Name: Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Leer focale macropatch-opnames van synaptische stromen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat. Deze methode maakt monitoring van synaptische activiteit bij individuele boutons mogelijk voor onderzoek naar genetische mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door de NIH-subsidie R01 MH 099557

1. fabricage van opname elektroden <ol><li>trekken de elektroden glas <ol><li>gebruik het volgende protocol voor de micro-elektrode trekker (Zie Tabel van materialen): <ol><li>lijn 1: warmte 510 Trek - snelheid 30 keer 250; Lijn 2: Warmte 490 Pull - snelheid 30 keer 250. 
			Opmerking: Tijdseenheden overeen met 0.5 ms per eenheid; de andere eenheden zijn relatief. De waarde van de warmte moet worden aangepast voor elke gloeidraad nadat de helling proef wordt verricht.</li>
		</ol></li> <li>Een microscoop (35 x vergroting) gebruiken om ervoor te zorgen dat de binnendiameter van de getrokken elektrode in het bereik van 7-10 µm ( figuur 1A). Opslaan van de haarvaten in gesloten containers om te voorkomen dat stof accumulatie.</li>
	</ol></li> <li>Fire polijsten <ol><li>brand Pools haarvaten (80-90% van de waarde van de maximale warmte voor 1-2 s) met behulp van een micro-forge (Zie Tabel van materialen). De definitieve binnendiameter van de gepolijste elektrode er 5 µm ( figuur 1A) 27.</li>
	</ol></li> <li>Buigmachines Opmerking: twee bochten zijn gemaakt om de positie van de elektrode op de bovenkant van de spier onder de doelstelling van een hoge vergroting.
	<ol><li>Gebruik het apparaat weergegeven in figuur 1B. Vaststellen van de elektrode in de manipulator en plaatst u de tip op de gloeidraad, niet aanraken van IT</li>
		<li>Set waarde tot 60-70% van de maximale warmte en druk op de pedaal voor de micro-forge voor 1-2 s (Zie Tabel of Materials) voor het verwarmen van de gloeidraad. Gebruik een L-vormige naald voorzichtig om neer te trekken het puntje van de elektrode ( figuur 1B vergroot). Maak de bocht bij ongeveer 90 o ( Figuur 1 c).</li>
		<li>Houden de elektrode in de vlam van de fakkel door hand met pincet en maken de tweede bocht op een afstand van 7-10 mm vanaf de eerste bocht en onder een hoek van ongeveer 120 o ( Figuur 1 c).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg" /> Figuur 1. Eindstadia van micropipet fabricage. (A) elektrode tips na trekken en fire polijsten. (B.1) de setup voor het buigen van de tip. (B.2) de boxed gebied wordt uitgebreide weergegeven aan de rechterkant. De elektrode en de gloeidraad zijn bevestigd, zodat de elektrode tip gepositioneerd iets boven de draad en niet aanraken is. (C.1) de opname-elektrode. (C.2) de boxed gebied wordt uitgebreide weergegeven aan de rechterkant. De eerste bocht heeft een hoek van ongeveer 90°, en de afstand tussen de eerste bocht en de tip van de elektrode is ongeveer 1 mm. schaal bar = 3 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
 2. aanvullende voorbereidende stappen <ol><li>voorbereiden heamolymph-achtige (HL3) oplossing (in mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO, 3, 5 trehalose, 115 sacharose, 5 HEPES en 1 mM CaCl 2; Breng de pH op 7.3 - 7.4. Bewaar de oplossing in de koelkast en maak het verse wekelijks.</li>
	<li>Maken stimulatie pipets de zelfde manier als opname glas pipets, maar er is geen behoefte om te buigen ze. 
	Opmerking: De voorbereiding van stimulatie elektroden is in detail beschreven in 28 en 27. De definitieve diameter na brand polijsten in het bereik van 5-7 µm moet.</li>
	<li>Invoegen een stimulatie pipet in een micro-elektrode-houder met een injectiespuit verbonden.</li>
	<li>Vervaardiging dissectie platen van kleine petrischaaltjes (35 x 10 mm) gecoat met siliconen rubber epoxy (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in 28. 
	Opmerking: Silicone rubber moet vóór gebruik volledig geharde.</li>
	<li>Plukken van een dolende derde-instar-larven en het ontleden, zoals beschreven in 27 , 28 , 29 , 30. 
	Opmerking: Om te visualiseren los, gebruik de vliegen stam CD8-GFP (Zie Tabel van materialen) <ol><li>met pincet (Zie Tabel of Materials), kies de 3 rd instar-larven uit een flesje.</li>
		<li>Pin van de larven, plaatsen van de eerste pin posterior en andere pin anterior (dicht bij de mond haken).</li>
		<li>Oplossing toevoegen HL3.</li>
		<li>Maken van een verlaging met behulp van voorjaar schaar (Zie Tabel van materialen) helemaal vanaf de bovenste pin aan de onderkant een aan de dorsale zijde van de larven.</li>
		<li>Pin de larven filet, plaatsen van 2 extra pinnen aan de linker- en rechterkant van de larven.</li>
		<li>Verwijderen van de ingewanden en de tracheas met behulp van de verlostang.</li>
		<li>Knippen van de zenuwen net buiten het ventrale zenuw snoer met behulp van voorjaar schaar.</li>
	</ol></li></ol> 3. Elektrische opnames van EJCs <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg" /> Figuur 2. De opname setup. Het monster NMJ vastgemaakt aan het silicium gecoate petrischaal (pijl) op de roerende fase van de rechtop samengestelde microscoop uitgerust met mogelijkheden voor epifluorescence, de doelstelling van een hoge vergrotingsfactor en twee micromanipulators wordt geplaatst. De Microscoop is gestationeerd op de tafel van een anti-trillingen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol><li>Opname <ol><li>plaats de petrischaal met de voorbereiding op het stadium van de Microscoop ( Figuur 2). Invoegen van de referentie-elektrode in het bad.</li>
		<li>Vullen de opname-elektrode met HL3 oplossing. Kader van de doelstelling van 10 x (Zie Tabel of Materials), de elektrode onderdompelen in het bad en plaats deze over de spieren 6 en 7 van de abdominale segmenten, 2, 3 of 4 met behulp van de micromanipulator () (Zie Tabel van materialen) Figuur 3 A.1 en A.2).</li>
		<li>Schakelen de doelstelling tot 60 x (Zie Tabel van materialen). Focus op het gebied van belang met epi-fluorescentie of DIC optica. Plaats het uiteinde van de elektrode bovenop synaptic bouton ( Figuur 3 B.1-3).</li>
		<li>Druk op de elektrode zeer voorzichtig naar de spier. Overmatige druk kan beschadigen de NMJ of een verhoging induceren in spontane synaptic activiteit. Zorg ervoor dat het uiteinde van de elektrode niet verstopte - als het is, vervang it.</li>
		<li>Schakelen op de computer, de versterker en A/D bestuur.</li>
		<li>De spanning klem kiezen op de versterker.</li>
		<li>Start acquisitie software en kies de &#39; kloof-vrije &#39; modus.</li>
		<li>Observeren van het uiterlijk van mEJCs op het computerscherm.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de amplitude van de mEJCs in het bereik van 0,2 is - 0,7 nA. 
		Opmerking: De kleinere EJCs geven aan dat de opname-elektrode gebreken heeft of dat het niet goed is gepositioneerd.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg" /> Figuur 3. Visualisatie van synaptische boutons. (A) A helderveld afbeelding van een hemi-segment jonger dan 10 x vergroting (A.1) en het uitgebreide boxed gebied tonen spieren 6 en 7 (A.2, de pijl markeert de elektrode van de opname). Schaal bar = 50 µm. (B) Synaptic los worden gevisualiseerd in een Drosophila lijn met een genetisch gecodeerde neuronale marker (CD8-GFP) met behulp van epi-fluorescentie imaging (B.1) of DIC optica (B.2). Images zijn geschoten met de 60 x doelstelling en de filter kubus voor GFP beeldvorming (Zie Tabel van materialen). Synaptic los zijn gemarkeerd met pijlen, en een deken van TL en DIC afbeeldingen wordt weergegeven in B.3. Schaal bar = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol start="2"> <li>stimulatie <ol><li>met behulp van een micromanipulator, onder een visuele controle, plaatst u de stimulatie-elektrode in de buurt van de axon abdominale segmenten 2-4 innervating.</li>
		<li>De negatieve druk toepassen door te trekken van de zuiger van de spuit aangesloten op de elektrode-houder, zodat het axon wordt getrokken binnenkant van de elektrode ( Figuur 2).</li>
		<li>Zet de stimulator. Draai de knop op de isolatieinrichting (Zie Tabel van materialen) een nul huidige instellen en dan zachtjes toenemen, totdat EJCs verschijnen (of totdat de drempel is bereikt).</li>
		<li>Uitvoeren de stimulatie in een regime van suprathreshold, met de huidige stimulatie steeg ongeveer tweemaal, in vergelijking met de drempel voor de observatie van EJCs. 
		Opmerking: In onze ervaring is de intensiteit van dergelijke stimulatie optimaal actiepotentiaal mislukkingen en actiepotentiaal bakken te voorkomen. Bijvoorbeeld, als EJCs verschijnen op het huidige stimulatie van 0.2 mA, gebruiken een stroom van 0,4 mA gedurende het gehele experiment.</li>
	</ol></li> <li>Zegel weerstand <ol><li>meten van de weerstand van de zegel van de opname macropatch elektrode door te draaien aan de elektrode weerstand schakelaar van de versterker aan &#34; zegel test &#34; positie. Observeren dat de waarde van de zegel weerstand in GΩ wordt getoond de &#34; huidige &#34; venster.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de zegel weerstand is in het bereik van 0.5 - 2 M &#8486;. Waarden buiten dit bereik aangeven dat de elektrode niet goed gepolijst of niet goed gepositioneerd.</li>
		<li>Het zegel verzet gedurende de opname te controleren, om ervoor te zorgen het blijft constant gedurende het gehele experiment.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse <ol><li>analyseren opnamen dienst aangepaste software voor analyse (Zie Tabel of Materials). 
	Opmerking: Onze afwerkcentrale gebruikt in-house software Quantan 31, die is aangepast voor de detectie van EJCs en mEJCs focally geregistreerd ( Figuur 4). Deze software bevat een Gaussiaanse digitaal filter en maakt de detectie van quantal pieken in overlappende multi quantal evenementen ( figuur 4A). Andere benaderingen worden beschreven in 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg" /> Figuur 4. Quantal analyse. Detectie van mEJCs (A) en EJCs (B) door Quantan software. De gebeurtenis gebied wordt gemarkeerd in het groen, en pieken zijn gekenmerkt door rode pijlpunten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li>
<li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+%28Bufo+marinus%29+motor-nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li>
<li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+%28Bufo+marinus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li>
<li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li>
<li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li>
<li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li>
<li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li>
<li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li>
<li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release%2C+and+of+entry+and+removal+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li>
<li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction%3A+a+stimulus-dependent+mobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li>
<li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions%2C+and+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfusional+control+of+quantal+current+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li>
<li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Ca2%2B+inflow+to+quantal%2C+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li>
<li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarrero%2C+HG+%22Loose-Patch-Clamp+method%22">Loose-Patch-Clamp method</a>. , 2 ed, Humana Press. (2007).</li>
<li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19229190">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+quantal+analysis+more+convenient%2C+fast%2C+and+accurate%3A+user-friendly+software+QUANTAN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li>
<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Drosophila vertegenwoordigt een voordelige model-organisme te bestuderen van synaptische transmissie. Verschillende configuraties van de opname zijn gebruikt bij de larvale NMJ, met inbegrip van intracellulaire opnames van synaptic potentiëlen, opnames van synaptic stromingen met twee elektrode spanning klem33,34, en focale macropatch opnames van synaptic stromingen die hier worden beschreven. De laatste techniek staat de precieze kwantificering van syna...

Drosophila is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van de moleculaire mechanismen beheersen van synaptische transmissie. Het neuromusculaire systeem in Drosophila is glutamaterge, en daarom de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) kan worden gebruikt voor het bestuderen van de geconserveerde eigenschappen van glutamaterge versie. Sinds Jan en Jan zijn studie1, de derde instar-larven in het algemeen gebruikt om te bestuderen evoked en spontane synaptische transmissie door het toezicht op de excitatory kruising potentieel (EJPs) of stromen (EJCs). EJPs vaak opgenomen intracellulair met een scherpe glas micro-elektrode en worden ze weerspiegelen de activiteit van de gehele NMJ, met inbegrip van alle de los maken van synapsen in de gegeven spiervezel.
Daarentegen kan de activiteit van een beperkt aantal van de sites van release focally worden opgenomen door het plaatsen van een tip van de micropipet in de buurt van neuronale terminals of synaptische varicosities. Deze techniek werd oorspronkelijk gebruikt door Katz en Miledi2, en focale extracellulaire opnames hebben gewerkt op verschillende NMJ preparaten, met inbegrip van kikker3,4,5, muis6 , 7 , 8, schaaldieren9,10,11,12,13,14,15,16, en Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Deze aanpak werd verder ontwikkeld door Dudel, die geoptimaliseerd macropatch elektroden24,25te hercoderen. In Dudel van de uitvoering, en deze techniek toelichtingen de los-patch-clamp methode26.
De Drosophila larvale NMJ heeft duidelijk omschreven synaptic los en transgene lijnen met genetisch gecodeerde neuronale fluorescerende labels (Zie Tabel van materialen) beschikbaar zijn. Deze voordelen ons in staat gesteld om EJCs en mEJCs van een geselecteerde synaptic bouton20,21,22te registreren. Hier beschrijven we deze techniek in detail.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97</td><td>Microelectrode puller</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Glass capilaries</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silicone voor het bereiden van dissectieplaten</td></tr><tr><td>Dissection pins</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>Pins voor het positioneren van larven</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pincet voor het plaatsen van pins, verwijderen van het spijsverteringskanaal en luchtpijpen.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Schaar voor het snijden van de cuticula van de larven en zenuwen.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Staande microscoop</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Microscoopobjectief 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Microscoopobjectief 10X</td></tr><tr><td>Narishige Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>Drie-as Water Hydraulische Micromanipulator</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Elektrofysiologische versterker</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Elektrische stimulator</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimulus isolator</td></tr><tr><td>TMC antivibration table</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>Anti-vibratie tafel</td></tr><tr><td>TMC Faraday cage</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>Faraday kooi</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td>Digidata</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>Computer met Win XP OS</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Elektrode houder</td></tr><tr><td>Optical filter</td><td>Omega optical</td><td>XF 115-2</td><td>Filter kubus voor Green Fluorescent Protein (GFP) detectie</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Software voor signaalregistratie</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>In-house software</td><td>-</td><td>Software voor signaalverwerking</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Controle vlieglinie</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Generous Gift of J.T. Littleton</td><td>-</td><td>Complexin knock-out vlieglinie met verhoogde spontane exocytose</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Vlieglinie met neuronaal fluorescent (GFP) Tag</td></tr></tbody></table>

focal macropatch opnames van synaptic stromingen uit de larvale drosophila motorische eindplaat

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila motorische eindplaat (NMJ) is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van glutamaterge synaptische transmissie. We beschrijven de techniek van focal macropatch opnames van synaptic stromingen van de gevisualiseerde los op de Drosophila larvale NMJ. Deze techniek vereist aangepaste fabricage van opname micropipetten, evenals een samengestelde microscoop uitgerust met een hoge vergroting, interlokale water onderdompeling doelstelling, differentiële interferentie contrast (DIC) optica en een TL bijlage. De opname-elektrode is geplaatst op de top van een geselecteerde synaptic bouton gevisualiseerd met DIC optica, epi-fluorescentie, of beide. Het voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor de opvolging van de synaptische activiteit van een beperkt aantal sites van release. De opname-elektrode heeft een diameter van enkele microns en de release-sites geplaatst buiten de elektrode velg niet noemenswaardig verstoord de opgenomen stromingen. De opgenomen synaptic stromingen hebben snel kinetiek en kunnen gemakkelijk worden opgelost. Deze voordelen zijn vooral belangrijk voor de studies van mutant vliegen lijnen met versterkte spontane of asynchrone synaptic activiteit.

Focal macropatch opnames inschakelen synaptic bewakingsactiviteiten van geselecteerde synaptic los (Figuur 5). Wanneer de elektrode is geplaatst op de top van een synaptic bouton (figuur 5A, site 1), de opgenomen mEJCs (figuur 5C, site 1) hebben een aanzienlijk meer dan het geluidsniveau amplitudes en scherpe stijgende fasen (bij een Sub millisecond bereik). Wanneer de opname-elektrode is afgestapt v...

Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Het algemene doel van deze techniek is om de synaptische activiteit van gevisualiseerde synaptische boutons te bewaken bij de larvenneuromusculaire knooppunt van de drosophila. Een uitstekend modelsysteem dat gemakkelijk leent zich voor genetische manipulaties. Deze techniek kan sleutelvragen in uw wetenschap beantwoorden.Zoals hoe mutaties van synaptische eiwitten de synaptische transmissie reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de activiteit van een beperkt aantal afgifteplaatsen kan worden bewaakt en stromen met snelle kinetica kunnen worden opgenomen en gemakkelijk worden opgelost. Om met het experiment te beginnen: bereid de micro-elektrodetrekker voor.Gebruik een microscoop met 35X vergroting om ervoor te zorgen dat de binnendiameter van de getrokken elektrode in het bereik van zeven tot tien micrometer ligt. Bewaar de capillairen in goed gesloten containers om stofophoping te voorkomen. Polijst vervolgens de capillairen met behulp van een microsmeedoven.Zorg ervoor dat de uiteindelijke binnendiameter van de gepolijste elektrode vijf micrometer is. Ga vervolgens verder met buigen. Bevestig de elektrode in de manipulator en plaats de punt boven het filament zon

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van...

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Dit artikel legt uit hoe u elektrofysiologische opnames van synaptische reacties gedrag op de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft en hoe de zenuwuiteinden zijn gevisualiseerd op de bruto-morfologische verschillen tussen hoog-en laag-output zenuwuiteinden te tonen.

Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

In situ patch clamp opnamen worden gebruikt voor elektrofysiologische karakterisatie van neuronen in intacte circuits. In de Drosophila genetische model patch clamping is moeilijk omdat de CNS is klein en omgeven door een robuuste mantel. Dit artikel beschrijft de procedure om de schede en schoon neuronen voor latere patch clamp opnamen te verwijderen.

Bereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Centraal Neuronen voor<em&gt; In situ</em&gt; Patch clamping

De Drosophila neuromusculaire verbinding (NMJ) wordt gebruikt als model om de morfologie en functie van synapsen te bestuderen. Deze video beschrijft belangrijke kenmerken die onderzoekers kwantificeren om de NMJ te karakteriseren. Het voorbeeldprotocol demonstreert een software die de kwantificering automatisch kan uitvoeren.

Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

This video demonstrates the technique for recording synaptic currents from a synaptic bouton at the Drosophila larva's neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton, which is important for the study of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Recording Synaptic Currents at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Leer focale macropatch-opnames van synaptische stromen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat. Deze methode maakt monitoring van synaptische activiteit bij individuele boutons mogelijk voor onderzoek naar genetische mutaties.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Meer video's verkennen