De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties
18 oktober 2017
Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.
Het algemene doel van deze assay is om het effect van schimmelinfectie in het modelorganisme C.Elegans te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke mechanistische vragen op het gebied van infectieziekten, zoals virulentiefactoren van pathogenen, immuuneffectoren van de gastheer, evenals geneesmiddelontdekking. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een experimenteel hanteerbaar systeem is om gastheer-pathogeeninteracties vanuit beide gezichtspunten te bestuderen.
Het is een snel, eenvoudig en kosteneffectief systeem. Hoewel deze specifieke methode inzicht kan geven in schimmelpathogenen, kan deze ook worden toegepast op andere infectieuze agentia, zoals bacteriën of zelfs meerdere organismen om microbiële interacties in een levende gastheer te bestuderen. Om een wormenprik te maken, snijdt u een stuk aluminiumdraad van 1,5 centimeter en steekt u ongeveer 0,5 centimeter van de draad voorzichtig in de punt van een Pasteurpipet.
Gebruik een Bunsen-brander of alcohollamp om de glaspipetpunt te smelten door deze langzaam in de vlam te draaien tot de draad stevig aan de pipet is bevestigd zonder de oorspronkelijke vorm van de pipetpunt te compromitteren. Buig tenslotte met behulp van een pincet voorzichtig het uiteinde van de draad om een kleine lus te maken. Gebruik een spatel om snel grote hoeveelheden wormen op nieuwe platen over te brengen door een stuk NGM-agar met de geselecteerde wormen af te snijden.
Verwijder vervolgens het afgesneden stuk en plaats het met de afsnede naar beneden op de rand van de OP50-patch op een nieuwe plaat. Om wormen individueel over te brengen, zet de draad in de wormenprik in de vlam tot deze rood is, verwijder deze uit de vlam en laat deze enkele seconden afkoelen. Gebruik de draad op de prik om voorzichtig de patch van de OP50-cultuur te schrabben die op de nieuwe plaat is gegroeid, waarbij de draad op de prik wordt bedekt.
De viskeuze cultuur die de punt van de draad bedekt, zorgt ervoor dat wormen aan de punt van de pit blijven plakken. Gebruik dus een zwaaiende beweging om geselecteerde wormen voorzichtig op te rapen. Zodra geselecteerde wormen zijn verzameld, plaatst u ze op een nieuwe plaat door de cultuur voorzichtig over het agar te vegen.
Plaats vervolgens de draad in de vlam om resterende cultuur op de prik te verwijderen. Plaats ongeveer 20 volwassen dieren door ze op te rapen of in een kluit op een plaat te zetten die is voorzien van 50 microliter E.coli-stam OP50. Om de eieren na een tot twee dagen te verzamelen, overspoelt u de plaat met 10 milliliter M9-buffer.
Gebruik vervolgens een glazen serologische pipet om te draaien en zachtjes te roeren in de inhoud op de agarplaat om volwassen dieren of eieren die aan OP50 vastzitten los te maken. Verzamel alle vloeistof die de eieren en volwassenen bevat. Breng de M9- en OP50-oplossing over in een kegelvormige buis van 15 milliliter.
Centrifugeer de buis gedurende twee minuten bij 2.100 x g. Aspirant vervolgens ongeveer negen milliliter supernatant zonder de pellet te verstoren. Gebruik vervolgens twee milliliter steriel water, één milliliter bleekmiddel en één milliliter 0,25 molair natriumhydroxide om de pellet te resuspenderen.
Meng voorzichtig door inversie tot ongeveer 70% van de volwassen dieren gelyseerd lijkt. Meestal blijven eieren intact tijdens deze korte bleekbehandeling vanwege hun schaal. Het is van cruciaal belang dat de hoeveelheid blootstelling aan bleekmiddel in deze stap beperkt is.
Langdurige blootstelling aan bleekmiddel zal de eieren vernietigen. Als de eiervoorbereiding mislukt, beperk dan de duur van de blootstelling aan bleekmiddel of verdun de oplossing. Centrifugeer de kegelvormige buis gedurende twee minuten bij 990 x g.
Aspirant de supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de pellet in 10 milliliter M9-buffer. Na opnieuw centrifugeren en verwijderen van de supernatant zonder de pellet te verstoren, gebruik 200 microliter M9-buffer om de pellet te resuspenderen.
Gebruik een steriele lus om een enkele kolonie Candida albicans in een steriele testbuis te inoculeren. Plaats de buis op een roterende trommel bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 16 tot 18 uur. Label één microfugebuis van 1,5 milliliter om C.albicans te bevatten en een andere om OP50 te bevatten en noteer het gewicht van elke lege buis.
Breng 500 microliter van de overnachtelijke C.albicans-cultuur over in de buis gelabeld C.Albicans. En 1500 microliter van de overnachtelijke OP50-cultuur in de buis gelabeld OP50. Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 16.100 x g, aspirant vervolgens de supernatant zonder de pellets te verstoren.
Gebruik 500 microliter steriel water om elke pellet te resuspenderen. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij 16.100 x g. Aspirant de supernatant zonder de pellets te verstoren.
Noteer vervolgens het eindgewicht van de microfugebuizen. Bepaal het gewicht van elke pellet door het aanvankelijke gewicht van de microfugebuizen af te trekken van het eindgewicht. Gebruik steriel water om de C.albicans-pellet te resuspenderen tot 10 milligram per milliliter en de OP50-pellet tot 20 milligram per milliliter.
Maak vervolgens een masterinfectiemix door 10 microliter van een 50 milligram per milliliter oplossing van Streptomycine te combineren. 2,5 microliter OP50-cultuur. 0,5 microliter C.Albicans-cultuur, en 7 microliter steriel water.
Voor controleplaten, maak een mastermix door het volume van de C.albicans-cultuur te vervangen door steriel water. Gebruik vervolgens een micropipet om 20 microliter infectiemix of OP50-controleoplossing in het midden van NGM-platen te zaaien. Tel de eieren na het eerder in deze video getoonde bereiden onder de dissectiescoop.
En gebruik M9 om de eieroplossing te verdunnen tot een concentratie van ongeveer vijf tot zes ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig gastheermodel voor het onderzoeken van microbiële interacties, met een specifieke focus op schimmelinfecties. De methode stelt onderzoekers in staat om fundamentele mechanistische vragen over infectieziekten te onderzoeken, waaronder de virulentie van pathogenen en de immuunresponsen van de gastheer.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Microbiële interacties
- Onderzoek naar infectieziekten
- Gastheer-pathogeen-dynamiek
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans dient als een effectief modelorganisme.
- De studie heeft als doel de effecten van schimmelinfecties te begrijpen.
- Dit model kan ook worden aangepast voor andere infectieuze agentia.
- Het biedt een kosteneffectief en hanteerbaar systeem voor experimenten.
Doel van de studie
- Om de effecten van schimmelinfectie in C. elegans waar te nemen.
- Om virulentiefactoren van pathogenen te onderzoeken.
- Om immuuneffectoren van de gastheer en geneesmiddelenontwikkeling te verkennen.
Gebruikte methoden
- Assay voor het observeren van de effecten van schimmelinfecties.
- Gebruik van C. elegans als gastheermodel.
- Experimentele opzet voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties.
- Techniek voor het oppikken van wormen met behulp van aluminiumdraad en een pipet.
Belangrijkste resultaten
- Inzichten in schimmelpathogenen en hun interacties met gastheren.
- Begrip van de immuunreacties van de gastheer op infecties.
- Potentiële toepassingen bij de ontdekking van geneesmiddelen.
- Kader voor het bestuderen van diverse infectieuze agentia.
Conclusies
- C. elegans is een waardevol model voor onderzoek naar infectieziekten.
- De methode is aanpasbaar voor het bestuderen van meerdere pathogenen.
- Deze benadering vergroot het inzicht in de dynamiek tussen gastheer en pathogeen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Caenorhabditis elegans biedt een schaalbaar, kosteneffectief in vivo model voor het verminderen van risico's bij studies naar gastheer-microbe-interacties in vroege discovery-fasen. De transparante anatomie en geconserveerde aangeboren immuniteit maken mechanistische analyse van virulentiefactoren en gastheer-afweerroutes mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij target-validatie. Dit systeem vormt een brug tussen fenotypische screening en translationele biomarker-ontdekking voor de identificatie van antifungale en antibacteriële lead-verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om microbiële virulentiegenen, zoals EFG1 en CPH1 in Candida albicans, te onderzoeken via overlevingsassays.
- Operationele waarde: Ondersteunt high-throughput whole-genome screens om gastheer- of pathogeenmutanten met een gewijzigde virulentie te identificeren.
- Strategische waarde: Faciliteert target de-risking door genetische perturbaties te koppelen aan meetbare overlevingsfenotypes in een context van het gehele organisme.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantificering van pathogenenkolonisatie mogelijk via fluorescerende markering (bijv. RFP-gelabelde C. albicans) in het darmlumen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde overlevingsmetingen (levend/dood-score, Dar-fenotype) voor een reproduceerbare uitvoering van de assay over intervallen van 48 uur.
- Strategische waarde: Maakt screening van chemische inhibitoren of genetische bibliotheken mogelijk om antifungale verbindingen of virulentiefactoren te ontdekken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert geconserveerde aangeboren immuunresponsen van de gastheer, waaronder dual-oxidase-afhankelijke productie van reactieve zuurstofcomponenten, die relevant zijn voor de mucosale verdediging van zoogdieren.
- Operationele waarde: De mogelijkheid tot cryopreservatie garandeert de langetermijnbeschikbaarheid van stammen, wat variabiliteit vermindert en longitudinale onderzoeksontwerpen mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de essentialiteit van het doelwit voor de virulentie van de pathogeen te valideren voordat er wordt geïnvesteerd in zoogdiermodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door fenotypische validatie mogelijk te maken van targets die zijn geïdentificeerd via genomische of chemische screening, met directe toepasbaarheid voor lead-identificatiecampagnes.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van hypothesen over gastheer-pathogeen interacties via meetbare uitkomsten zoals overlevingskinetiek en kolonisatie-imaging.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten, waaronder overlevingscurves en fluorescentie-intensiteit, voor de vergelijking van verbindingen of genotypen.
- Analytics: Genereert statistische eindpunten (bijv. mediane overleving, % Dar-positieve wormen) om prioritering van hits en modellering van structuur-activiteitsrelaties mogelijk te maken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinisch werk via geconserveerde immuunroutes (bijv. ROS-generatie) die mammalian epitheliale afweermechanismen weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: De aanpasbaarheid van het platform bij bacteriële, fungale en polymicrobiële infecties ondersteunt hergebruik binnen meerdere programma's voor infectieziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar virulentie en immuniteit door directe visualisatie van intestinale kolonisatie en real-time tracking van overleving.
- Operationele waarde: Lage kosten, korte generatietijd en geschiktheid voor automatisering verhogen de doorvoer en verminderen de uitgaven aan hulpbronnen per assay.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door orthogonale validatie van targets te bieden in een fysiologisch relevante gastheercontext.
- Impact op portfolio: Maakt vroege triage van antimicrobiële leads mogelijk door verbindingen te filteren die geen effectiviteit vertonen in een whole-host infectiemodel.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in de hantering van C. elegans, microbiële kweek en fluorescentiemicroscopie is vereist voor de opzet en scoring van de assay.
- Gestandaardiseerde bereiding van NGM-platen, het uitzaaien van bacteriële lawns en de synchronisatie van de wormen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen verschillende runs.
- Bioveiligheidsbeperking (BSL-2) is noodzakelijk bij het werken met pathogene microben zoals C. albicans.
- De gevoeligheid van de assay kan worden beperkt door het ontwikkelingsstadium van de worm en variabiliteit in de bacteriële voedselbron, waardoor strikte synchronisatieprotocollen vereist zijn.
- Hoewel toepasbaar op meerdere pathogenen, is optimalisatie van de infectiecondities (bijv. inoculum, temperatuur) nodig voor niet-fungale agentia.
