Name: Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer de fabricage en oppervlaktemodificatie van PLGA-elektrogesponnen vezels met het antivirale eiwit Griffithsin. Deze methode maximaliseert antivirale activiteit tegen HIV-1 voor geoptimaliseerde geneesmiddelenafgifte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar aan het joodse erfgoed Fonds voor uitmuntendheid voor financiering van dit onderzoek. Wij danken Dr. Stuart Williams II royaal voorzien van gebruik van het electrospinning-systeem. Wij danken ook Dr. Kenneth Palmer voor ons te voorzien van Griffithsin. Daarnaast danken we Dr. Nobuyuki Matoba en zijn lab voor opleiding die ons in de GRFT ELISA werken.

1. voorbereiding en fabricage van de steiger van de vezel Electrospun Let op: alle werkzaamheden met oplosmiddelen of Polymeeroplossingen moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast . Verwijzen naar materiële veiligheid gegevensblad van elk reagens voordat het protocol.
<ol><li>Naar electrospin een polymeeroplossing 3 mL 15% w/w PLGA, weeg 720 mg 50:50 poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA; 0,55 tot 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in een flesje van 10 mL scintillatie. Het volume van de oplossing is gebaseerd op de typische batch grootte gebruikt in huidige studies. 
	Opmerking: De massa van het polymeer toe te voegen aan een bepaalde hoeveelheid oplosmiddel moet worden berekend door de eerste bepaling van de dichtheid van het oplosmiddel gebruikt te ontbinden van het polymeer. De dichtheid van het oplosmiddel Hexafluoro-2-propanol (HFIP) is 1,59 g/mL. Dus, het gewicht van het oplosmiddel, gebaseerd op een volume van 3,0 mL HFIP nodig, bedraagt 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Voor een 15% w/w-Fractie van PLGA naar HFIP, 720 mg PLGA moet worden toegevoegd aan 3,0 mL HFIP (0,15 x 4800 mg = 720 mg). Het voordeel van het gebruik van een % w/w/polymeeroplossing, in plaats van % w/v, is dat hierdoor een bepaald gewicht van de uiteindelijke oplossing. Deze gedefinieerde gewicht kunt nauwkeuriger oplosmiddel vervanging, in het geval van verdampend oplosmiddel tijdens stap 1.3.</li>
	<li>Aan de glazen Scintillatie ampul met PLGA (uit stap 1.1) 3.0 mL HFIP toevoegen met behulp van een precisiepipet serologische glas. Dekking van de flacon met plastic folie, dan meten en registreren van de flacon mass.</li>
	<li>Broeden de opschorting van de polymeer 's nachts bij 37 ° C om ervoor te zorgen volledige ontbinding van het polymeer. Als elk oplosmiddel verdampt, verminderen de flacon massa, HFIP toevoegen totdat de flacon bereikt haar oorspronkelijke massa in stap 1.2.</li>
	<li>Na een incubatieperiode van, het bereiden van het electrospinning apparaat ( Figuur 2). Hoewel een as van elke omvang kan worden gebruikt, hier een roterende 25 mm buitendiameter RVS as werd gebruikt als de collector. 
	Opmerking: Een groter as diameter zal dalen de dikte van de vezel, gezien de dezelfde hoeveelheid electrospinning oplossing.</li>
	<li>De polymeeroplossing gecombineerd in een spuit met 3 mL.</li>
	<li>Een stomp 18-gauge, ½ inch naald tip verbinden met de spuit en afzien van de overtollige oplossing (meestal 0,25 mL) te verwijderen lege headspace de naald tip.</li>
	<li>Plaats van de spuit op een spuitpomp en het debiet instrument ingesteld op 2,0 mL/h. 
	Opmerking: Dit debiet was eerder geoptimaliseerd op basis van polymeer viscositeit voor deze formulering.</li>
	<li>Verbinden met de krachtbron de naald van de spuit en electrospin de polymeeroplossing met behulp van een spanning van + 27 kV. De afstand tussen de naald en de verzamelaar moet worden ingesteld op ongeveer 25 cm ( Figuur 2 B). 
	Let op: Het electrospinning-proces zorgt voor een oplosmiddel damp. Gebruik een zuurkast of een afgesloten apparaat ( Figuur 2) te verwijderen van de schadelijke damp .</li>
	<li>Zodra de hele oplossing electrospun is, uitschakelen van de krachtbron en laten van de as te draaien voor een extra 30 min te volledig verdampen oplosmiddel.</li>
	<li>Beurt uit de roterende as verzamelaar, en gebruik een scheermesje te snijden van de vezel van de as. Schil voorzichtig de vezel van de as van het mes kunt.</li>
	<li>De electrospun PLGA vezel in een gelabelde petrischaal verzamelen en plaatsen in een desiccatorovernight te verwijderen van de resterende oplosmiddel.</li>
</ol> 2. Oppervlakte-wijziging van vezels met GRFT <ol><li>voorbereiden oplossingen van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES buffer). PBS voor te bereiden door het oplossen van 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g nb 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 L ultrazuiver water. Op dezelfde manier los 19.52 g MES (vrij zuur, MW 195,2) en 29.22 g NaCl in 1 L ultrazuiver water, te bereiden MES buffer. Zorgen voor de definitieve pH van elke oplossing is tussen 7.2-7.5 en 5.0-6.0, respectievelijk met behulp van een pH-meter.</li>
	<li>Bereiden individuele werkende oplossingen van EDC (2 mM) en NHS (5 mM).
	<ol><li>De EDG en de NHS verwijderen uit de vriezer en laten equilibreer tot kamertemperatuur voordat weging.</li>
		<li>Weeg 4 mg EDC in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL.</li>
		<li>Weeg NHS in een ander microcentrifuge buis 6 mg.</li>
		<li>Add 1 mL MES buffer aan elke buis. Vortex beide buizen krachtig om ervoor te zorgen de reagentia worden volledig opgelost.</li>
	</ol></li> <li>Bereid een oplossing van hydroxylamine door weging van 70 mg in een conische centrifugebuis van 50 mL.</li>
	<li>Voeg toe 20 mL PBS aan de hydroxylamine en vortex te ontbinden.</li>
	<li>Massa uit een passend bedrag van PLGA vezel in een tube van 15 mL conische centrifuge. 75 mg van vezel wordt meestal gebruikt voor elke reactie partij.</li>
	<li>8 mL MES buffer toevoegen aan de tube van 15 mL.</li>
	<li>Add 1 mL, elk van de oplossingen van het EDG en NHS eerder bereid om de buis. Het uiteindelijke volume van de oplossing moet 10 mL. De eindconcentraties van EDC en NHS moet 0.4 mg/mL en 0,6 mg/mL, respectievelijk.</li>
	<li>Dicht en verzegel de tube van 15 mL met plastic folie en plaats op een rotator zodat de oplossing moet voorzichtig worden omgekeerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur ( Figuur 3 B). Deze stap activeert de carboxylgroepen op het polymeer te voorzien van covalente modificatie met het eiwit GRFT ( Figuur 3 A).</li>
	<li>Na activering, zorgvuldig doven de reactie door 14 µL van β-mercaptoethanol toe te voegen aan de buis. Omkeren van de buis meerdere malen om ervoor te zorgen volledige mengen. 
	Let op: β-mercaptoethanol is zeer giftig en mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en spoel de vezel PLGA tweemaal, met 10 mL PBS, verwijderen van alle resterende β-mercaptoethanol.</li>
	<li>Toevoegen na het spoelen, een passend bedrag van de stockoplossing van GRFT aan de buis. Bijvoorbeeld, zou een 5 nmol GRFT/mg vezel 6.35 µL van GRFT stockoplossing (uit een voorraad van de 10 mg/mL) per mg vezel vereisen. Dus een steekproef van de vezel 75 mg zou vereisen 476.25 µL van 10 mg/mL stockoplossing van GRFT. 
	Opmerking: GRFT vezels met theoretische belastingen van 0.05, 0.5 en 5 nmol GRFT per mg vezel werden gefabriceerd.</li>
	<li>Toevoegen van genoeg PBS om het eindvolume tot 8 mL, sluit en omkeren van de buis om ervoor te zorgen dat grondig mengen.</li>
	<li>Zegel van de buis met plastic folie en leg op een rotor opnieuw, dit keer voor 2 h.</li>
	<li>Na de 2 h incubatie, doven de reactie door toevoeging van 2 mL van hydroxylamine oplossing in de centrifugebuis 15 mL. Per de instructies van de fabrikant, dient de eindconcentratie van hydroxylamine tijdens het blussen reactie 0,7 mg/mL.</li>
	<li>Meng de oplossing goed en verwijder het supernatant. Spoel het oppervlak gemodificeerde PLGA vezel tweemaal met 10 mL ultrazuiver water te verwijderen van een unconjugated GRFT.</li>
	<li>Overbrengen in de vezel een petrischaal en de plaats in een exsiccator tot de vezel volledig droog is. De petrischaal overbrengen in 4 ° C voor opslag.</li>
</ol> 3. SEM karakterisatie van de oppervlakte van de GRFT gemodificeerde vezels <ol><li>plaats een strook van koolstof dubbelzijdige tape op een SEM specimen mount. De onderkant van de berg specimen van een label met de monster identificerende informatie met behulp van een permanent marker.</li>
	<li>Drie monsters uit één oppervlak gemodificeerde vezel te snijden en leg ze op aparte specimen mounts. De dikte van elk monster is ongeveer 0,5 mm.</li>
	<li>Sputter jas de monsters met behulp van elektron-geïnduceerde deeltjes depositie van een plaat van goud. Sputter jas voor 90 s, van 2,4 kV. 
	Opmerking: De sputter vacht tijd kan variëren afhankelijk van de parameters van de apparatuur, met inbegrip van de spanning en stroomsterkte.</li>
	<li>Beeld van de monsters bij 8 kV met een vergroting variërend van 1.000 tot en met 5, 000 X.</li>
</ol> 4. Winning van GRFT van oppervlak gemodificeerde vezels <ol><li>massa uit vezels in drievoud in 1,5 mL microcentrifuge buizen 2 mg.</li>
	<li>1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toevoegen aan de buis, vervolgens vortex en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te volledig het ontbinden van de vezel.</li>
	<li>Na incubatie, Verdun een hoeveelheid van 10 µL de oplossing van DMSO-vezel uit stap 4.2, ten minste 100-fold in Tris-EDTA (TE) buffer (pH = 8.0).</li>
	<li>Bewaren monsters bij-20 ° C tot laden karakterisering met ELISA.</li>
</ol> 5. Meten van GRFT desorptie van vezels <ol><li>te beoordelen van de hoeveelheid GRFT vrijgegeven of uit de vezel, gedesorbeerde Weeg 5-10 mg oppervlak gemodificeerde vezel en breng dit in een microcentrifuge buis. Opnemen van de massa van de vezels in elke buis.</li>
	<li>Voeg 1 mL van een geschikte oplossing die de fysiologische omgeving bootst (b.v., PBS, TE buffer, gesimuleerde vaginaal vocht (SVF), enz.) aan elk monster.</li>
	<li>Broeden de monsters gedurende 1 uur op een roterende shaker op 200 rpm, 37 ° C.</li>
	<li>Na incubatie, TE buffer met de gedesorbeerde GRFT uit de flacon en aliquot aan cluster verwijderen ongeveer 1 mL tubes. Opslag bij-20 ° C tot eiwit kwantificering.</li>
	<li>Overbrengen van het monster naar een nieuwe microcentrifuge-buis, voeg 1 mL verse bufferoplossing naar de fiber binnen de microcentrifuge buis en incubeer tot de volgende tijdstip.</li>
	<li>Typische tijd punten gebruikt voor het meten van release zijn onder meer: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h en 1 wk. te verwaarlozen desorptie in deze studies werd waargenomen na 4 h.</li>
</ol> 6. Kwantificering van GRFT extractie en desorptie via ELISA <ol><li>jas een 96-Wells-ELISA plaat met 0,1 mL HA (10 µg/mL) per putje zoals eerder beschreven 51. Afdichting van de plaat met plastic folie en na een nacht bebroeden bij 4 ° C ( Figuur 4).</li>
	<li>De buffer coating verwijderen en toevoegen van 0.3 mL blokkeerbuffer (2-3% bovien serumalbumine (BSA) in PBS met 0,05% Polysorbaat 20) aan elk putje. De plaat gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Na incubatie, spoel de plaat 3 keer met 1 x PBS met 0,1% Polysorbaat 20 (PBS-P). Na het spoelen, afzien 0,1 mL van het monster, standard of PBS als negatieve controle in de respectieve putten. De plaat opnieuw gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Spoel de plaat weer 3 keer met PBS-P. Na het spoelen, Voeg 0,1 mL primair antilichaam (geit anti-GRFT antiserum) in elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Typisch, de oplossing van primair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.</li>
	<li>Nadat het broeden de monsters met primair antilichaam spoelen de platen weer 3 keer met PBS-P. Voeg 0,1 mL secundair antilichaam (horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd konijn anti-geit IgG) aan elk goed en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De oplossing van secundair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.</li>
	<li>Wassen de plaat 3 keer. Voeg 0,1 mL TMB 2-peroxidase substraat toe aan elk putje. Monitor kleur ontwikkeling (ongeveer 2 min), dan toevoegen van 0,1 mL H 2 dus 4 (1 N) om quench de reactie. Lees plaat bij 450 nm op een afleesapparaat.</li>
	<li>Gemiddelde OD-waarden van de achtergrond (wells waaraan alleen PBS), en dit aftrekken van de experimentele groepen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als gevolg van hun poreuze structuur en een groot oppervlak, hebben EFs gevonden een scala aan toepassingen in de gezondheidszorg, waarvan er één portie als therapeutische leverende voertuigen omvat. Drugs en andere actieve stoffen kunnen worden opgenomen binnen EFs voor afstembare levering, terwijl biologics en chemische liganden kunnen worden geconjugeerd met het oppervlak van de vezel voor cel-specifieke targeting52 of biosensing53. Hier gemodificeerde de fabricage van G...

Het gebruik van EFs als een actuele levering-platform heeft de potentie om beduidend te verminderen SOA's. Momenteel zijn er meer dan 36 miljoen mensen met HIV, met meer dan twee miljoen nieuwe gevallen van gemelde in 2015 alleen1,2. Bovendien, herpes simplexvirus type 2 (HSV-2) infectie beïnvloedt honderden miljoenen mensen wereldwijd en is aangetoond dat het verbeteren van de verwerving van HIV door 2-5 voudige3. Vanwege deze relatie tussen HSV-2 infecties en HIV verwerving is er significant belang bij de ontwikkeling van nieuwe werkzame stoffen die gelijktijdige bescherming tegen meerdere SOA's bieden. Bovendien, de ontwikkeling van nieuwe voertuigen ter verbetering van de levering van deze antivirale middelen biedt de mogelijkheid om beschermende en therapeutische potentie verder te verbeteren. Richting van dit doel, zijn EFs onderzocht als een nieuwe levering platform ter vermindering van de prevalentie van HIV-1 en HSV-2 infecties.
Tijdens de afgelopen twee decennia, hebben de EFs uitgebreid op het gebied van drug delivery en weefsel engineering4is gebruikt. Vaak, worden biocompatibel polymeren geselecteerd om gemakkelijk vertalen naar therapeutische toepassingen. Om te fabriceren polymere EFs, wordt het geselecteerde polymeer opgelost in een organisch oplosmiddel of waterige oplossing, afhankelijk van de mate van polymeer hydrophobicity5. Actieve stoffen van belang worden vervolgens toegevoegd aan de oplosmiddelen of waterige oplossing vóór het electrospinning proces. De polymeeroplossing is vervolgens aanzuiging in een spuit en langzaam uitgeworpen terwijl hij onder een elektrische stroom. Dit proces resulteert meestal in polymeer vezels met blad of cilindrische macrostructures (Figuur 1) en vezel diameters variërend van de micro - naar nano-schaal6. Voor de meest therapeutische toepassingen, werkzame stoffen zijn opgenomen in de vezels tijdens het electrospinning en worden vrijgelaten uit de vezel via diffusie en aantasting van de latere vezel. Het tempo van de degradatie of release kan worden gewijzigd met behulp van verschillende soorten polymeren of polymeer combineert om een profiel van de gewenste versie, unieke chemische en fysische eigenschappen7meegeven, en het bevorderen van de inkapseling van vrijwel elk samengestelde. Als zodanig, hebben EFs bewezen gunstig zijn voor de levering van kleine molecuul drugs en biologische agentia zoals eiwitten, peptiden, oligonucleotides en groeifactoren6,8,9.
Op het gebied van STI-preventie, zijn EFs onlangs gebruikt om te nemen en te zorgen voor aanhoudende - of afleidbare-release van antivirale middelen10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In één van de vroegste studies, werden pH-responsieve vezels ontwikkeld om actieve agenten in reactie op veranderingen in het milieu binnen het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT), vrij te geven als een methode op afroep van bescherming tegen HIV-111. Sinds, hebben andere studies onderzocht polymere blends samengesteld uit polyethyleen oxide (PEO) en poly-L-lactic acid (PLLA), om te evalueren van het afstembare vrijkomen van antivirale en contraceptieve agentia voor HIV-1 preventie en contraceptie in vitro 12. aanvullende studies hebben aangetoond dat de haalbaarheid van EFs te bieden het volgende: verlengd release van klein molecuul antivirale middelen14, sterke en flexibele mechanische eigenschappen20, 3D-levering platforms21 , remming van sperma penetratie12, en de mogelijkheid om te fuseren met andere levering technologieën13. Ten slotte heeft de vorige werk polymere vezels voor de aanhoudende-levering van antivirale middelen tegen gemeenschappelijk co-infective virussen, HSV-2 en HIV-114geëvalueerd. In deze studie geleverd polymeer vezels complementaire activiteit tot antivirale levering door behoud van hun structuur voor maximaal 1 maand en het verstrekken van een fysieke barrière aan virale post. Uit deze resultaten werd naar voren gebracht dat EFs kunnen worden gebruikt voor zowel fysisch en chemisch belemmeren virusinfectie.
Terwijl afstembare release eigenschappen polymere EFs een aantrekkelijke levering platform voor microbiciden levering maken, zijn EFs in andere toepassingen om te dienen als oppervlak gemodificeerde steigers7ontwikkeld. EFs gebruikt om na te bootsen de morfologie van de extracellulaire matrix (ECM), vaak op de hoedanigheid van steigers verbeteren van cellulaire regeneratie22, en verhogen hun nut in weefsel engineering23,24. Vezels bestaat uit polymeren zoals poly-ε-caprolacton (PCL) en PLLA zijn oppervlak-bewerkt met groeifactoren en eiwitten na electrospinning naar ECM-achtige eigenschappen met inbegrip van verhoogde cellulaire hechting en proliferatie25 , 26. Daarnaast antimicrobiële oppervlak gemodificeerde EFs zijn geëvalueerd om te voorkomen dat de groei van specifieke pathogene bacteriën27,28. Door deze veelzijdigheid en de mogelijkheid voor het opwekken van biologische effecten, blijft EF technologie uitbreiden in allerlei velden multi mechanistische functionaliteit te bieden. Nog, ondanks hun nut in een verscheidenheid van toepassingen, oppervlak gemodificeerde vezels hebben pas onlangs onderzocht in het microbicide veld29.
Parallel met de ontwikkeling van nieuwe technologieën van de levering te voorkomen en behandelen van SOA's, nieuwe biologische therapeutics zijn ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende microbicide kandidaten is de zelfklevende antivirale lectine, GRFT30. Oorspronkelijk afkomstig uit een soort van rode algen, GRFT heeft bewezen activiteit als een krachtige remmer van HIV, HSV-2, SARS, evenals het Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. In feite onder biologisch gebaseerde remmers, GRFT heeft de meest krachtige anti-HIV-activiteit, inactiveren HIV-1 bijna onmiddellijk bij contact30, terwijl het handhaven van de stabiliteit en activiteit in aanwezigheid van de voedingsbodems van vaginale microben voor maximaal 10 dagen37. Meer recentelijk, een 0,1% GRFT gel bleek te beschermen tegen intravaginal uitdaging van de HSV-2, waardoor het een veelbelovende kandidaat voor de eerste regel van de bescherming tegen HSV-2 zowel HIV-132 muizen, 38. voor HIV specifiek, GRFT remt infectie door fysiek gp120 of terminal mannose glycan N-gebonden residuen te binden op virale envelop oppervlakken om te voorkomen dat post38,39,40,41 ,42. Deze remming is zeer krachtig, met IC50s 3 ng/mL43naderen. Naast remming van HIV-infectie, hebben studies ook aangetoond dat GRFT tegen HSV-2 infectie beschermt door remming van de cel-naar-cel verspreiding van het virus-32. In alle gevallen, heeft GRFT aangetoond dat het lijm virale deeltjes, worden terwijl de hoge weerstand tegen denaturatie demonstreren. Laatste GRFT heeft aangetoond dat synergetische activiteit met combinaties van Tenofovir (TFV) en andere antivirale middelen44, waardoor het haalbaar en waarschijnlijk gunstig zijn voor mede beheren met EFs. De krachtige eigenschappen van GRFT maken een uitstekende biologisch gebaseerde antivirale kandidaat, waarin de levering kan worden verbeterd met EF-technologie.
Gebruik makend van deze kennis van de zelfklevende en aangeboren antivirale eigenschappen van GRFT, is een polymere vezel-steiger ontworpen, die deze eigenschappen integreert zodat de eerste laag van virus vermelding remming29. Het vinden van inspiratie in de weg dat cervicovaginal slijm virus vervoer voornamelijk door middel van mucoadhesive mucin interacties belemmert, hypothetische wij die met behulp van EFs als een steiger en covalent wijzigen het oppervlak met een hoge dichtheid van GRFT, oppervlakte-geconjugeerde GRFT zou knelpunten en inactivering van virus op haar toegangspunt45,46,47. Hier werden EFs ontwikkeld als een stationaire steiger een op basis van eiwitten, virale lijm-inactiveren barrière platform te bieden. Wij willen combineren de krachtige antivirale eigenschappen van GRFT met een biocompatibele, aanpasbaar en duurzaam polymeer-platform, maak je een roman virus "val".
Om deze doelen te bereiken, werden vezels bestaat uit PLGA electrospun, en EDC-NHS Scheikunde werd gebruikt om vervolgens het wijzigen van het oppervlak van de EF met GRFT. PLGA diende als een model polymeer vanwege haar uitgebreide gebruik in electrospinning48, gecombineerd met de biocompatibiliteit en kosteneffectiviteit. Bovendien, oppervlakte modificatie exploiteert de grote oppervlakte van EFs en biedt een nuttig alternatief dat kan worden gecombineerd met inkapseling te maximaliseren vezel hulpprogramma49. In tegenstelling tot traditionele inkapseling methoden waar slechts een gedeelte van de GRFT is beschikbaar (en slechts Transient presenteren in de FRT), kunnen de oppervlakte wijziging GRFT om maximale topicale tijdens de gehele duur van de behandeling. Bovendien, de opneming van hydrofiele stoffen zoals eiwitten, door traditionele electrospinning methoden, kan resulteren in lagere inkapseling efficiëntie en verlies van eiwit activiteit50. Daarom kunnen GRFT oppervlak gemodificeerde vezels bieden een veelbelovende alternatieve leveringsmethode die alleen of in combinatie met electrospinning kan worden gebruikt ter verbetering van de bescherming tegen SOA-infectie.

<table><tbody><tr><td>Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>147541000</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td><td>Brico Medical Supplies</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td><td>VWR</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm (plastic film)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>Griffithsin (GRFT)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>op maat gemaakt, geen productnummer</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>Influenza Hemagglutinin (HA)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>op maat gemaakt, geen productnummer</td></tr><tr><td>Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>op maat gemaakt, geen productnummer</td></tr><tr><td>Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage en karakterisering van de vezel griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun vezels (EFs) hebben op grote schaal gebruikt in een verscheidenheid van therapeutische toepassingen; echter hebben ze pas onlangs zijn toegepast als een technologie ter voorkoming en behandeling van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA's). Bovendien, vele EF technologieën gericht op encapsulating het actieve agens, ten opzichte van het gebruik van het oppervlak te geven biofunctionality. Hier beschrijven we een methode om te fabriceren en oppervlakte-poly(lactic-co-glycolic) zuur (PLGA) electrospun vezels, met de krachtige antivirale lectine Griffithsin (GRFT) te wijzigen. PLGA is een FDA-goedgekeurde polymeer dat wijd verbeid in drug delivery vanwege haar uitstekende chemische en biocompatibel eigenschappen gebruikt is. GRFT is een natuurlijke, krachtige, veilige lectine die bezit brede activiteiten tegen talrijke virussen met inbegrip van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1). Wanneer gecombineerd, hebben GRFT gemodificeerde vezels potente inactivatie van HIV-1 in vitroaangetoond. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te fabriceren en karakteriseren van GRFT gemodificeerde EFs. Ten eerste, is de PLGA electrospun maken van een fiber-steiger. Vezels zijn vervolgens oppervlak-bewerkt met GRFT met 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie. Scanning elektronen microscopie (SEM) werd gebruikt voor het beoordelen van de grootte en morfologie van oppervlak gemodificeerde formuleringen. Bovendien, een gp120 of hemagglutinine (HA)-gebaseerde ELISA kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de hoeveelheid geconjugeerd met GRFT, evenals GRFT desorptie van het oppervlak van de vezel. Dit protocol kan ruimer worden toegepast om het fabriceren van vezels die oppervlakte-bewerkt met een verscheidenheid van verschillende eiwitten zijn.

Morfologie van de vezel heeft een significant effect op het vermogen van EFs oppervlak gemodificeerde bescherming te bieden tegen virussen. Hoewel electrospinning een handige en eenvoudige procedure is, niet-geoptimaliseerde polymeer formuleringen kunnen leiden tot onregelmatige vezel morfologie (Figuur 5B-C). Wijzigingen in electrospinning omstandigheden die leiden de vorming van kralen of amorfe mat-achtige morphologies tot, worden vaak ver...

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Het algemene doel van deze procedure is om polylactisch zuur, co-glycolzuur, elektrospunnen vezels te fabriceren en het oppervlak te modificeren, met verschillende hoeveelheden van het antivirale eiwit Griffithsin. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van geneesmiddelafgifte te beantwoorden, zoals hoe nieuwe afgiftevoertuigen te formuleren en te karakteriseren die seksueel overdraagbare virale infecties, zoals HIV-1, kunnen voorkomen. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de antivirale activiteit van Griffithsin wordt gemaximaliseerd door het gebruik van polymere-elektrospunnen vezels als een stationair schakel om Griffithsin zeer gelokaliseerd op het vezeloppervlak te plaatsen.De implicaties van deze techniek reiken tot therapie van andere virale en bacteriële infecties, vanwege het krachtige profylactische en therapeutische potentieel van Griffithsin tegen verschillende soorten infecties. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het voorkomen van HIV-1 infectie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere virale of bacteriële infecties waarbij Griffithsin potentie heeft aangetoond. Om deze procedure te beginnen, weeg 720 millig

fabrication-characterization-griffithsin-modified-fiber-scaffolds-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Scaffolds voor weefselengineering moeten het complexe biochemische en biofysische micro-omgeving van de cellulaire niche nabootsen. Hier laten we het gebruik van interfaciale polyelektrolytcomplexatievezels zien als een platform om samengestelde, meercomponenten polymeer scaffolds met aanhoudende biochemische afgifte te creëren.

Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen

Een protocol voor de microfluidic spinnen en karakterisering van de microstructuur van geregenereerde zijde fibroin monofilament wordt gepresenteerd.

Microfluidic droog-spinnen en karakterisering van geregenereerde zijde Fibroin vezels

Hierin is een protocol voor het maken van droge macroporeuze alginaatsteigers die efficiënte virale genoverdracht bemiddelen voor gebruik bij genetische manipulatie van T-cellen, inclusief T-cellen voor CAR-T-celtherapie. De scaffolds bleken geactiveerde primaire T-cellen te transduceren met &gt;85% transductie.

Fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van T-cellen

Weefselkweekinserts met plastic membranen zijn de gouden standaard in celkweeklaboratoria als permeabele dragers om cellagen en modellen van barrièreweefsels te vestigen. Hierin presenteren we een eenvoudige methode om het plastic membraan te vervangen door een biologisch relevanter membraan gemaakt van een recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit.

Nanofibrillaire basale membraan nabootsen gemaakt van recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde in op maat gemaakte weefselkweekinzetstukken

Leer de fabricage en oppervlaktemodificatie van PLGA-elektrogesponnen vezels met het antivirale eiwit Griffithsin. Deze methode maximaliseert antivirale activiteit tegen HIV-1 voor geoptimaliseerde geneesmiddelenafgifte.

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties (Video) | JoVE Journal

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Meer video's verkennen