons zal helpen hun functie in blaasjesrecyclingexperimenten te begrijpen.
Structureel zijn FM-kleurstoffen styrylmoleculen die hun naam ontlenen aan de wetenschapper die ze heeft gesynthetiseerd - Fei Mao. Deze kleurstoffen hebben drie belangrijke structurele kenmerken: hoofd, staart en brug. De brug bestaat uit twee aromatische ringen met een variabele dubbele bindingsregio tussen hen. Dit hele gedeelte creëert de fluorofoor.
Het is de aard van elke fluorofoor dat wanneer deze wordt getroffen door binnenkomend licht bij een bepaalde excitatiegolflengte, de atomen die energie absorberen en zijn elektronen naar een geëxciteerde toestand verhogen. Deze elektronen keren terug naar de grondtoestand door energie vibratieloos uit te zenden, en uiteindelijk als licht van een emissiegolflengte. De hydrofobe staart laat het FM-molecuul toe om in de lipide dubbellagen van het celmembraan te partitioneren, en de hydrofiele kop heeft een lading die de lokalisatie ervan beperkt tot de buitenste membraanlaag.
Daarom is de enige manier waarop het de cel in kan gaan via endocytose. FM-kleurstoffen zijn acuut omgevingsgevoelig en vertonen zwakke fluorescentie in polaire oplosmiddelen, maar sterke fluorescentie in hydrofobe omgevingen zoals membranen. Dit creëert hoog contrast membraanlabeling die kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Deze eigenschappen maken FM-kleurstoffen specifiek geschikt om blaasjesrecycling bij synapsen te beoordelen. In het kort omvat het proces het incuberen van de culturen met FM-kleurstof. Sommige van de FM-moleculen worden aan de membranen gehecht, wat hun fluorescentie-intensiteiten aanzienlijk verhoogt. Vervolgens initieert een stimulus het membraaninternalisatieproces. Daarom worden sommige FM-moleculen gevangen in het blaasjesmembraan, en de rest van de buiten gelokaliseerde kleurstofmoleculen worden weggespoeld.
Bij een tweede stimulatie versmelten geïnternaliseerde gekleurde blaasjes met het celmembraan om hun inhoud vrij te geven, en de kleurstof deelt snel uit, wat resulteert in een snelle afname van de fluorescentie-intensiteit. Dit uitkleuren kan worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Nu u bekend bent met de biochemische principes van FM-kleurstoffen, laten we een procedure bekijken over hoe u een experiment uitvoert om blaasjesrecycling van synapsen te onderzoeken met behulp van deze kleurstoffen.
Schoon, gezond monster van neuronale culturen op deksels worden van tevoren bereid. Deze cellen worden verplaatst naar een FM-kleurstofoplossing, waardoor de membranen worden gelabeld. Het monsterdeksel wordt vervolgens gemonteerd op de beeldvormingskamer van de microscoop.
Om vloeistofmanieringen zoals wasbeurten mogelijk te maken, worden vloeistofinvoer- en uitvoerlijnen bevestigd om een afgesloten perfusiekamer te vormen. Monteer de kamer op het platform van een fluorescentiemicroscoop. Bevestig draden aan de kamer en sluit ze aan op de elektrische stimulator. Eenmaal aangesloten, worden de excitatie- en emissiefilters ingesteld volgens de gebruikte FM-kleurstof.
Kleurstofbelasting in blaasjes via endocytose wordt geïnduceerd met behulp van een elektrische stimulatie. Na stimulatie worden zenuwuiteinden gedurende een korte periode gedurende een korte periode hersteld. Vervolgens wordt extracellulaire kleurstof afgewassen met buffer; dit minimaliseert ook de achtergrondfluorescentie. Het is belangrijk om de excitatie-intensiteit minimaal te houden omdat FM-kleurstoffen vatbaar zijn voor fotobleken, wat het verzwakken van de fluorescentie-intensiteit is als gevolg van langdurige excitatie. Na de korte incubatie worden initiële beelden verkregen. Vervolgens wordt exocytose geïnduceerd met een tweede elektrische signaal.
Na het meten van fluorescentie op verschillende tijdstippen na stimulatie, kunnen de zenuwuiteinden aan het einde uitputtend worden gestimuleerd om alle vrij te maken kleurstof te ontladen. De resterende fluorescentie die daarna overblijft, wordt beschouwd als de achtergrondfluorescentie-intensiteit. Vervolgens wordt de intrinsieke fluorescentie van elk beeld gemeten met behulp van de "Gebieden van belang" tool in een niet-synaptisch gebied van het beeld. De achtergrondfluorescentie en de intrinsieke fluorescentie worden vervolgens afgetrokken van de fluorescentie-intensiteit van elk tijdstip om genormaliseerde fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, die vervolgens wordt uitgezet tegen de tijd. De afname in intensiteit in de loop van de tijd vertegenwoordigt uitkleuring, wat een indirecte maat is voor blaasjesrecycling.
Nu we de methodologie hebben besproken, laten we eens kijken hoe FM-kleurstoffen worden gebruikt in specifieke experimenten.
We bespraken het protocol met behulp van FM-kleurstoffen in gestimuleerde neuronen. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het bestuderen van spontane blaasjesrecycling. Dit deden ze met behulp van het gevestigde protocol in combinatie met een beeldvormingssysteem dat gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te detecteren. De resultaten vertegenwoordigen een afname van de fluorescentie
FM-kleurstoffen zijn membraankleurstoffen die veel worden gebruikt om blaasjesrecycling te beeldhouwen. Dit is het proces waarbij een cel blaasjes vormt uit zijn eigen membraan om de celgrootte te behouden, dure eiwitten opnieuw te gebruiken en achtereenvolgens moleculen naar de extracellulaire ruimte te vervoeren. Dit proces wordt het meest bestudeerd bij neuronale synapsen, waar het betrokken is bij de afgifte van neurotransmitters. Naast het onderzoeken van blaasjesrecycling, worden FM-kleurstoffen gebruikt om verschillende andere fenomenen te bestuderen, zoals secretie in chromaffine cellen en celmembraanreparatie na verwonding.
Deze video zal zich richten op het gebruik van FM-kleurstoffen in een experiment dat blaasjesrecycling bestudeert. We zullen een stapsgewijs protocol doorlopen dat FM-kleurstoffen gebruikt om het recyclingproces in gestimuleerde neuronen te kwantificeren. Ten slotte zullen we enkele voorbeeldexperimenten bespreken, die deze unieke molecuul op verschillende manieren gebruiken.
Voordat we beginnen met de procedure, laten we eerst de biochemische eigenschappen van FM-kleurstoffen bekijken, wat ons zal helpen hun functie in blaasjesrecyclingexperimenten te begrijpen.
Structureel zijn FM-kleurstoffen styrylmoleculen die hun naam ontlenen aan de wetenschapper die ze heeft gesynthetiseerd - Fei Mao. Deze kleurstoffen hebben drie belangrijke structurele kenmerken: hoofd, staart en brug. De brug bestaat uit twee aromatische ringen met een variabele dubbele bindingsregio tussen hen. Dit hele gedeelte creëert de fluorofoor.
Het is de aard van elke fluorofoor dat wanneer deze wordt getroffen door binnenkomend licht bij een bepaalde excitatiegolflengte, de atomen die energie absorberen en zijn elektronen naar een geëxciteerde toestand verhogen. Deze elektronen keren terug naar de grondtoestand door energie vibratieloos uit te zenden, en uiteindelijk als licht van een emissiegolflengte. De hydrofobe staart laat het FM-molecuul toe om in de lipide dubbellagen van het celmembraan te partitioneren, en de hydrofiele kop heeft een lading die de lokalisatie ervan beperkt tot de buitenste membraanlaag.
Daarom is de enige manier waarop het de cel in kan gaan via endocytose. FM-kleurstoffen zijn acuut omgevingsgevoelig en vertonen zwakke fluorescentie in polaire oplosmiddelen, maar sterke fluorescentie in hydrofobe omgevingen zoals membranen. Dit creëert hoog contrast membraanlabeling die kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Deze eigenschappen maken FM-kleurstoffen specifiek geschikt om blaasjesrecycling bij synapsen te beoordelen. In het kort omvat het proces het incuberen van de culturen met FM-kleurstof. Sommige van de FM-moleculen worden aan de membranen gehecht, wat hun fluorescentie-intensiteiten aanzienlijk verhoogt. Vervolgens initieert een stimulus het membraaninternalisatieproces. Daarom worden sommige FM-moleculen gevangen in het blaasjesmembraan, en de rest van de buiten gelokaliseerde kleurstofmoleculen worden weggespoeld.
Bij een tweede stimulatie versmelten geïnternaliseerde gekleurde blaasjes met het celmembraan om hun inhoud vrij te geven, en de kleurstof deelt snel uit, wat resulteert in een snelle afname van de fluorescentie-intensiteit. Dit uitkleuren kan worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Nu u bekend bent met de biochemische principes van FM-kleurstoffen, laten we een procedure bekijken over hoe u een experiment uitvoert om blaasjesrecycling van synapsen te onderzoeken met behulp van deze kleurstoffen.
Schoon, gezond monster van neuronale culturen op deksels worden van tevoren bereid. Deze cellen worden verplaatst naar een FM-kleurstofoplossing, waardoor de membranen worden gelabeld. Het monsterdeksel wordt vervolgens gemonteerd op de beeldvormingskamer van de microscoop.
Om vloeistofmanieringen zoals wasbeurten mogelijk te maken, worden vloeistofinvoer- en uitvoerlijnen bevestigd om een afgesloten perfusiekamer te vormen. Monteer de kamer op het platform van een fluorescentiemicroscoop. Bevestig draden aan de kamer en sluit ze aan op de elektrische stimulator. Eenmaal aangesloten, worden de excitatie- en emissiefilters ingesteld volgens de gebruikte FM-kleurstof.
Kleurstofbelasting in blaasjes via endocytose wordt geïnduceerd met behulp van een elektrische stimulatie. Na stimulatie worden zenuwuiteinden gedurende een korte periode gedurende een korte periode hersteld. Vervolgens wordt extracellulaire kleurstof afgewassen met buffer; dit minimaliseert ook de achtergrondfluorescentie. Het is belangrijk om de excitatie-intensiteit minimaal te houden omdat FM-kleurstoffen vatbaar zijn voor fotobleken, wat het verzwakken van de fluorescentie-intensiteit is als gevolg van langdurige excitatie. Na de korte incubatie worden initiële beelden verkregen. Vervolgens wordt exocytose geïnduceerd met een tweede elektrische signaal.
Na het meten van fluorescentie op verschillende tijdstippen na stimulatie, kunnen de zenuwuiteinden aan het einde uitputtend worden gestimuleerd om alle vrij te maken kleurstof te ontladen. De resterende fluorescentie die daarna overblijft, wordt beschouwd als de achtergrondfluorescentie-intensiteit. Vervolgens wordt de intrinsieke fluorescentie van elk beeld gemeten met behulp van de "Gebieden van belang" tool in een niet-synaptisch gebied van het beeld. De achtergrondfluorescentie en de intrinsieke fluorescentie worden vervolgens afgetrokken van de fluorescentie-intensiteit van elk tijdstip om genormaliseerde fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, die vervolgens wordt uitgezet tegen de tijd. De afname in intensiteit in de loop van de tijd vertegenwoordigt uitkleuring, wat een indirecte maat is voor blaasjesrecycling.
Nu we de methodologie hebben besproken, laten we eens kijken hoe FM-kleurstoffen worden gebruikt in specifieke experimenten.
We bespraken het protocol met behulp van FM-kleurstoffen in gestimuleerde neuronen. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het bestuderen van spontane blaasjesrecycling. Dit deden ze met behulp van het gevestigde protocol in combinatie met een beeldvormingssysteem dat gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te detecteren. De resultaten vertegenwoordigen een afname van de fluorescentie
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are FM dyes and how do they work in membrane imaging?
FM dyes are styryl fluorescent molecules that insert into the outer leaflet of cell membranes. They fluoresce strongly in hydrophobic environments like lipid bilayers but weakly in polar solvents, creating high-contrast membrane labeling. When struck by excitation light, their electrons enter an excited state and emit light at a specific wavelength, enabling visualization under a fluorescence microscope.
Q2: Why can FM dyes only enter cells through endocytosis?
FM dyes have a hydrophilic, charged head group that restricts their localization to the outer membrane leaflet. This charge prevents the molecule from crossing the lipid bilayer directly. The only way FM dyes can reach the cell interior is via endocytosis and exocytosis, the processes by which cells internalize and recycle membrane vesicles containing the dye molecules.
Q3: How does FM dye fluorescence change during vesicle recycling?
During vesicle recycling, FM dye fluorescence increases when dye-labeled membranes are internalized into vesicles, trapping the dye in the hydrophobic environment. Upon exocytosis, vesicles fuse with the cell membrane and the dye rapidly departitions into the extracellular space, causing a sharp decrease in fluorescence intensity that can be quantified to measure recycling rates.
Q4: What is photobleaching and why is it a concern in FM dye experiments?
Photobleaching is the weakening of fluorescence intensity caused by prolonged exposure to excitation light. FM dyes are particularly prone to photobleaching, so researchers minimize excitation intensity during imaging to preserve signal. This precaution ensures accurate quantification of destaining and prevents loss of fluorescence data before measurements are complete.
Q5: How are vesicle pools distinguished using FM dyes in neurons?
Scientists apply sequential electrical stimuli of increasing intensities to neurons labeled with FM dyes. This approach allows them to quantify the relative percentages of the reserve pool and readily releasable pool of synaptic vesicles. The differential destaining patterns reveal how many vesicles are available for immediate release versus those held in reserve.
Q6: What does normalized fluorescence intensity reveal about vesicle recycling?
Normalized fluorescence intensity is calculated by subtracting background and intrinsic fluorescence from raw intensity measurements at each time point. When plotted over time, the decrease in normalized intensity represents destaining, which serves as an indirect measure of vesicle recycling. This quantification allows researchers to assess the rate and extent of membrane internalization and recycling.
Q7: How do FM dyes help identify the role of sphingomyelinase in membrane repair?
Researchers compared FM dye uptake in sphingomyelinase-deficient cells versus control cells after inducing plasma membrane lesions. Sphingomyelinase-deficient cells showed robust intracellular FM accumulation, while controls showed minimal influx. This difference demonstrated that sphingomyelinase plays a critical role in the exocytic repair process that normally seals membrane wounds.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
1:07
Biochemistry of FM Dyes
3:37
General Protocol for Examining Vesicle Recycling
6:03
Applications
8:06
Summary