Name: Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer hoe je primaire humane trofoblasten isoleert uit placentaweefsel om de effecten van TNFα-gemedieerde ontsteking op genregulatie te bestuderen. Dit model helpt onderzoekers obesitas-gerelateerde placentadysfunctie te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken vrouwen die gedoneerd hun placentas voor dit onderzoek. Wij danken ook de arbeid en de afdeling van de levering bij OHSU en de moeders en foetale onderzoeksteam voor de coördinatie van de verzameling van placentas. Wij zijn dankbaar Eric Wang, Ph.D., en Kelly Kuo, MD voor ondersteuning en helpen met experimentele methoden en optimalisatie.
Dit werk werd gefinancierd door de NIH HD076259A (AM) en AHA GRNT29960007 (AM).

placentae werden verzameld uit de arbeid en de levering eenheid op universitair ziekenhuis onder een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele Review Board van Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, met geïnformeerde toestemming van de patiënten.
 1. collectie van placenta weefsel <ol><li>voorbereiding Opmerking: alle apparatuur die weefsel ontmoetingen moet steriel.
	<ol><li>Het ontleden uitrusting steriliseren in autoclaaf gedurende 60 minuten op 121 ° C.</li>
		<li>Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): lab jassen/jassen/scrubs, handschoenen en masker met een gelaatsscherm of bril.</li>
		<li>Inschakelen waterbad en ingesteld op 37 ° C.</li>
		<li>Warm twee 50 mL conische buizen, elk met 25 mL van volledige media (Iscove &#39; s gewijzigd Dulbecco &#39; s Medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine, tabel 3) in een waterbad 37 ° C.</li>
		<li>Met geïnformeerde patiënt toestemming, het verkrijgen van een placenta onmiddellijk na levering door keizersnede.</li>
		<li>Vertrouwd te raken met de placenta. De navelstreng wordt ingevoegd in de foetale kant (chorionic plaat) en bloedvaten kan worden gezien straalt uit van de navelstreng invoeging site. De overkant is de moeders kant, of basale plaat. Het omvat de decidua en structuren die vaartuig bomen, genaamd zaadlobben bevatten.</li>
	</ol></li> <li>Bemonstering van Villous weefsel Opmerking: Villous weefsel uit de placenta zo spoedig mogelijk na levering, bij voorkeur in 30 minuten of minder moet worden bemonsterd.
	<ol><li>Met de chorionic plaat naar boven, accijnzen 2-3 full-dikte secties (ongeveer 2,5 x 2,5 cm grootte) 2-3 cm vanaf de rand van de placenta op willekeurige, met Tang en schaar ( figuur 1A). 
		Opmerking: Voorkomen dat delen van de placenta die verschijnen abnormaal (dat wil zeggen wit kalkafzettingen).</li>
		<li>Trim weg de chorionic en basale platen en de grote bloedvaten.</li>
		<li>Plaatst de resulterende villous weefsel ( figuur 1B, ongeveer 80-120 g totale) in warme volledige media en begint van trofoblast isolatie binnen 30 min van bemonstering. 
		Opmerking: Sommige downstream testen en toepassingen worden beïnvloed door de lengte van de latentieperiode tussen levering, bemonstering en trofoblast isolatie. Het is het beste te houden deze termijnen zo kort als mogelijk en consistente tussen isolatie.</li>
		<li>Met behulp van de technieken beschreven in stappen 1.2.1 - 1.2.2, sample 5 willekeurige 1 x 1 cm secties van villous weefsel van over de placenta (inclusief het centrum).</li>
		<li>Knippen elk monster 1 x 1 cm villous weefsel in kleinere stukjes 4-5 (ongeveer 30 mg elke), plaats in 2 mL microcentrifuge buizen en flash bevriezen in vloeistof N 2. Winkel bij-80 ° C voor gebruik in latere analyses.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolatie van Trophoblasts van Villous weefsel <ol><li>voorbereiding Opmerking: gebruiken van steriel injectiemateriaal en uitvoeren van procedures waarbij cellen in een laminaire flow-kap.
	<ol><li>Dooi vier bevroren dichtheid verlopen (tabel 1, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) bij 4 ° C de nacht voordat de placenta aankomt. 
		Nota: Alternatief, dichtheid verlopen kunnen worden gemaakt op de dag van het isolement.</li>
		<li>Beurt op centrifuge en ingesteld op 20 ° C. 
		Opmerking: Alle stappen van het centrifugeren worden op maximale acceleratie en vertraging, tenzij anders gespecificeerd.</li>
		<li>Voorbereiden 1 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS) aangevuld met Ca + 2 en Mg + 2 (tabel 3).</li>
		<li>Warme trypsine tot 37 ° C.</li>
		<li>DNase verdund tot ongeveer 2720 kilounits/mL in steriel aangevuld HBSS.</li>
		<li>Warme 50 mL Serum van pasgeboren kalf (NCS) tot 37 ° C.</li>
		<li>Warm volledige media tot 37 ° C.</li>
		<li>Warm bevriezing media (90% FBS, 10% DMSO, tabel 3) tot 37 ° C. 
		Let op: DMSO is giftig en moeten worden behandeld met handschoenen.</li>
		<li>Voorbereiden spijsvertering buffer (tabel 2 en 3) door het mengen van 308 mL aangevuld HBSS, 50 mL trypsine (3751.7 BAEE eenheden/mL), en 0,5 mL DNase (379.4 kilounits/mL) in een steriele fles. 
		Opmerking: Het geschatte benodigde tijd voor het isoleren van cellen uit villous weefsel is 7 h.</li>
	</ol></li> <li>Het Villous weefsel verwerking <ol><li>Rinse elk stuk van villous weefsel in een conische tube van 50 mL gevuld met kamertemperatuur fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal en de PBS vervangen als dit nodig is, totdat het overtollige bloed is verwijderd (PBS spoelen zullen worden licht rood of roze wanneer het weefsel is grondig afgespoeld).</li>
		<li>Het villous weefsel in een steriele petrischaal plaatsen en verwijderen als veel bloedvaten mogelijk door voorzichtig afschrapen korting op de villous weke delen van de vaartuigen die met behulp van een microscoopglaasje.</li>
		<li>Fijn gehakt het resulterende villous weefsel met behulp van schaar.</li>
	</ol></li> <li>Villous weefsel spijsvertering en ruwe isolatie van Trophoblasts <ol><li>het gehakt villous weefsel overbrengen in een steriele fles met spijsvertering oplossing volgens de berekende volumes op basis van de specifieke activiteit van trypsine en DNase (165 mL, tabel 2).</li>
		<li>Na 35 min van incubatie in een waterbad 37 ° C met 70 omwentelingen per minuut (rpm), schudden kantelen van de spijsvertering fles op zijn kant en laat de onverteerd stukjes weefsel te vestigen op de bodem van de fles. Zorgvuldig opstellen van de bovendrijvende substantie met een serologische Pipet, het vermijden van het vaste weefsel.</li>
		<li>Het supernatant afzien door een zeef cel 100 µm gelijkelijk tussen de conische buisjes 50 mL. 
		Opmerking: Om tijd te besparen, is het raadzaam om te beginnen met de tweede vertering door spijsvertering oplossing (110 mL, tabel 2) toe te voegen aan de overige geregeld weefsel en hervatten van incubatie, zoals beschreven in stap 2.3.2.</li>
		<li>Laag 3-5 mL NCS onder het gespannen supernatant zachtjes door het langzaam verstrekking van een serologische pipet aan de onderkant van de buis. Een meniscus tussen de gespannen supernatant (met trophoblasts) en de NCS moet zichtbaar ( figuur 2A).</li>
		<li>Centrifugeren het supernatant over NCS bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C. De resulterende pellet nemen rode bloedcellen in de laag van de lagere meest gevolgd door een wit laagje met de cellen van de trofoblast ( figuur 2B).</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.2 - 2.3.5 voor elk van de spijsvertering van het tweede en derde (toevoegen van 110 mL en 83,5 m, respectievelijk van spijsvertering oplossing aan de fles van weefsel, tabel 2).</li>
		<li>Zodra alle supernatant hebben zijn gecentrifugeerd, resuspendeer elke pellet in 5 mL warme volledige media, en vervolgens samen bundelen de schorsingen.</li>
		<li>Splitsen de celsuspensie even tussen twee kegelvormige buizen van 50 mL en centrifuge op 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.</li>
		<li>Voorzichtig Verwijder het supernatant en resuspendeer elk van de cel pellets in 6 mL warme complETE media.</li>
	</ol></li> <li>Dichtheid centrifugeren <ol><li>verdelen de celsuspensie gelijkelijk tussen vier dichtheid verlopen (van elk 3 mL) door het langzaam en zorgvuldig stapelen de celsuspensie op de bovenkant van het verlopen van de dichtheid met een overdracht Pipetteer.</li>
		<li>Centrifugeren de dichtheid verlopen bij 1250 x g gedurende 20 minuten bij 20 ° C met minimale versnelling en vertraging. Dit moet produceren te onderscheiden bands van gesedimenteerd cellen (tabel 4).</li>
		<li>Langzaam en zorgvuldig verwijdert de bovenste lagen van dichtheid kleurovergang media (DGM) totdat het ondoorzichtige band(en) aan met cellen van de trofoblast (tussen 35-50% DGM) is bereikt (tabel 4).</li>
		<li>Overbrengen van de trofoblast bands in twee 50 mL conische buizen en vul met warme volledige media.</li>
		<li>Voorzichtig het omkeren van de buizen 3 - 6 keer te mengen en centrifugeer bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel in 5 mL warme volledige media. Combineer de cel schorsingen en levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en de Trypan blauwe tellen (of voorkeur cel tellen methode).</li>
	</ol></li> <li>Cellen tellen met een Hemocytometer <ol><li>de celsuspensie Meng door op en neer met een serologische Pipetteer pipetteren of door zachtjes het omkeren van de buis meermaals.</li>
		<li>Combineren gelijke delen celsuspensie en Trypan blauw (dat wil zeggen 20 µL elke) in een aparte buis en meng voorzichtig.</li>
		<li>Voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur Incubate.</li>
		<li>Voorzichtig afzien van 15-20 µL van de cel-Trypan blauwe mengsel tussen het dekglaasje aan en de hemocytometer en de cellen om te verspreiden over het raster door capillaire werking toestaan.</li>
		<li>Levensvatbare cellen (dode cellen zal worden gekleurd donkerblauw) in elk van de vier 4 x 4 kwadranten met een teller tally tellen. Een systeem om ervoor te zorgen dat cellen worden niet meegeteld meer dan eens te tellen (d.w.z. tellen niet cellen die de onderzijde of de linker grenzen raken). 
		Opmerking: Elke 4 x 4-kwadrant moet tussen de 50-150 cellen bevatten. Te weinig of te veel cellen kunnen leiden tot een over of onderschatting van celaantal.</li>
		<li>Gemiddelde de cel totaal telt uit elk van de 4 x 4 kwadranten, te vermenigvuldigen met 10 4, en dan te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (celsuspensie naar Trypan blue) voor het berekenen van aantal cellen per mL.</li>
		<li>Het aantal cellen per milliliter te vermenigvuldigen met het totale volume van de celsuspensie voor het berekenen van het rendement van de cel totaal. 
		Opmerking: Ongeveer 100 miljoen cellen worden verwacht van isolatie beginnen met 80-120 g van villous weefsel.</li>
	</ol></li> <li>Plating cellen <ol><li>plaat 3 miljoen cellen per putje (3.3 x 10 5 cellen per cm 2) in een 6-well plaat (2 mL van een schorsing per putje) en zachtjes heen en weer rock en kant naar kant gelijkmatig verdelen de cellen. 
		Opmerking: Trophoblasts vereisen Weefselkweek behandeld platen te houden goed. Een monolayer van cellen is vereist ter bevordering van syncytialization.</li>
		<li>Laat de vergulde cellen in de kap van de laminaire flow gedurende ongeveer 30 minuten om cellen te gelijkmatig te verspreiden, te regelen, en beginnen zich te houden aan de onderkant van de putten alvorens in de incubator.</li>
		<li>Cultuur cellen voor maximaal 72 uur (met dagelijkse wijzigingen van de media) in een incubator 37 ° C met 5% CO 2 en 95% vochtigheid. 
		Opmerking: Controleer de trophoblasts onder een microscoop bij 10-20 x elke 24 h van cultuur. Trophoblasts niet vermenigvuldigen en niet kan worden gepasseerd. In de loop van 72 h van de cultuur, de ronde individuele trophoblasts zekering om te vormen van een syncytium ( figuur 3A en B).</li>
	</ol></li> <li>Bevriezing cellen <ol><li>Pellet ongebruikte cellen door centrifugeren bij 1250 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.</li>
		<li>Gecombineerd zoveel media mogelijk van de pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in de bevriezing van de media (tabel 3).</li>
		<li>Bevriezen de aliquots bij-80 ° C in een bevriezing container gevuld met 100% isopropanol. Overbrengen in de bevroren aliquots vloeistof N 2 de volgende dag voor lange termijn opslag. 
		Opmerking: Cellen gekweekt kunnen worden na invriezen.</li>
	</ol></li> <li>Ontdooien cellen <ol><li>verwijderen van een aliquoot deel van bevroren cellen en ontdooien in een waterbad 37 ° C terwijl zwenken. Verwijderen van het afgepipetteerde deel uit het waterbad, net voordat het heeft volledig ontdooid tot een vloeistof.</li>
		<li>Onmiddellijk overbrengen in de ontdooide cellen een conische buis 15 ml. Begin vertragen aanvankelijk, voeg 10 mL van de volledige media met het mengen van intermitterende.</li>
		<li>Omkeren buis meerdere malen te mengen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.</li>
		<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in warme volledige media 2-5 mL.</li>
		<li>Rekenen de cellen en de plaat zoals hiervoor is beschreven.</li>
	</ol></li></ol> 3. Behandeling van primaire Trophoblasts met TNFα collectie van cel Lysates en westelijke bevlekken <ol><li>voorbereiding <ol><li>Warm volledige media tot 37 ° C.</li>
		<li>Maken van een voorraad van 10 µg/mL van TNFα in volledige media en opslag bij-20 ° C tot parasols.</li>
		<li>Maak een 1 µg/mL werken voorraad van TNFα in volledige media als u klaar bent voor de behandeling van de cellen. Seriële Verdun de TNFα werken voorraad 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL en 125 pg/mL in volledige media. 
		Opmerking: De TNFα concentratie van 10 4 pg/mL is matig cytotoxische. Aanpassing van de concentraties van de TNFα getest zal afhangen van de specifieke kenmerken van de gewenste downstream toepassingen.</li>
	</ol></li> <li>Behandeling van cellen met TNFα <ol><li>gecombineerd na 24 h van de cultuur, de media van de cultuur van de cellen en vervangen met 2 mL TNFα aangevuld medias per putje op 6-Wells-platen (ten minste twee putten per behandeling en voertuig Control).</li>
		<li>Na 24 h blootstellingsduur TNFα-48 h van cultuur, vervangen de medias TNFα aangevuld met volledige media.</li>
	</ol></li> <li>Oogst cellen en totale proteïne <ol><li>na 72 uur van cultuur (24 h verleden verwijdering van TNFα) gecombineerd media voorzichtig spoelen cellen met kamertemperatuur PBS en voeg 80 µL van ijskoud Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) met vers protease en phosphatase inhibitors (tabel 3) direct aan elk putje toegevoegd.</li>
		<li>Verwijder de cellen van de plaat met een cel schraper. De cellen overbrengen in een 1,5 mL microcentrifuge buis, bundeling van putten binnen behandelgroepen.</li>
		<li>Lyse de cellen door vortexing de buizen op hoge voor ten minste drie intervallen van 15 s.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 4 ° C met rockende voor 15 min. 
		Opmerking: u kunt ook na stap 3.3.3., de cellen kunnen worden geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten met intermitterende agitatie door flicking de buis, vortexing, of pipetteren omhoog en doenWN.</li>
		<li>Herhaal stap 3.3.3.</li>
		<li>Centrifugeren van de buizen bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot cellulaire puin pellet.</li>
		<li>Overdracht het supernatant (met cellulaire eiwit) om een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en sla op -80 ° C. 
		Opmerking: Het protocol kan worden gestopt hier en op een later tijdstip hervat. Het is raadzaam om verschillende hoeveelheden van cellulaire EiwitSteekproeven om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli.</li>
		<li>Totaal eiwitconcentratie te bepalen door een voorkeur, zoals een bicinchoninic zuur assay (BCA, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal).</li>
	</ol></li> <li>SDS-pagina en het westelijke bevlekken voor Rubicon of eiwit van belang Opmerking: Volg Westelijke Bevlekkende Protocollen volgens fabrikant &#39; s-instructies met behulp van een systeem van aangewezen laboratorium.
	<ol><li>Belasting tussen 20-40 µg totaal eiwit in monster buffer (tabel 3) per putje op een 12% acrylamide gel. Afzonderlijke proteÃ¯nen door SDS-PAGE in rijklare buffer (tabel 3).</li>
		<li>Natte-overdracht de eiwitten uit de gel aan een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan volgens fabrikant &#39; s instructies in overdracht buffer (tabel 3).</li>
		<li>Incubeer het membraan in 5% melkpoeder in zoute Tris-Buffered met 0,1% Tween-20 (TBST, tabel 3) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met rockende.</li>
		<li>Incubeer het membraan in een Rubicon primair antilichaam (zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) op 1:500 in 1% melkpoeder in TBST's nachts bij 4 ° C met rockende.</li>
		<li>Voorzichtig wassen het membraan 3 x 5 min in TBST en 1 x 5 min in TBS bij kamertemperatuur met rockende.</li>
		<li>Incubeer het membraan in 1:2000 - 1:5000 secundair antilichaam (HRP-gekoppeld of voorkeur zichtbaar conjugaat, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) in 5% melkpoeder in TBST gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met Rocking.</li>
		<li>Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en visualiseren van de vlek met een passende visualisatie (d.w.z. chemiluminescentie) substraat op een imaging systeem.</li>
		<li>Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en sonde het membraan voor β-actine of een besturingselement voorkeur laden volgens de fabrikant &#39; s instructies.</li>
		<li>Op de software van de analyse van de preferent spiegelbeeld, analyseren de expressie van Rubicon door handmatige kwantificering van absorptie (band intensiteiten), controle aftrekken van de extinctie van de achtergrond en de normalisatie bij het laden van de bijbehorende band intensiteiten. Het uitvoeren van statistische analyses om te testen voor statistisch significante veranderingen in eiwitniveaus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21219177">Inflammatory mechanisms in obesity.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).</li>
<li>van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+in+cancer+treatment%3A+molecular+insights%2C+antitumor+effects%2C+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility.</a> Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).</li>
<li>Yogev, Y., Catalano, P. M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Patrick_Catalano/publication/26271349_Pregnancy_and_Obesity/links/02e7e52a74197bcf6f000000.pdf">Pregnancy and obesity.</a> Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregravid+obesity+associates+with+increased+maternal+endotoxemia+and+metabolic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).</li>
<li>Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+miR-210+expression+and+mitochondrial+dysfunction+in+the+placenta+with+maternal+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity.</a> Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).</li>
<li>Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+placental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Obesity and placental function.</a> Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).</li>
<li>Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+body+mass+index+and+the+risk+of+fetal+death%2C+stillbirth%2C+and+infant+death%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).</li>
<li>Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boys+live+dangerously+in+the+womb%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Biol%22%5BJournal%5D)">Boys live dangerously in the womb.</a> Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).</li>
<li>Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. <a target="_blank" href="http://klimanlabs.yale.edu/placenta/research/Trophoblast%20to%20Placenta%20EOR_163163_284_18220.pdf">Enc. Reprod</a>. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).</li>
<li>Bax, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+changes+and+immunocytochemical+analysis+of+human+placental+trophoblast+during+short-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture.</a> Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).</li>
<li>Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+cytotrophoblast+cells+and+in+vitro+methods+for+studying+human+cytotrophoblast+cells%27+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake.</a> Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).</li>
<li>Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+activation+of+placental+autophagy+in+obese+women+with+evidence+for+fetal+programming+from+a+placenta-specific+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model.</a> Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).</li>
<li>Matsunaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Beclin+1-binding+proteins%2C+Atg14L+and+Rubicon%2C+reciprocally+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+autophagic+activity+by+Atg14L+and+Rubicon+associated+with+Beclin+1-phosphatidylinositol-3-kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).</li>
<li>Yang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Protein+Rubicon+Mediates+Phagocytic+NADPH+Oxidase+Activation+in+Response+to+Microbial+Infection+or+TLR+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation.</a> Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).</li>
<li>Yang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy+Regulator+Rubicon+Is+a+Feedback+Inhibitor+of+CARD9-Mediated+Host+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity.</a> Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).</li>
<li>Zi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rubicon+deficiency+enhances+cardiac+autophagy+and+protects+mice+from+lipopolysaccharide-induced+lethality+and+reduction+in+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).</li>
<li>Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+function+in+human+placenta+with+increased+maternal+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).</li>
<li>Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+pregnancy%3A+the+role+of+the+immune+system+at+the+implantation+site%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site.</a> Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).</li>
<li>Resi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+inflammation+and+adipose+tissue+matrix+remodeling+precede+physiological+adaptations+to+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v469/n7330/full/nature09782.html">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li>
<li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).</li>
<li>Sagrillo-Fagundes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Primary+Trophoblast+Cell+Culture+Model+to+Study+the+Protective+Effects+of+Melatonin+Against+Hypoxia%2Freoxygenation-induced+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption.</a> JoVE. (113), (2016).</li>
<li>Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+obesity%2C+inflammation%2C+and+developmental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Maternal obesity, inflammation, and developmental programming.</a> Biomed. Res. Int. , 418975(2014).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+in+serum+of+patients+with+inflammatory+bowel+disease+as+measured+by+a+highly+sensitive+immuno-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR.</a> Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).</li>
<li>Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+Rubicon+to+cross+the+Rubicon%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Binding Rubicon to cross the Rubicon.</a> Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De placenta, verantwoordelijk voor de regulering van de groei van de foetus, vertoont gecompromitteerde functie in de zwaarlijvige milieu-6. Ondanks de hoge metabole eisen van trophoblasts vertonen placentas met moeders obesitas disfunctionele mitochondriale ademhaling6,19. Veranderingen in de placenta metabolisme kunnen bijdragen aan de toename van complicaties en negatieve foetale effecten waargenomen in zwaarlijvige zwangerschappen<sup ...

Obesitas is een inflammatoire staat gekenmerkt door chronische low-grade ontsteking, die voortkomen uit overtollige vetweefsel en de beschikbaarheid van nutriënten. In overgewicht, zijn proinflammatoire cytokines verheven in metabole weefsels en systemisch in omloop. Een robuust lichaam van bewijsmateriaal blijkt dat TNFα is aanzienlijk verhoogd in de omgeving van obesitas met gevolgen in insulineresistentie en metabole dysfunctie1. Activering van TNFα draagt ook bij aan de pathogenese van de ziekte in aandoeningen zoals kanker en autoimmuniteit, waardoor het een aantrekkelijke therapeutisch doel2.
Ontsteking in obesitas wordt verergerd door zwangerschap, ook een proinflammatoire staat3,4. Eerder is aangetoond dat de placenta TNFα inhoud met moeders vetmobilisering in zwangerschappen met vrouwelijke foetussen toeneemt. Bovendien remt TNFα behandeling mitochondriale ademhaling in vrouwelijke maar niet mannelijke trofoblast cellen, suggereren dat TNFα is betrokken bij de regulering van de placenta metabolisme in een seksueel dimorphic wijze5. Maternale obesitas wordt geassocieerd met de verhoogde incidentie van allerlei complicaties tijdens de zwangerschap, met inbegrip van doodgeboorte, met mannelijke foetussen worden de meest gevoelig3,6,7,8 . Als gevolg van haar belangrijke rol op de moeders-foetale interface, kunnen veranderingen in de functionele capaciteit van de placenta in de zwaarlijvige uteriene omgeving in reactie op inflammatoire signalering een belangrijke rol in het bemiddelen van de resultaten van zwaarlijvige zwangerschappen.
Cytotrophoblasts en syncytiotrophoblasts in het villous weefsel van de placenta zijn kritisch voor endocriene signalering en voedingsstoffen en zuurstof uitwisseling tussen de moeder en de ontwikkeling van de foetus9. Verstoringen in de functionele capaciteit van villous cytotrophoblasts (hierna te noemen trophoblasts) in gevaar kunnen brengen foetale gezondheid en ontwikkeling. Dit protocol beschrijft een methode voor de bemonstering van villous weefsel van de placenta menselijke termijn door het ontleden weg de chorionic en basale platen samen met een geoptimaliseerde procedure voor de isolatie van de trophoblasts voor primaire celculturen. Dit protocol is afgeleid van gevestigde methoden waarbij enzymatische vertering van villous weefsel vrij te geven van de cellen van de extracellulaire matrix gevolgd door differentiële dichtheid centrifugeren te isoleren trophoblasts10, 11,12. De gegevens van dit protocol een aanpak waarin primaire trophoblasts van placentas van mager zwangerschappen worden behandeld met voedingsbodems aangevuld met TNFα te simuleren een onderdeel van de inflammatoire milieu gekoppeld aan moeders obesitas. Eindelijk, een eenvoudige procedure voor de oogst van de cel Totaal lysates van TNFα-behandeld trophoblasts gevolgd door Western blotting om de opsporing van wijzigingen in genexpressie is beschreven.
Dit model doet het obesogenic in utero milieu in zijn geheel niet recapituleren, geeft maar een gecontroleerde systeem dat een toelaat parseren uit de individuele bijdrage van TNFα-gemedieerde ontsteking naar aanleiding van de trophoblasts maternale obesitas. Dit model biedt zowel de mogelijkheid om te ontdekken of bevestigen van moleculaire targets direct geregeld TNFα signalering in trophoblasts evenals maakt het mogelijk om te testen of veranderingen in gen-expressiepatronen in vivo in placentas met moeders waargenomen overgewicht kan een gevolg zijn van TNFα-gemedieerde ontsteking.
De hier beschreven aanpak werd opgestart om te testen van het effect van TNFα-gemedieerde ontsteking op de regulering van autophagy in menselijke trophoblasts. Trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen tentoonstelling verstoord autophagic omzet of autophagosome rijping13. Vallen proteïnen aan genaamd Rubicon (RUN domein eiwit Beclin1-interactie en cysteïne-rijke bevatten), die is gelokaliseerd in de lysosomen en laat Endosomen, is onlangs beschreven als een "rem" in het proces autophagic omzet omdat het functioneert als een negatief regulator van14,15van de rijping van de autophagosome. In feite, is Rubicon een zeldzaam voorbeeld van een eiwit dat weerhoudt autophagy, waardoor het een waardevolle therapeutisch doel. Zeer weinig informatie is beschikbaar over de pathofysiologische betekenis van Rubicon, met uitzondering van haar rollen in de ingeboren immune reactie op microbials16,17 en cardiomyocyte bescherming18. Met het protocol beschreven hier, het komt voor dat Rubicon upregulated in vrouwelijke primaire trophoblasts in reactie op behandeling is met toenemende concentraties van TNFα tot 250 pg/mL. De regulering van de Rubicon kan een rol spelen in hoe vrouwelijke foetussen fare beter dan mannetjes in zwangerschappen met moeders obesitas. Recapitulerend ontsteking geassocieerd met moeders obesitas ex vivo door blootstelling van menselijke trophoblasts aan exogene TNFα biedt een platform voor het bestuderen van de effecten van de zwaarlijvige uteriene milieu over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts en bij uitbreiding, placenta functie.

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Protease/Phosphatase inhibitors</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate.</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6228822</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&rsquo;s Modified Dulbecco&rsquo;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal Calf Serum (NCS)</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K2EDTA vacutainer blood collection tubes</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Instant Nonfat Dry Milk</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubicon (D9F7) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-Actin antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

een model van primaire menselijke trophoblast te bestuderen van het effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van autophagy in de placenta

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternale obesitas wordt geassocieerd met een verhoogd risico op nadelige perinatale uitkomsten die zijn waarschijnlijk gemedieerd door gecompromitteerde placenta functie die kan worden toegeschreven aan, in deel, de disregulatie van autophagy. Aberrant wijzigingen in de expressie van de regelgevers autophagy in de placentas van zwaarlijvige zwangerschappen kunnen bij inflammatoire processen gekoppeld aan zowel overgewicht en zwangerschap worden geregeld. Hier beschreven is een protocol voor de bemonstering van villous weefsel en isolatie van de villous cytotrophoblasts van de term menselijke placenta voor primaire celculturen. Dit wordt gevolgd door een methode voor het simuleren van de inflammatoire milieu in de zwaarlijvige uteriene omgeving door het behandelen van primaire trophoblasts van mager zwangerschappen met tumor necrose factor Alfa (TNFα), een proinflammatoire-cytokine dat is verheven in zwaarlijvigheid en in zwangerschap. Via de implementatie van het protocol beschreven hier, komt het voor dat de blootstelling aan exogene TNFα regelt de uitdrukking van Rubicon, een negatieve regulator van autophagy, in trophoblasts van mager zwangerschappen met vrouwelijke foetussen. Terwijl een aantal biologische factoren in de zwaarlijvige uteriene omgeving behouden het potentieel om te moduleren kritische trajecten in trophoblasts, is dit systeem ex vivo vooral handig voor het bepalen van als expressie waargenomen in vivo patronen in menselijke placentas met moeders obesitas zijn een direct gevolg van TNFα signalering. Uiteindelijk, deze aanpak biedt de mogelijkheid om te ontleden de regelgevings- en moleculaire implicaties van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over autophagy en andere kritische cellulaire routes in trophoblasts die de potentie hebben om invloed functie van de placenta.

Termijn van menselijke placentas van lean (pre-zwangerschap index van de lichaamsmassa (BMI) &#60; 25) moeders met ongecompliceerde zwangerschappen uitvoering van vrouwelijke nakomelingen werden verzameld en bemonsterd binnen 15 minuten na levering door keizersnede (geen arbeid). De placentas werden onderzocht voor het ontbreken van kalkafzettingen en typische ontwikkeling: weegt tussen 300-600 g met de navelstreng en membranen verwijderd, ronde in vorm, tussen 15-25 cm in diameter en nav...

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Het algemene doel van dit trophoblast celkweekmodel is om het effect van obesitasgerelateerde ontsteking op de regulatie van cruciale routes in trophoblasten te meten. Het belangrijkste voordeel van dit controlesysteem is dat het een relatie legt tussen TNF-alpha gemedieerde ontsteking en de genexpressie in de placenta in de context van maternale obesitas. Het belangrijkste voordeel van dit experimentele systeem is dat het relaties legt tussen TNF-alpha gemedieerde ontsteking en genexpressie in de placenta in de context van maternale obesitas.De procedure zal worden gedemonstreerd door Bailey Simon en Matt Bucher, technici van mijn lab. Villusweefsel moet zo snel mogelijk na de bevalling worden bemonsterd, bij voorkeur binnen 30 minuten of minder. Met de chorionplaat naar boven, gebruik pincetten en een schaar om willekeurig twee tot drie voldige diktedelen uit te snijden, twee tot drie centimeter vanaf de rand van de placenta.Vermijd delen van de placenta die abnormaal lijken. Snijd de chorion- en basale platen en eventuele grote bloedvaten weg. Plaats het resulterende villusweefsel in warm, compleet medium.Binnen 30 minuten na het bemonsteren van het villusweefsel, begint u met de isolatie van trophoblasten. Plaats elk stuk villusweefsel in een 50 milliliter conische buis gevuld met PBS op kamertemperatuur en schud voorzichtig om overtollig bloed in het weefsel vrij te maken. Giet de PBS weg en vervang het door nieuwe PBS.Herhaal de PBS-spoeling totdat het meeste overtollige bloed is verwijderd. De PBS-spoeling zal licht rood of roze zijn wanneer het weefsel grondig is gespoeld. Plaats het villusweefsel in een steriele petrischaal en verwijder zoveel mogelijk bloedvaten door een microscoopglaasje te gebruiken om voorzichtig het zachte villusweefsel van de vaten te schrapen.Gebruik een schaar om het resulterende villusweefsel fijn te snijden. Breng het gesneden villusweefsel over naar een steriele fles met spijsverteringsoplossing volgens de berekende volumes op basis van de specifieke activiteit van trypsine en DNase. Incubeer de spijsverteringsfles in een waterbad van 37 graden Celsius met schudbewegingen van 70 rpm gedurende 35 minuten.Na 35 minuten, kantelt u de spijsverteringsfles op zijn zij en laat u de onverteerde weefselstukken op de bodem van de fles bezinken. Trek voorzichtig het supernatant op met een serologische pipet, waarbij u de bezonken weefsels vermijdt. Verdeel het supernatant door een 100 micron celzeef gelijkmatig over 50 milliliter conische buizen.Start de tweede spijsvertering door spijsverteringsoplossing toe te voegen aan het resterende bezonken weefsel en incubeer de fles in het 37 graden Celsius waterbad. Laat voorzichtig drie tot vijf milliliter pasgeboren kalfserum, of NCS, onder het gezeefde supernatant van de eerste spijsvertering liggen door langzaam uit te spoelen vanaf een serologische pipet op de bodem van de buis. Een meniscus tussen het gezeefde supernatant dat trophoblasten bevat en NCS moet zichtbaar zijn.Centrifugeer de supernatanten over NCS bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Het resulterende pellet zal rode bloedcellen bevatten in de onderste laag, gevolgd door een witte laag die trophoblastcellen bevat. Op dezelfde manier zeeft u het supernatant van de tweede en derde spijsvertering.Laat NCS onder het gezeefde supernatant liggen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Zodra alle supernatanten zijn gecentrifugeerd en de NCS- en supernatantlagen zijn verwijderd, suspendeert u elk pellet opnieuw in vijf milliliter warm, compleet medium en smeert u de suspensies vervolgens samen. Verdeel de celsuspensie gelijkmatig over twee 50 milliliter conische buizen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten.Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer elk van de celpellets opnieuw in zes milliliter warm, compleet medium. Om deze procedure te starten, verdeelt u de celsuspensie gelijkmatig over vier dichtheidsgradienten door een overdrachtpipet te gebruiken om de celsuspensie langzaam en voorzichtig bovenop de dichtheidsgradienten te plaatsen. Centrifugeer de dichtheidsgradienten bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten met minimale versnelling en vertraging.Dit zou onderscheidbare banden van gesedimeneerde cellen moeten produceren. Verwijder langzaam en voorzichtig de bovenste laag dichtheidsgradientmedium totdat de ondoorzichtige band met trophoblastcellen is bereikt. Breng de trophoblastbanden over in twee 50 milliliter conische buizen en vul ze met warm, compleet medium.Draai de buizen voorzichtig drie tot zes keer om te mengen en centrifugeer bij 1.250 keer g bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer elk celpellet opnieuw in vijf milliliter warm, compleet medium. Combineer de celsuspensies en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hematocytoloogblok en trypanblauw.De volgende stap na het tellen van cellen is om de cellen te plaatsen. Plaats drie miljoen cellen per putje in elke zesputjesplaat. Wieg de plaat voor- en achterwaarts en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen.Laat de geplaatste cellen ongeveer 30 minuten in de laminare stroomventilatie om de cellen gelijkmatig te verdelen, te laten bezinken en te beginnen met hechten aan de bodem van de putjes. Plaats de platen na 30 minuten in een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Bekijk de trophoblasten na 24 uur kweek onder een microscoop om de hechting en de juiste trophoblastmorfologie te bevestigen.De cellen kunnen na 24 uur kweek worden behandeld. Zuig het kweekmedium van de cellen af en vervang het door twee milliliter TNF-alpha gesupplementeerd medium per putje. Plaats de platen terug in de 37 graden Celsius incubator.Na 24 uur TNF-alpha blootstelling, vervang het TNF-alpha gesupplementeerde medium door compleet medium. Incubeer nogmaals gedurende 24 uur. 24 uur na verwijdering van TNF-alpha, zuig het medium af en spoel de cellen voorzi

a-primary-human-trophoblast-model-to-study-effect-inflammation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Een eenvoudige methode om primaire humane placenta (villi) en decidua orgaankweken vast is beschreven. Villous en deciduale orgel culturen zijn van onschatbare waarde tools voor het bestuderen van de pathogenese bij de mens maternale-foetale interface. Infectie met de facultatief intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes wordt aangetoond.

Menselijke placenta en deciduale Organ culturen om infecties bij de moeder op foetus Interface Studie

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Hier is een protocol voor het kweken van placenta-explantaten onder constante stroomomstandigheden. Deze aanpak verbetert traditionele statische villeuze kweeksystemen door de replicatie van dynamische fysiologische omgevingen mogelijk te maken.

Ex Vivo Placenta Explant Flow Culture - De dynamische omstandigheden in de baarmoeder nabootsen

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Met een ex vivo explant-model worden kleine stukjes van het rostrale deel van visceraal wit vetweefsel van magere muizen 7–10 dagen gekweekt, waardoor ontsteking in vetweefsel tijdens vetrijke voeding kan worden geïnduceerd en bestudeerd.

Een ex vivo muismodel voor vetrijke vetachtige vetweefselontsteking

Leer hoe je primaire humane trofoblasten isoleert uit placentaweefsel om de effecten van TNFα-gemedieerde ontsteking op genregulatie te bestuderen. Dit model helpt onderzoekers obesitas-gerelateerde placentadysfunctie te begrijpen.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta (Video) | JoVE Journal

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Meer video's verkennen