Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties
31 oktober 2017
Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om polylactisch zuur, co-glycolzuur, elektrospunnen vezels te fabriceren en het oppervlak te modificeren, met verschillende hoeveelheden van het antivirale eiwit Griffithsin. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van geneesmiddelafgifte te beantwoorden, zoals hoe nieuwe afgiftevoertuigen te formuleren en te karakteriseren die seksueel overdraagbare virale infecties, zoals HIV-1, kunnen voorkomen. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de antivirale activiteit van Griffithsin wordt gemaximaliseerd door het gebruik van polymere-elektrospunnen vezels als een stationair schakel om Griffithsin zeer gelokaliseerd op het vezeloppervlak te plaatsen.
De implicaties van deze techniek reiken tot therapie van andere virale en bacteriële infecties, vanwege het krachtige profylactische en therapeutische potentieel van Griffithsin tegen verschillende soorten infecties. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het voorkomen van HIV-1 infectie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere virale of bacteriële infecties waarbij Griffithsin potentie heeft aangetoond. Om deze procedure te beginnen, weeg 720 milligram van 50/50 PLGA in een 10 milliliter scintillatiebuisje.
Voeg met behulp van een serologische glazen pipet 3,0 milliliter HFIP toe. Bedek het buisje met plastic folie. Meet en noteer vervolgens de massa van het buisje.
Incubeer de polymeersuspensie gedurende één nacht bij 37 graden Celsius om volledige oplossing van het polymeer te garanderen. Bereid vervolgens het elektrospinapparaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een drie milliliter spuit om de polymeeroplossing te aspireren.
Verbind vervolgens een stompe 18 gauge 0,5 inch naaldtip aan de spuit. Spuit het overtollige oplossing weg om de lege ruimte in de naald te verwijderen. Plaats de spuit op een spuitpomp en stel de instrument stroomsnelheid in op 2,0 milliliter per uur.
Verbind de stroombron met de spuitnaald. Elektrospin de polymeeroplossing met een spanning van positief 27 kilovolt. Nadat de hele oplossing is geëlektrospunnen, zet de stroombron uit.
Laat de mandrel nog 30 minuten draaien om het oplosmiddel volledig te laten verdampen. Zet vervolgens de roterende mandrel collector uit. Gebruik een scheermes om de vezel voorzichtig van de mandrel te pellen.
Verzamel de geëlektrospunnen PLGA-vezel in een gelabeld petrischaaltje. Plaats het schaaltje in een exsiccator gedurende één nacht om eventueel resterend oplosmiddel te verwijderen. Om te beginnen, bereid de PBS en MES-oplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol.
Verwijder vervolgens de EDC en NHS uit de vriezer. Laat ze rusten om in evenwicht te komen met kamertemperatuur. Weeg vervolgens vier milligram EDC in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje.
Weeg zes milligram NHS in een ander microcentrifugebuisje. Voeg een milliliter MES-buffer toe aan elke buis. Vorm beide buisjes krachtig om ervoor te zorgen dat de reagentia volledig zijn opgelost.
Weeg vervolgens 70 milligram hydroxylamine in een 50 milliliter kegelvormig centrifugebuisje. Voeg 20 milliliter PBS toe en vorm. Weeg een geschikte hoeveelheid PLGA-vezel in een 15 milliliter kegelvormig centrifugebuisje.
Voeg acht milliliter MES-buffer toe aan de vezel. Voeg vervolgens een milliliter van zowel de EDC- als NHS-oplossingen toe. Sluit de 15 milliliter kegelvormige centrifugebuis met plastic folie.
Plaats de buis op een rotator om de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zachtjes te keren. Voeg vervolgens 14 microliter bèta-mercaptoethanol toe om de reactie te stoppen. Draai de buis verschillende keren om om een volledige menging te garanderen.
Gooi de supernatant weg en spoel de PLGA-vezel twee keer met 10 milliliter PBS voor elke wassing. Voeg een geschikte hoeveelheid GRFT-stockoplossing toe aan de buis, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens voldoende PBS toe om het eindvolume op acht milliliter te brengen.
Sluit en draai de buis om om een grondige menging te garanderen. Sluit de buis af met plastic folie. Plaats de buis op de rotator om de oplossing gedurende twee uur zachtjes te keren.
Stop de reactie door twee milliliter van de bereide hydroxylamine-oplossing toe te voegen en gedurende 30 seconden te vormen. Gooi de supernatant weg. Spoel de oppervlakte-gemodificeerde PLGA-vezel twee keer, met 10 milliliter ultrapuur water voor elke wassing en vorm bij elke wassing.
Breng vervolgens de gewassen vezel over naar een petrischaaltje. Plaats het schaaltje in een exsiccator totdat de vezel volledig droog is. Bewaar vervolgens het schaaltje op vier graden Celsius.
Stel om te beginnen drie 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes neer. Weeg twee milligram vezel in elk buisje. Voeg vervolgens een milliliter DMSO toe aan elk buisje.
Vorm gedurende één minuut bij kamertemperatuur om de vezel volledig op te lossen. Verdun vervolgens een 10 microliter aliquot minimaal 100 keer in TE-buffer. Bewaar bij minuus 20 graden Celsius, totdat de karakterisering met Eliza wordt geladen.
Weeg tussen de 5 en 10 milligram oppervlakte-gemodificeerde vezel af en breng het over naar een microcentrifugebuisje. Noteer de vezelmassa die in elk buisje wordt geplaatst. Voeg vervolgens een milliliter van een oplossing toe die het fysiologische milieu van elk monster nabootst.
Incubeer de monsters op een roterende shaker bij 200 RPM en 37 graden Celsius gedurende één uur. Verwijder vervolgens ongeveer een milliliter van de oplossing die het gedesorbeerde GRFT bevat en verdeel het in clusterbuisjes. Bewaar bij minuus 20 graden Celsius totdat u klaar bent om eiwitkwantificering uit te voeren.
Breng vervolgens het monster over naar een nieuw microcentrifugebuisje. Voeg een milliliter verse bufferoplossing toe en incubeer tot de volgende tijdstip, zoals beschreven in het tekst
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het fabriceren en oppervlakte-modificeren van elektrogesponnen poly(melkzuur-co-glycolzuur) vezels met Griffithsin, een antiviraal eiwit. Deze vezels vertonen een significante antivirale activiteit tegen HIV-1, wat inzicht biedt in drugdeliverysystemen voor het voorkomen van virale infecties.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Biotoxicologie
- Medicijnafgifte
- Virologie
Achtergrond
- Griffithsin staat bekend om zijn antivirale eigenschappen.
- Elektrogesponnen vezels dienen als effectieve transportmiddelen.
- Inzicht in mechanismen voor geneesmiddelentoediening is cruciaal voor het voorkomen van infecties.
- Deze techniek kan bredere toepassingen hebben tegen diverse pathogenen.
Doel van de studie
- Om Griffithsin-gemodificeerde vezels te vervaardigen voor een verbeterde antivirale activiteit.
- Om het potentieel van deze vezels bij het voorkomen van HIV-1-infectie te onderzoeken.
- Om de implicaties voor andere virale en bacteriële infecties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Wegen en voorbereiden van PLGA voor electrospinning.
- Oppervlaktemodificatie van vezels met Griffithsin.
- Karakterisering van vezelmorfologie en antivirale activiteit.
- Beoordeling van de desorptie van Griffithsin uit de vezels.
Belangrijkste resultaten
- Met succes Griffithsin-gemodificeerde elektrogesponnen vezels vervaardigd.
- Krachtige antivirale activiteit tegen HIV-1 in vitro aangetoond.
- Karakterisering bevestigde een effectieve oppervlaktemodificatie.
- Potentiële toepassingen voor andere infecties zijn geïdentificeerd.
Conclusies
- De methode verhoogt de antivirale effectiviteit van Griffithsin.
- Elektrogesponnen vezels kunnen dienen als effectieve systemen voor geneesmiddelentoediening.
- Deze aanpak kan toekomstige therapieën voor diverse infecties informeren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt oppervlaktemodificatie van elektrogesponnen vezels met Griffithsin mogelijk om de antivirale activiteit voor lokale HIV-1-preventie te maximaliseren. Door Griffithsin aan PLGA-vezels te conjugeren, verbetert deze aanpak de interactie met het doelwit en wordt de systemische blootstelling verminderd, wat bijdraagt aan de preklinische risicoreductie van topische microbicide-kandidaten. Het platform biedt een herbruikbare strategie voor proteïne-gefunctionaliseerde biomaterialen bij de profylaxe van infectieziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar het werkingsmechanisme van Griffithsin mogelijk via gecontroleerde oppervlaktepresentatie op vezelachtige steigers.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van de antivirale activiteit van lectine in een biomimetisch, instelbaar afleveringsformaat.
- Predictieve waarde: Faciliteert de beoordeling van target-engagement en bindingskinetiek die relevant zijn voor de remming van virale entry.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor het kwantificeren van de efficiëntie en stabiliteit van proteïneconjugatie via ELISA-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare beoordeling van GRFT-desorptieprofielen onder fysiologische omstandigheden mogelijk.
- Assay-gereedheid: Ondersteunt de ontwikkeling van kwantitatieve read-outs voor proteïnelading en release-kinetiek in vezelgebaseerde systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de covalente binding van Griffithsin aan vezels, wat bijdraagt aan een aanhoudende lokale antivirale activiteit.
- Operationele waarde: Maakt evaluatie mogelijk van de stabiliteit van vezels en de retentie van eiwitten in gesimuleerde fysiologische omgevingen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen eiwitengineering in de ontdekkingsfase en de preklinische evaluatie van topische profylactische toedieningsvormen.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door de synthese van proteïne-gefunctionaliseerde biomaterialen mogelijk te maken, wat de identificatie van lead-verbindingen voor topische antivira supports en preklinische beslissingen over formuleringen ondersteunt via gecontroleerde release-profilering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot lectine-gemedieerde virale inactivatie via oppervlakte-gebonden presentatie.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor het kwantificeren van proteïnconjugatie, stabiliteit en antigeen-bindingscapaciteit met behulp van gp120/HA-gebaseerde ELISA.
- Analytics: Levert kwantitatieve gegevens over GRFT-conjugatieniveaus en desorptiesnelheden om structuur-functierelaties te onderbouwen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de fabricage van vezels met de preklinische evaluatie van antivirale werkzaamheid en veiligheidsprofielen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platform dat aanpasbaar is voor andere antivirale proteïnen of biologische geneesmiddelen voor mucosale toedieningsapplicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door het mogelijk maken van een gecontroleerde, gelokaliseerde presentatie van antivirale lectinen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare vezelfabricage en oppervlaktemodificatie met kwantificeerbare eiwitbelading.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar antivirale mechanismen door een gedefinieerde presentatie van biomaterialen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van topische microbicide-kandidaten via gestandaardiseerde, eiwit-gefunctionaliseerde scaffolds.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in electrospinning, proteïneconjugatiechemie en biomateriaalcharacterisering.
- Afhankelijk van toegang tot HFIP-compatibele electrospinning-apparatuur en EDC/NHS-activatiesystemen.
- Maakt standaardisatie van protocollen voor vezelverzameling, wassen en drogen over verschillende batches heen noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende proteïnegroottes, ladingen en immobilisatie-efficiënties.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot de omgang met oplosmiddelen (HFIP) en reagensstabiliteit tijdens de conjugatiestappen.
Veelgestelde vragen over biofarma
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Preparation and Fabrication of the Electrospun Fiber Scaffold
3:22
Surface-modification of Fibers with GRFT
6:35
Extraction of GRFT from Surface-modified Fibers and Measuring GRFT Desorption from Fibers
8:28
Results: Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds
10:56
Conclusion
