Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta
September 27th, 2017
Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.
Het algemene doel van dit trophoblast celkweekmodel is om het effect van obesitasgerelateerde ontsteking op de regulatie van cruciale routes in trophoblasten te meten. Het belangrijkste voordeel van dit controlesysteem is dat het een relatie legt tussen TNF-alpha gemedieerde ontsteking en de genexpressie in de placenta in de context van maternale obesitas. Het belangrijkste voordeel van dit experimentele systeem is dat het relaties legt tussen TNF-alpha gemedieerde ontsteking en genexpressie in de placenta in de context van maternale obesitas.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Bailey Simon en Matt Bucher, technici van mijn lab. Villusweefsel moet zo snel mogelijk na de bevalling worden bemonsterd, bij voorkeur binnen 30 minuten of minder. Met de chorionplaat naar boven, gebruik pincetten en een schaar om willekeurig twee tot drie voldige diktedelen uit te snijden, twee tot drie centimeter vanaf de rand van de placenta.
Vermijd delen van de placenta die abnormaal lijken. Snijd de chorion- en basale platen en eventuele grote bloedvaten weg. Plaats het resulterende villusweefsel in warm, compleet medium.
Binnen 30 minuten na het bemonsteren van het villusweefsel, begint u met de isolatie van trophoblasten. Plaats elk stuk villusweefsel in een 50 milliliter conische buis gevuld met PBS op kamertemperatuur en schud voorzichtig om overtollig bloed in het weefsel vrij te maken. Giet de PBS weg en vervang het door nieuwe PBS.
Herhaal de PBS-spoeling totdat het meeste overtollige bloed is verwijderd. De PBS-spoeling zal licht rood of roze zijn wanneer het weefsel grondig is gespoeld. Plaats het villusweefsel in een steriele petrischaal en verwijder zoveel mogelijk bloedvaten door een microscoopglaasje te gebruiken om voorzichtig het zachte villusweefsel van de vaten te schrapen.
Gebruik een schaar om het resulterende villusweefsel fijn te snijden. Breng het gesneden villusweefsel over naar een steriele fles met spijsverteringsoplossing volgens de berekende volumes op basis van de specifieke activiteit van trypsine en DNase. Incubeer de spijsverteringsfles in een waterbad van 37 graden Celsius met schudbewegingen van 70 rpm gedurende 35 minuten.
Na 35 minuten, kantelt u de spijsverteringsfles op zijn zij en laat u de onverteerde weefselstukken op de bodem van de fles bezinken. Trek voorzichtig het supernatant op met een serologische pipet, waarbij u de bezonken weefsels vermijdt. Verdeel het supernatant door een 100 micron celzeef gelijkmatig over 50 milliliter conische buizen.
Start de tweede spijsvertering door spijsverteringsoplossing toe te voegen aan het resterende bezonken weefsel en incubeer de fles in het 37 graden Celsius waterbad. Laat voorzichtig drie tot vijf milliliter pasgeboren kalfserum, of NCS, onder het gezeefde supernatant van de eerste spijsvertering liggen door langzaam uit te spoelen vanaf een serologische pipet op de bodem van de buis. Een meniscus tussen het gezeefde supernatant dat trophoblasten bevat en NCS moet zichtbaar zijn.
Centrifugeer de supernatanten over NCS bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Het resulterende pellet zal rode bloedcellen bevatten in de onderste laag, gevolgd door een witte laag die trophoblastcellen bevat. Op dezelfde manier zeeft u het supernatant van de tweede en derde spijsvertering.
Laat NCS onder het gezeefde supernatant liggen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Zodra alle supernatanten zijn gecentrifugeerd en de NCS- en supernatantlagen zijn verwijderd, suspendeert u elk pellet opnieuw in vijf milliliter warm, compleet medium en smeert u de suspensies vervolgens samen. Verdeel de celsuspensie gelijkmatig over twee 50 milliliter conische buizen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer elk van de celpellets opnieuw in zes milliliter warm, compleet medium. Om deze procedure te starten, verdeelt u de celsuspensie gelijkmatig over vier dichtheidsgradienten door een overdrachtpipet te gebruiken om de celsuspensie langzaam en voorzichtig bovenop de dichtheidsgradienten te plaatsen. Centrifugeer de dichtheidsgradienten bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten met minimale versnelling en vertraging.
Dit zou onderscheidbare banden van gesedimeneerde cellen moeten produceren. Verwijder langzaam en voorzichtig de bovenste laag dichtheidsgradientmedium totdat de ondoorzichtige band met trophoblastcellen is bereikt. Breng de trophoblastbanden over in twee 50 milliliter conische buizen en vul ze met warm, compleet medium.
Draai de buizen voorzichtig drie tot zes keer om te mengen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer elk celpellet opnieuw in vijf milliliter warm, compleet medium. Combineer de celsuspensies en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hematocytoloogblok en trypanblauw.
De volgende stap na het tellen van cellen is om de cellen te plaatsen. Plaats drie miljoen cellen per putje in elke zesputjesplaat. Wieg de plaat voor- en achterwaarts en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen.
Laat de geplaatste cellen ongeveer 30 minuten in de laminare stroomventilatie om de cellen gelijkmatig te verdelen, te laten bezinken en te beginnen met hechten aan de bodem van de putjes. Plaats de platen na 30 minuten in een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Bekijk de trophoblasten na 24 uur kweek onder een microscoop om de hechting en de juiste trophoblastmorfologie te bevestigen.
De cellen kunnen na 24 uur kweek worden behandeld. Zuig het kweekmedium van de cellen af en vervang het door twee milliliter TNF-alpha gesupplementeerd medium per putje. Plaats de platen terug in de 37 graden Celsius incubator.
Na 24 uur TNF-alpha blootstelling, vervang het TNF-alpha gesupplementeerde medium door compleet medium. Incubeer nogmaals gedurende 24 uur. 24 uur na verwijdering van TNF-alpha, zuig het medium af en spoel de cellen voorzi
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de bemonstering van menselijk placenta villousweefsel en de daaropvolgende isolatie van cytotrofoblasten voor primaire celcultuur. Het model heeft tot doel de impact van obesitas-gerelateerde ontsteking op trophoblast gen-regulatie te onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Verloskunde
Achtergrond
- Moederlijke obesitas is gekoppeld aan ontsteking in de intra-uteriene omgeving.
- TNFα is een belangrijke bemiddelaar van ontsteking die trophoblasten beïnvloedt.
- Begrip van gen-regulatie in placenta's kan moleculaire doelen voor interventie onthullen.
- Primaire celcultuur van trophoblasten staat gecontroleerde experimentele omstandigheden toe.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van TNFα op trophoblast gen-regulatie te meten.
- Om een model te vestigen dat de inflammatoire omstandigheden van maternale obesitas nabootst.
- Om moleculaire doelen te identificeren die door ontsteking in placentaweefsel worden gereguleerd.
Gebruikte methoden
- Bemonstering van placenta villousweefsel binnen 30 minuten na de bevalling.
- Isolatie van cytotrofoblasten voor cultuur.
- Behandeling van trophoblasten met TNFα om inflammatoire omstandigheden te simuleren.
- Analyse van gen-regulatie paden beïnvloed door ontsteking.
Belangrijkste resultaten
- Vestiging van een betrouwbaar trophoblast cultuurmodel.
- Demonstratie van de rol van TNFα bij het reguleren van genexpressie in trophoblasten.
- Identificatie van kritische paden beïnvloed door obesitas-gerelateerde ontsteking.
- Inzichten in potentiële therapeutische doelen voor placenta disfunctie.
Conclusies
- Het trophoblast model bootst effectief de inflammatoire omgeving van maternale obesitas na.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van placenta gen-regulatie onder inflammatoire omstandigheden.
- Dit onderzoek kan toekomstige interventies voor obesitas-gerelateerde placenta problemen informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Obesity-driven inflammation in pregnancy presents a significant challenge for placental function, impacting fetal outcomes and translational research. This primary human trophoblast model enables direct interrogation of inflammatory signaling, such as TNFα-mediated pathways, on autophagy regulation in the placenta. The system provides a controlled, disease-relevant platform for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven testing of inflammatory mediators on placental gene regulation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating TNFα effects on autophagy regulators like Rubicon.
- Facilitates functional target validation in a primary human cell context.
- Provides predictive confidence for downstream pathway modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated primary trophoblast system for quantitative readouts.
- Supports reproducible measurement of gene and protein expression changes under defined inflammatory conditions.
- Enables assay standardization for screening modulators of autophagy and inflammation.
- Prepares a scalable platform for evaluating compound effects on placental pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for maternal obesity and placental dysfunction.
- Provides translational continuity from in vivo observations to ex vivo mechanistic studies.
- Supports risk-adjusted advancement of targets implicated in placental inflammation.
- Enables biomarker exploration for placental health in metabolic disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical research by enabling direct testing of inflammatory hypotheses in primary human trophoblasts, supporting lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of TNFα-driven autophagy regulation in placental cells.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for gene and protein expression under controlled inflammatory stimuli.
- Analytics: Supports statistical comparison of treatment conditions and dose-response relationships.
- Translational Research: Connects in vivo placental findings to ex vivo mechanistic validation in human cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse assays targeting placental inflammation and metabolic dysfunction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-pathway relationships for placental inflammation.
- Operational Value: Standardizes primary cell isolation and treatment protocols for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for targets modulating autophagy in maternal obesity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of placental targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human tissue handling and primary cell culture.
- Demands access to placental tissue and specialized cell isolation infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different gestational ages or disease states.
- Practical limitations include tissue availability and donor variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Collection of Placental Tissue
1:42
Isolation of Trophoblasts from Vilous Tissue
5:11
Density Centrifugation
6:29
Plating Cells
7:18
Treating Cells with TNFα and Harvesting Cells and Total Protein
9:10
Results: TNFα Regulates the Expression of Rubicon in Trophoblasts from Lean Pregnancies with Female Fetuses
10:20
Conclusion
