Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de morfologie van gezuiverde extracellulaire vesiculen te observeren en specifieke eiwitlokalisatie binnen extracellulaire vesiculen uit te voeren met behulp van elektronenmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de onderzoeksperiode van extracellulaire vesiculen, zoals de categorisering van het exosome en specifieke eiwitten die zich daarin bevinden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om het gedeelte van specifieke eiwitten te observeren dat zich zowel binnen als buiten het exosome bevindt.

De implicatie van deze techniek is om de diagnose van verschillende ziekten te garanderen, waaronder kanker en bacteriële infecties. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het exosome, kan deze ook worden toegepast op andere biologische monsters, microcellulaire incubatie en specifieke eiwitlokalisatie. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege het creëren van besmetting door niet-specifieke binding van immunogold-deeltjes.

Gebruik standaardtechnieken om exosomen in cultuur voor te bereiden. Ultracentrifugeer vervolgens het cultuursupernatant van HCT116-cellen om de exosomen uit het medium te pellen. Na het pellen, verwijder voorzichtig het cultuursupernatant.

Om het gezuiverde exosome-pellet te fixeren, voegt u een milliliter van 2,5% glutaaraldehyde toe in een 0,1 molaire natriumcacodylaatoplossing bij PH 7,0. Incubeer de lipidenbilayer-vesiculen gedurende één uur bij vier graden Celsius. Vervolgens verwijdert u het fixeermiddel en spoelt u de pellets gedurende 10 minuten met een milliliter van een 0,1 molaire natriumcacodylaatbufferoplossing op kamertemperatuur.

Bepaal vervolgens de monsters met een milliliter van 2% osmiumtetroxide gedurende één uur bij vier graden Celsius. Verwijder het fixeermiddel en spoel het exosome-pellet drie keer met de 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer, waarbij u de buffer elke tien minuten ververst. Droog vervolgens het monster door het gedurende 10 minuten in een reeks gegradueerde acetonconcentraties te schudden.

Meng vervolgens een oplossing van drie delen aceton en één deel laagviskeuze inbeddingsmengsel. Vervang het aceton door dit mengsel en incubeer het monster gedurende 30 minuten. Blijf het verhoudingsgewijs verhogen van het laagviskeuze inbeddingsmedium, waarbij u gedurende elke stap gedurende 30 minuten incubeert.

Eindelijk, incubeer het exosome-pellet in 100% van het laagviskeuze inbeddingsmengsel gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De volgende dag, begraaf het monster in zuiver laagviskeuze inbeddingsmengsel met behulp van een inbeddingsvorm en bak het gedurende 24 uur bij 65 graden Celsius. Gebruik een ultramicrotoom om secties met een dikte van 60 nanometer voor te bereiden.

Plaats de secties op een nikkelrooster en dubbelkleuren sommige van hen met 2% uranylacetaat gedurende 20 minuten, gevolgd door loodcitrat gedurende 10 minuten. Plaats vervolgens de gekleurde sectie in een transmissie-elektronenmicroscoop en bekijk het monster met behulp van 80 kilovolt en volg automatische instellingen voor de belichtingstijd. Met een exosome-afbeelding in zicht, verwerft en slaat u de afbeelding op met behulp van de microscoopsoftware.

Om te beginnen, incubeer roosters met 60 nanometer dikke, ongekleurde secties in 50 microliter druppels van 0,02 molaire glycine gedurende 10 minuten om de vrije aldehydegroepen te doven. Spoel vervolgens de secties in 100 microliters gedistilleerd water drie keer gedurende 10 minuten elk. Na de laatste spoeling, incubeer de secties gedurende één uur bij kamertemperatuur in PBS dat 1% BSA bevat.

Vervolgens incubeert u de roosters in 50 tot 100 microliter druppels van een anti-KRS-antilichaam gedurende één uur. Was vervolgens de roosters vijf keer gedurende 10 minuten elk in een druppel PBS dat 0,1% BSA bevat. Breng vervolgens de roosters over naar een druppel van een geschikt secundair antilichaam en incubeer de secties gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Was nu de roosters vijf keer gedurende 10 minuten, elk met een afzonderlijke druppel PBS dat 0,1% BSA bevat. Dubbelkleuren de secties met 2% uranylacetaat gedurende 20 minuten in het donker gevolgd door Reynolds-loodcitrat gedurende 10 minuten. Plaats de gekleurde sectie in een transmissie-elektronenmicroscoop en bekijk het monster met behulp van 80 kilovolt en beeld ze af zoals eerder getoond.

Om negatieve kleuring uit te voeren, fixeert u de gezuiverde exosomen na isolatie met een milliliter van 2% paraformaldehyde gedurende vijf minuten. Behandel dunne, met formvar/koolstof beklede, 200 mesh, koper EM-roosters met gloeiontlading gedurende één minuut, laad vervolgens vijf tot zeven microliters van de exosome-suspensieoplossing op een rooster en incubeer deze gedurende één minuut. Als de concentratie van exosome te hoog is, verdunt u de concentratie tot een geschikt niveau.

Verf onmiddellijk de exosomen met ongeveer 20 druppels van een gefilterde 1% uranylacetaatoplossing op het oppervlak van het EM-rooster. Verwijder de overtollige uranylacetaatoplossing van het rooster door de rand van de rooster in contact te brengen met filterpapier, spoel vervolgens het rooster snel af met een druppel water. Gebruik een tang om het rooster op de tafel te plaatsen en bedek het rooster gedeeltelijk met een kweekschaaltje.

Laat het rooster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur drogen en beeld vervolgens het rooster af of bewaar het in een elektronenmicroscooproosterdoos voor toekomstige observatie. Begin door de dunne formvar/koolstof beklede, 200 mesh koper EM-roosters gedurende 30 seconden met gloeiontlading te behandelen. Laad vervolgens vijf tot zeven microliters van de exosomen die zijn gefixeerd in 2% paraformaldehyde-oplossing op het rooster en incubeer ze daar gedurende vijf minuten.

Spoel vervol