Name: De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer hoe je Caenorhabditis elegans gebruikt om schimmelinfecties en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers virulentiefactoren en immuunreacties te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd en ondersteund door Worcester Polytechnic Institute.

1. voorbereiding van Nematode groei Medium (NGM) <ol><li>voor 1 L van media, 20 gram agar, 2,5 g organische stikstofbron (b.v., bacto-pepton) en 3 g natriumchloride in een erlenmeyer van 2 L combineren. Voeg 975 mL steriel water.
	<ol><li>Toevoegen in een steriele roer bar. Als gebruik van een automatische media Schenker, de autoclaaf buis en de media gedurende 15 minuten; media moet worden gesteriliseerde met autoclaaf voor meer als een hoger volume bestaat.</li>
	</ol></li> <li>Media ingesteld op roer plaat en laat afkoelen.
	<ol><li>Media eenmaal warm aan te raken (ongeveer 60 ° C) aseptisch Voeg 1 mL 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2 KPO 4 25 mL en 1 mL 0,5% cholesterol in ethanol.</li>
		<li>Giet media (met de hand, of door automatische pomp) onder laminaire flow in 35 x 10 mm steriele petrischalen. Laten drogen onder motorkap voor 1-2 dagen vóór gebruik. 
		Opmerking: Platen moeten worden bewaard bij 4 ° C om verontreiniging te voorkomen.</li>
	</ol></li></ol> 2. Maken van een Worm Pick <ol><li>Knip een stukje van 1,5 cm van aluminium draad. Ongeveer 0,5 cm van deze lengte zorgvuldig invoegen in het puntje van een pipet van Pasteur.
	<ol><li>Met behulp van een bunsenbrander of alcohol lamp, smelten het glas pipette uiteinde door deze te langzaam draaien in de vlam totdat de draad veilig de pipet, zonder afbreuk te doen aan de oorspronkelijke vorm van het uiteinde van de pipet wordt nageleefd.</li>
	</ol></li></ol> 3. Voorbereiding van E. coli cultuur <ol><li>met een steriele lus, één kolonie van E. coli stam OP50 in 200 mL Bouillon Luria beënten. Na een nacht bebroeden met schudden bij 37 ° C.</li>
	<li>De vloeibare cultuur is klaar voor gebruik de volgende dag en kunnen bij 4 ° C wanneer niet in gebruik worden bewaard. 
	Opmerking: De stam E. coli, OP50, wordt gebruikt als een bron van voedsel voor C. elegans. Deze cultuur kan worden gebruikt voor tot verscheidene maanden, wanneer bewaard bij 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essentiële C. elegans onderhoud <ol><li>zaad NGM agar platen met E. coli bereid door ongeveer 50-100 µL van bereid OP50 vloeibare cultuur in het midden van de plaat spotten.</li>
	<li>Dekking van platen en laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Eenmaal droog, platen bij 37 ° C's nachts voor snelle groei plaats of houden bij kamertemperatuur, tragere groei is desgewenst.</li>
	<li>Wormen toevoegen aan de plaat door ofwel &#34; chunking, &#34; (zie protocol stap 5 &#34; Chunking en plukken wormen &#34;), wormen individueel plukken of worm eieren rechtstreeks op het bord plaatsen (zie protocol stap 6 &#34; ei voorbereiding &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking en plukken wormen Opmerking: &#34; Chunking, &#34; verwijst naar een praktijk die is gebruikelijk in C. elegans onderhoud. Dit betekent snijden van een deel van de NGM agarplaat waarin wormen, en overdracht van dit stuk op een nieuwe plaat, dus ook het overbrengen van een groot aantal wormen in het proces. Besmetting kan ook worden gesneden uit de plaat op deze manier. Bij het afhalen van wormen, is het belangrijk om de integriteit van de agar omdat wormen in gaten in de agar kunnen worden verloren. Daarnaast is het belangrijk dat de pick afkoelen voordat het aanraken van de plaat om te voorkomen dat de agar smelten of verbranden van de wormen.
<ol><li>Om snel grote hoeveelheden van worms op nieuwe borden, Knip een stukje van NGM agar met de geselecteerde wormen met behulp van een spatel. Verwijder de geslepen stuk en leg het gezicht naar beneden in de rand van het gazon voor OP50 op een nieuwe plaat.</li>
	<li>Overdracht wormen individueel zoals hieronder beschreven in protocol stap 8.2, &#34; Survival Assay, &#34; met behulp van een worm kiezen. De draad in de worm pick vlam totdat het rood. Het verwijderen van het vuur en laat het afkoelen gedurende een paar seconden.</li>
	<li>Met behulp van de draad op de pick, voorzichtig schrapen het gazon van de OP50 cultuur geteeld op de nieuwe plaat, die betrekking hebben op de draad op de Kies.</li>
	<li>De viskeuze cultuur die betrekking hebben op het uiteinde van de draad maakt wormen vasthouden aan het uiteinde van de pick, dus voorzichtig pick-up van geselecteerde wormen met behulp van een veeg motie.</li>
	<li>Zodra geselecteerde wormen zijn verzameld, plaats ze op een nieuwe bord door zachtjes veeg cultuur over de agar. Plaats de draad in de vlam te verwijderen van de resterende cultuur op de Kies.</li>
</ol> 6. Bereiding ei <ol><li>ongeveer 20 volwassen dieren (ongeveer 2-3 dagen na het uitkomen als volwassen bij 20 ° C) plaatsen door plukken of chunking zoals beschreven in het protocol stap 5, &#34; Chunking en plukken wormen, &#34; op een bord met 50 agarvoedingsbodem µL van E. coli stam, OP50.</li>
	<li>Voor het verzamelen van de eieren, overgiet de plaat met 10 mL van de M9 buffer na 1-2 dagen. Met behulp van een glazen serologische Pipet, swirl en zachtjes doorroeren de inhoud op de agarplaat vrij te geven van de eieren vast aan OP50 of volwassen dieren. Verzamelen van alle van de vloeistof met de eieren en de volwassenen.</li>
	<li>Transfer M9 en OP50 oplossing in een 15 mL conische buis. Centrifugeer de conische buis 15 mL bij 2100 x g gedurende 2 min.</li>
	<li>Ongeveer 9 mL van het supernatans gecombineerd zonder verstoring van de OP50 pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 2 mL steriel water 1 mL bleekwater en 1 mL van 0,25 M NaOH.</li>
	<li>Meng zachtjes door inversie totdat het merendeel (ongeveer 70 procent) van de volwassen dieren lysed verschijnen; meestal eieren intact blijven tijdens deze korte bleekmiddel behandeling wegens hun shell. Centrifugeer de conische buis bij 990 x g gedurende 2 min.</li>
	<li>Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 10 mL M9 buffer.</li>
	<li>Centrifugeren de conische buis in 990 x g voor 2 min. Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet. Resuspendeer pellet met 200 µL van M9 buffer. 
	Opmerking: Ei voorbereiding mogelijk meerdere proeven. Eieren kunnen worden vernietigd als zij als bleekmiddel te lang worden blootgesteld. Als geen eitjes, daling van de concentratie van het bleekmiddel in oplossing of afname van de duur van blootstelling aan het bleekmiddel.</li>
</ol> 7. Infectie plaat Set-up <ol><li>afzien in een steriele reageerbuis 3-5 mL van de YPD en het inoculeren met een één kolonie van Candida albicans met behulp van een steriele lus.
	<ol><li>De buis te plaatsen op een hiervoor trommel voor ongeveer 16-18 h bij 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Label een 1,5 mL microfuge buis bevat C. albicans, en andere OP50 bevatten. Het gewicht van elke lege buis.
	<ol><li>Plaats 500 µL van de overnachting C. albicans cultuur in buis label C. albicans en 1.500 µL van de nachtelijke OP50 cultuur (uit stap 3.1) in de buis met het label OP50.</li>
		<li>Centrifuge voor 10 min op 16,100 x g. Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.</li>
		<li>Resuspendeer elke pellet met 500 µL van steriel water. Centrifugeer gedurende 5 min op 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Het uiteindelijke gewicht van microfuge buizen.</li>
		<li>Bepalen het gewicht van elke pellet door af te trekken van het begingewicht van de microfuge buizen van het uiteindelijke gewicht.</li>
	</ol></li> <li>Met steriel water, resuspendeer de pellet C. albicans tot 10 mg/mL en de OP50 pellet tot 200 mg/mL. Maken van een basispagina infectie Meng door het combineren van 10 µL van een oplossing van 50 mg/mL streptomycine, 2.5 µL van OP50 cultuur en 0,5 µL van C. albicans cultuur 7 µL van steriel water.
	<ol><li>Voor controle platen, maak een master mix door vervanging van het volume van C. albicans cultuur met steriel water. Zaad van 20 µL van infectie mix of OP50 control-oplossing op de platen van de centrum van NGM met behulp van een micropipet. 
		Opmerking: Ongeveer 100 wormen zijn nodig voor het bepalen van de statistische significantie tijdens de analyse. Deze test wordt meestal uitgevoerd in drievoud. Dus, een 3.2 x infectie mix en een 3.2 x control-oplossing wordt gemaakt. Deze mixen zijn gemaakt om iets meer dan 3 x het origineel om ervoor te zorgen dat een volledige 20 µL is uitgezaaid op elke plaat, waardoor ruimte voor fouten. Deze master mix wordt gemaakt omdat de keelholte van de worm te klein tijdens de eerste larvale stadia (L1-L3 is) te consumeren C. albicans. Voor blootstelling aan farmacologisch agentia zoals fluconazol ( figuur 3B), is de agent ingevoerd om het mengsel van de infectie. De concentratie van de agent is empirisch bepaald. Bijvoorbeeld in figuur 3B, 50 µM Fluconazol is vertegenwoordigd, maar 0, 12,5, 25, 50 en 100 µM fluconazol waren ook getest met behulp van hetzelfde protocol.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analyse van de vervormd anale regio (Dar) fenotype en Survival Assay <ol><li>visualiseren het fenotype Dar Opmerking: Dar is beste gevisualiseerd in de L3-stadium en daarbuiten. Dar presenteert als een klein uitsteeksel in de post anale regio van de worm ( figuur 2A), die meer op de voorgrond na verloop van tijd wordt.
	<ol><li>Bevestigen als een dier heeft Dar door snel te tikken op de plaat in het werkgebied van de dissectie-Microscoop; dieren zonder Dar wil verplaatsen achteruit onmiddellijk, terwijl de dieren met Dar zal beide noodzaak herhaald rondes van te onttrekken om te keren hun richting, of ze zal niet doen helemaal.</li>
	</ol></li> <li>Survival assay <ol><li>volledige ei voorbereiding zoals eerder beschreven in protocol stap 6, &#34; ei voorbereiding &#34;. Tellen de eieren onder het toepassingsgebied van de dissectie en de ei-oplossing met M9 verdund tot een concentratie van ongeveer 5-6 gezonde eieren per µL is bereikt. Met behulp van een precisiepipet, afzien 20 µL monster met ongeveer 30 eieren op bereid NGM bord, in het gebied tussen de bacteriecultuur en de zijkant van de plaat (worm Tüte, OP50, zijn op twee verschillende plekken).</li>
		<li>Incubate platen bij 20 ° C gedurende 48 uur. Onder een Microscoop dissectie, tellen het aantal levende en dode volwassen wormen op elke plaat, alsmede het aantal wormen met Dar. Opnemen van het percentage met Dar.</li>
		<li>Overwegen een dier dood als het reageert niet op afgeluisterd op het hoofd door een aluminium draad of op de plaat te onttrekken.</li>
		<li>Om de andere dag, overdracht van resterende volwassen wormen door plukken zoals beschreven in het protocol stap 5, &#34; Chunking en plukken wormen, &#34; op een nieuwe infectie of besturingselement bord. Op dit punt, indien nodig, een survival-test uitvoeren door het bijhouden van het aantal ontbrekende, levende en dode wormen elke dag. 
		Opmerking: Deze test werkt voor twee weken, beginnend met ei voorbereiding. Bovendien, de ei-oplossing moet niet achterwege worden gelaten op de bacteriële cultuur, zoals de oplossing kan sporen bevatten van bleekmiddel die de OP50 kan doden. De oplossing moet ook worden afgezien van ongeveer 0,5 cm van de rand van de plaat, zoals eieren tussen de zijkanten van de plaat en de agar geplakt kunnen worden. Bovendien, als gevolg van de snelle verspreiding van wormen, overdracht van volwassenen op nieuwe borden is van cruciaal belang om ze te scheiden van hun nageslacht.</li>
	</ol></li> <li>Analyseren Survival <ol><li>analyseren van de resultaten met behulp van software van de analyse van de kromme van overleving (Zie materiaallijst).</li>
		<li>Vergelijk survival krommen met behulp van de methode Grehan-Breslow-Wilcoxon (ervan uitgaande dat de gegevens uit de vroege tijden van overleving nauwkeuriger dan latere tijden zijn, gewicht de gegevens dienovereenkomstig) evenals Logrank statistische hulpmiddelen 45. 
		Opmerking: Bijvoorbeeld in figuur 4B -C, het voortbestaan van wormen met mutant C. albicans behandeld wordt vergeleken met degenen behandeld met isogene wild-type besturingselementen of complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ellis, H. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans.</a> Cell. 44 (6), 817-829 (1986).</li>
<li>Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+gene+ced-9+protects+cells+from+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death.</a> Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potential+anti-infectives+against+Staphylococcus+aureus+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> BMC Complement Altern Med. 14, 4(2014).</li>
<li>Marsh, E. K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%2C+a+model+organism+for+investigating+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).</li>
<li>Sem, X., Rhen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Salmonella+enterica+in+Caenorhabditis+elegans+relies+on+disseminated+oxidative+stress+in+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host.</a> PLoS One. 7 (9), e45417(2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000982(2010).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Bae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+virulence+genes+identified+by+bursa+aurealis+mutagenesis+and+nematode+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).</li>
<li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).</li>
<li>Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+innate+immune+response+triggered+by+Salmonella+enterica+requires+intact+LPS+and+is+mediated+by+a+MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway.</a> Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).</li>
<li>Kesika, P., Balamurugan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Shigella+boydii+infection+in+Caenorhabditis+elegans+and+bioinformatics+analysis+of+immune+regulatory+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions.</a> Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).</li>
<li>Cinar, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+hemolysin+is+required+for+lethality%2C+developmental+delay%2C+and+intestinal+vacuolation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (7), e11558(2010).</li>
<li>Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Candida+albicans+AP-1+protein+against+host+derived+ROS+in+in+vivo+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection.</a> Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
<li>Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans-based%2C+whole+animal%2C+in+vivo+screen+for+the+identification+of+antifungal+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds.</a> Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. 7 (6), e1002074(2011).</li>
<li>Dieterich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstructed+human+epithelia+reveal+contributions+of+Candida+albicans+EFG1+and+CPH1+to+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion.</a> Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).</li>
<li>Chen, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+Candida+albicans+cph1%2Fcph1+efg1%2Fefg1+transcription+factor+mutant+establishing+restricted+zone+of+infection+in+a+mouse+model+of+systemic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopathol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).</li>
<li>Ricicova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+formation+in+a+new+in+vivo+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model.</a> Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).</li>
<li>Fazly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+filastatin%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+Candida+albicans+adhesion%2C+morphogenesis%2C+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).</li>
<li>Lo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfilamentous+C.+albicans+mutants+are+avirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent.</a> Cell. 90 (5), 939-949 (1997).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+damage+and+neutropenia+are+required+for+Candida+albicans+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>McDonough, K. A., Rodriguez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+cyclic+AMP+in+microbial+pathogens%3A+from+signal+to+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).</li>
<li>Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+white-opaque+phenotypic+switching+in+Candida+albicans+by+the+Efg1p+morphogenetic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator.</a> Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).</li>
<li>Li, F., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAP1%2C+a+Candida+albicans+gene+involved+in+binding+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells.</a> Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).</li>
<li>Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+Cph1p+and+Efg1p+mediate+activation+of+the+Candida+albicans+virulence+gene+SAP5+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection.</a> Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).</li>
<li>Korting, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+the+hyphal-independent+Candida+albicans+proteinase+genes+SAP1+and+SAP3+in+the+efg1+mutant+is+associated+with+attenuated+virulence+during+infection+of+oral+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium.</a> J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).</li>
<li>Chamilos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+facile+model+for+large-scale+studies+of+virulence+mechanisms+and+antifungal+drug+efficacy+in+Candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species.</a> J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Mallo, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+antibacterial+defense+system+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible antibacterial defense system in C. elegans.</a> Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).</li>
<li>Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enzymes+are+required+for+DAF-16-mediated+immunity+due+to+generation+of+reactive+oxygen+species+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).</li>
<li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li>
<li>Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ce-Duox1%2FBLI-3+generated+reactive+oxygen+species+trigger+protective+SKN-1+activity+via+p38+MAPK+signaling+during+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans.</a> PLoS Pathog. 7 (12), e1002453(2011).</li>
<li>Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+and+human+dual+oxidase+1+%28DUOX1%29+%26%2334%3Bperoxidase%26%2334%3B+domains%3A+insights+into+heme+binding+and+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) &#34;peroxidase&#34; domains: insights into heme binding and catalytic activity.</a> J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).</li>
<li>Issi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Cluster+Transcription+Factors+Alter+Virulence+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans.</a> Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).</li>
<li>Ford, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans.</a> Elife. 4, e00662(2015).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).</li>
<li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+Model+Host+for+Staphylococcus+aureus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis.</a> Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methoden voor de keuring van C. elegans infectie en overleving over levenslange blootstelling aan C. albicans die wij hebben beschreven kunnen worden aangepast voor het testen van een ander pathogeen. Vloeibare culturen van andere bacteriën of schimmels kunnen worden gemaakt en geschikt voor vervoedering aan C. elegans op een vergelijkbare manier. Bovendien, seriële infecties kunnen worden bepaald door eerst de larve tot een pathogeen bloot te stellen zoals beschreven, en vervolgens de diere...

C. elegans is gebruikt als een krachtige modelorganisme voor meer dan 50 jaar. In de jaren 1960, een Zuid-Afrikaanse bioloog Sydney Brenner pionier het gebruik van C. elegans om te studeren van neuronale ontwikkeling, de weg vrijmaakt voor een lange lijn van wetenschappers te bestuderen van de verschillende aspecten van de biologie van de cel en dier in nematoden. Dit geslacht omvat Nobelprijswinnaars Craig Mello en Andrew Fire voor hun RNAi werk1, Robert Horvitz en John Sulston voor hun werk op orgel ontwikkeling en apoptosis2,3,4, Martin Chalfie voor zijn werk aan groen fluorescent proteïne5. Hoewel dit model-organisme traditioneel gebruikt is voor het bestuderen van de moleculaire en ontwikkelingstoxiciteit biologie, in de afgelopen 15 jaar, zijn onderzoekers begonnen met het gebruiken van C. elegans om te onderzoeken van de biologie van verschillende menselijke pathogenen waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaen Serratia marcescens6,7,8,9,10. Deze studies is gebleken dat veel van de mechanismen die betrokken zijn bij de mens-pathogen interactions zijn geconserveerd in nematoden, maar ook dat er zijn sommige immuniteit mechanismen die uniek voor dit model organisme11,12 zijn. In de natuur, heeft C. elegans ontmoetingen een verscheidenheid van bedreigingen van de geconsumeerde ziekteverwekkers aanwezig in de bodem en dit een sterke selectieve druk om te evolueren en handhaven van een verfijnde ingeboren immune systeem in de intestinale lumen. Veel van de genen en de mechanismen die betrokken zijn bij de bescherming van intestinale lumen zijn georkestreerd door zeer geconserveerd elementen die ook bestaan in hogere zoogdieren11,13. C. elegans vertegenwoordigt daarom een groot model te bestuderen van de gastro-intestinale ziekteverwekkers zoals Salmonella enterica14, Shigella boydii15of Vibrio cholera16.
We benadrukken hier de opmerkelijke veelzijdigheid van C. elegans als een host model te bestuderen van infectieuze agentia zoals C. albicans. C. elegans als een host model zorgt voor hoge throughput screening voor virulentie die is minder duurder en tijdrovender dan een muismodel, dat wordt gebruikt bij het bestuderen van candidiasis42.
In deze studie, laten we zien dat dit model en de bijbehorende overleving assay betrouwbaar inzetbaar voor het bestuderen van de host aangeboren immuun effectoren belangrijk om infecties, pathogen determinanten die virulentie rijden, tegen te gaan en farmacologische verbindingen die kunnen ingrijpen in de pathogenese. Ongelijk aan eerder beschreven tests, deze methode biedt een middel van het bestuderen van de blootstelling aan een ziekteverwekker gedurende de levensduur van het dier, van het larvale stadium naar volwassenheid, in plaats van alleen volwassenheid dood43,44. Kortom, onze C. elegans - is C. albicans model een veelzijdige en krachtige tool die gebruikt kan worden, niet alleen om te bestuderen van de genetische basis dat station infectie en immuniteit, maar ook voor het identificeren van nieuwe compounds voor therapeutische interventie.

<table><tbody><tr><td>Agar (gegranuleerd, bacteriologisch kwaliteit)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumdraad (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscoop</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans stam Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Kwaliteit, minimaal 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Cultuurbuizen (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie Microscoop (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Overlevingscurve Analyse Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Schaaltjes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

de nematode caenorhabditis elegans - een veelzijdig in vivo -model om te studeren van host-microbe interacties

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We tonen een methode met behulp van Caenorhabditis elegans als een host model aan de studie van microbiële interactie. Microben worden ingevoerd via de voeding de primaire locatie voor ziekte van de darm te maken. De nematode darm structureel en functioneel bootst zoogdieren darmen en is transparant waardoor het vatbaar voor microscopisch onderzoek van de kolonisatie. Hier laten we zien dat ziekteverwekkers leiden ziekte en dood tot kunnen. We kunnen identificeren van de microbiële mutanten die aantonen dat veranderde virulentie. Haar geconserveerde aangeboren reactie op biotische onderstreept maakt C. elegans een uitstekend systeem om te sonderen facetten van gastheer aangeboren immuun-interacties. We laten zien dat hosts met mutaties in het gen dual oxidase geen reactieve zuurstof soorten en zijn niet in staat om te weerstaan microbiële belediging. Wij tonen verder de veelzijdigheid van de bepaling van de gepresenteerde overleven door aan te tonen dat het kan worden gebruikt om het bestuderen van de effecten van remmers van microbiële groei. Deze test kan ook worden gebruikt om schimmel virulentiefactoren als doelen voor de ontwikkeling van nieuwe antischimmel agenten ontdekken, evenals de gelegenheid bieden om de host-microbe interacties verder te ontdekken. Het ontwerp van deze bepaling leent zich goed voor hoge doorvoer geheel-genoom schermen, terwijl de mogelijkheid om cryo-preserve wormen voor toekomstig gebruik het een kosteneffectieve en aantrekkelijk geheel diermodel maakt te bestuderen.

Een pathogenese assay (Figuur 1) met C. albicans en C. elegans is eerder beschreven door onze lab17,18 en andere labs19,20. We tonen de inschikkelijkheid van het gebruik van C. elegans om te studeren C. albicans virulentie waaruit bleek dat C. albicans cellen snel door de wormen zijn ingenomen en zi...

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Het algemene doel van deze assay is om het effect van schimmelinfectie in het modelorganisme C.Elegans te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke mechanistische vragen op het gebied van infectieziekten, zoals virulentiefactoren van pathogenen, immuuneffectoren van de gastheer, evenals geneesmiddelontdekking. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een experimenteel hanteerbaar systeem is om gastheer-pathogeeninteracties vanuit beide gezichtspunten te bestuderen.Het is een snel, eenvoudig en kosteneffectief systeem. Hoewel deze specifieke methode inzicht kan geven in schimmelpathogenen, kan deze ook worden toegepast op andere infectieuze agentia, zoals bacteriën of zelfs meerdere organismen om microbiële interacties in een levende gastheer te bestuderen. Om een wormenprik te maken, snijdt u een stuk aluminiumdraad van 1,5 centimeter en steekt u ongeveer 0,5 centimeter van de draad voorzichtig in de punt van een Pasteurpipet.Gebruik een Bunsen-brander of alcohollamp om de glaspipetpunt te smelten door deze langzaam in de vlam te draaien tot de draad stevig aan de pipet is bevestigd zonder de oorspronkelijke vorm van de pipetpunt te compromitteren. Buig tenslotte met behulp van een pincet voorzichtig het uiteinde van de draad om een kleine lus te maken. Gebruik een spatel om snel grote hoeveelheden wormen op nieuwe platen over te brengen door een stuk NGM-agar met de geselecteerde wormen af te snijden.Verwijder vervolgens het afgesneden stuk en plaats het met de afsnede naar beneden op de rand van de OP50-patch op een nieuwe plaat. Om wormen individueel over te brengen, zet de draad in de wormenprik in de vlam tot deze rood is, verwijder deze uit de vlam en laat deze enkele seconden afkoelen. Gebruik de draad op de prik om voorzichtig de patch van de OP50-cultuur te schrabben die op de nieuwe plaat is gegroeid, waarbij de draad op de prik wordt bedekt.De viskeuze cultuur die de punt van de draad bedekt, zorgt ervoor dat wormen aan de punt van de pit blijven plakken. Gebruik dus een zwaaiende beweging om geselecteerde wormen voorzichtig op te rapen. Zodra geselecteerde wormen zijn verzameld, plaatst u ze op een nieuwe plaat door de cultuur voorzichtig over het agar te vegen.Plaats vervolgens de draad in de vlam om resterende cultuur op de prik te verwijderen. Plaats ongeveer 20 volwassen dieren door ze op te rapen of in een kluit op een plaat te zetten die is voorzien van 50 microliter E.coli-stam OP50. Om de eieren na een tot twee dagen te verzamelen, overspoelt u de plaat met 10 milliliter M9-buffer.Gebruik vervolgens een glazen serologische pipet om te draaien en zachtjes te roeren in de inhoud op de agarplaat om volwassen dieren of eieren die aan OP50 vastzitten los te maken. Verzamel alle vloeistof die de eieren en volwassenen bevat. Breng de M9- en OP50-oplossing over in een kegelvormige buis van 15 milliliter.Centrifugeer de buis gedurende twee minuten bij 2.100 x g. Aspirant vervolgens ongeveer negen milliliter supernatant zonder de pellet te verstoren. Gebruik vervolgens twee milliliter steriel water, één milliliter bleekmiddel en één milliliter 0,25 molair natriumhydroxide om de pellet te resuspenderen.Meng voorzichtig door inversie tot ongeveer 70% van de volwassen dieren gelyseerd lijkt. Meestal blijven eieren intact tijdens deze korte bleekbehandeling vanwege hun schaal. Het is van cruciaal belang dat de hoeveelheid blootstelling aan bleekmiddel in deze stap beperkt is.
Langdurige blootstelling aan bleekmiddel zal de eieren vernietigen. Als de eiervoorbereiding mislukt, beperk dan de duur van de blootstelling aan bleekmiddel of verdun de oplossing. Centrifugeer de kegelvormige buis gedurende twee minuten bij 990 x g.
Aspirant de supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de pellet in 10 milliliter M9-buffer. Na opnieuw centrifugeren en verwijderen van de supernatant zonder de pellet te verstoren, gebruik 200 microliter M9-buffer om de pellet te resuspenderen.
Gebruik een steriele lus om een enkele kolonie Candida albicans in een steriele testbuis te inoculeren. Plaats de buis op een roterende trommel bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 16 tot 18 uur. Label één microfugebuis van 1,5 milliliter om C.albicans te bevatten en een andere om OP50 te bevatten en noteer het gewicht van elke lege buis.
Breng 500 microliter van de overnachtelijke C.albicans-cultuur over in de buis gelabeld C.Albicans. En 1500 microliter van de overnachtelijke OP50-cultuur in de buis gelabeld OP50. Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 16.100 x g, aspirant vervolgens de supernatant zonder de pellets te verstoren.
Gebruik 500 microliter steriel water om elke pellet te resuspenderen. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij 16.100 x g. Aspirant de supernatant zonder de pellets te verstoren.
Noteer vervolgens het eindgewicht van de microfugebuizen. Bepaal het gewicht van elke pellet door het aanvankelijke gewicht van de microfugebuizen af te trekken van het eindgewicht. Gebruik steriel water om de C.albicans-pellet te resuspenderen tot 10 milligram per milliliter en de OP50-pellet tot 20 milligram per milliliter.
Maak vervolgens een masterinfectiemix door 10 microliter van een 50 milligram per milliliter oplossing van Streptomycine te combineren. 2,5 microliter OP50-cultuur. 0,5 microliter C.Albicans-cultuur, en 7 microliter steriel water.
Voor controleplaten, maak een mastermix door het volume van de C.albicans-cultuur te vervangen door steriel water. Gebruik vervolgens een micropipet om 20 microliter infectiemix of OP50-controleoplossing in het midden van NGM-platen te zaaien. Tel de eieren na het eerder in deze video getoonde bereiden onder de dissectiescoop.
En gebruik M9 om de eieroplossing te verdunnen tot een concentratie van ongeveer vijf tot zes ge

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Compostmicrokosmos brengt de microbiële diversiteit in de natuur in het laboratorium om microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans te vergemakkelijken. Hier worden protocollen verstrekt voor het opzetten van microkosmosexperimenten, waarbij de experimenten het vermogen aantonen om de microbiële diversiteit van het milieu te moduleren om de relaties tussen microbiële diversiteit in het milieu en de samenstelling van het microbioom van de wormdarm te onderzoeken.

Compost microkosmos als microbieel diverse, natuurlijk-achtige omgevingen voor microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Leer hoe je Caenorhabditis elegans gebruikt om schimmelinfecties en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers virulentiefactoren en immuunreacties te onderzoeken.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Meer video's verkennen