Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat
25 september 2017
Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.
Het algemene doel van deze techniek is om de synaptische activiteit van gevisualiseerde synaptische boutons te bewaken bij de larvenneuromusculaire knooppunt van de drosophila. Een uitstekend modelsysteem dat gemakkelijk leent zich voor genetische manipulaties. Deze techniek kan sleutelvragen in uw wetenschap beantwoorden.
Zoals hoe mutaties van synaptische eiwitten de synaptische transmissie reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de activiteit van een beperkt aantal afgifteplaatsen kan worden bewaakt en stromen met snelle kinetica kunnen worden opgenomen en gemakkelijk worden opgelost. Om met het experiment te beginnen: bereid de micro-elektrodetrekker voor.
Gebruik een microscoop met 35X vergroting om ervoor te zorgen dat de binnendiameter van de getrokken elektrode in het bereik van zeven tot tien micrometer ligt. Bewaar de capillairen in goed gesloten containers om stofophoping te voorkomen. Polijst vervolgens de capillairen met behulp van een microsmeedoven.
Zorg ervoor dat de uiteindelijke binnendiameter van de gepolijste elektrode vijf micrometer is. Ga vervolgens verder met buigen. Bevestig de elektrode in de manipulator en plaats de punt boven het filament zonder het aan te raken.
Stel de warmtewaarde in op 60-70%van het maximum en druk een tot twee seconden op het pedaal van de microsmeedoven om het filament te verwarmen. Gebruik een L-vormige naald om voorzichtig de punt van de elektrode naar beneden te trekken en maak de bocht op ongeveer 90 graden. Houd de elektrode met de hand boven de vlam van de brander en maak de tweede bocht op zeven tot tien millimeter van de eerste bocht en onder een hoek van ongeveer 120 graden.
Bereid een hemolymf-achtige of HL3-oplossing. Bewaar de oplossing in de koelkast en maak hem elke week vers. Bereid stimulatiepipetten op dezelfde manier voor als opnameglaspipetten, maar buig ze niet.
Plaats vervolgens een stimulatiepipet in een micro-elektrodehouder die is aangesloten op een spuit. Gefabriceerde dissectieplaten uit kleine petrischalen gecoat met siliconenrubberepoxy. Vervolgens, gebruik pincetten om een dwaalenderde derde instar larve uit een flesje te plukken.
Spijker de larve door de eerste speld in het achterste deel te plaatsen en een andere speld vooraan dicht bij de mondhaken. Voeg HL3-oplossing toe. Maak aan de dorsale kant van de larve een snede met behulp van veerscharen van de bovenste speld tot aan de onderste speld.
Spijker de larve filet door twee extra pinnen aan de linker- en rechterkant van de larve te plaatsen. Verwijder de darmen en trachea met behulp van pincetten. Snijd de zenuwen net buiten het ventrale zenuwsnoer met behulp van veerscharen.
Plaats de petrischaal met de voorbereiding op het microscooptafeltje. Plaats de referentie-elektrode in het bad. Vul de opname-elektrode met HL3-oplossing.
Onder het 10X objectief dompelt u de elektrode onder in het bad en plaatst u deze over spieren zes en zeven van de buiksegmenten van twee, drie of vier met behulp van de micro manipulator. Schakel vervolgens over naar 60X en focus op het gebied van belang met behulp van epi-fluorescentie of DIC-optiek. Plaats de punt van de elektrode bovenop de synaptische bouton en druk de elektrode vervolgens heel voorzichtig op de spier aan, aangezien overmatige druk de NMJ kan beschadigen of een toename van spontane synaptische activiteit kan veroorzaken.
Schakel vervolgens de versterker, AD-bord en de computer in. Kies vervolgens de spanningsklemmodus op de versterker. Start de acquisitiesoftware en kies de gap-free modus en observeer het verschijnen van MEJC's op het computerscherm.
Zorg ervoor dat de amplitude van de MEJC's in het bereik van 0,2 tot 0,7 nanoamperes ligt. Plaats met behulp van een micro manipulator onder visuele controle de stimulatie-elektrode nabij de axon die de buiksegmenten twee tot vier innerveert. Oefen negatieve druk uit door de zuiger van de spuit te trekken die is aangesloten op de elektrodehouder, zodat de axon in de elektrode wordt getrokken.
Schakel vervolgens de stimulator in. Draai de knop op de isolatie-eenheid om een nulstroom in te stellen en verhoog deze vervolgens voorzichtig totdat de EJC's verschijnen of totdat de drempelwaarde wordt bereikt. Voer de stimulatie uit in een supra-drempelregime.
Met de stimulatie stijgt de stroom ongeveer twee keer in vergelijking met de drempel voor de waarneming van EJC's. Meet de verzegelingsweerstand van de opname macro-patch elektrode door de weerstandschakelaar van de versterker naar de verzegelingstestpositie te draaien. Observeer de waarde van de verzegelingsweerstand in giga ohm die in het huidige venster wordt weergegeven.
Focale macro patch opnames maken het mogelijk om synaptische activiteit van geselecteerde synaptische boutons te bewaken. Wanneer de elektrode bovenop een synaptische bouton is geplaatst, hebben de opgenomen MEJC's amplituden die significant boven het ruisniveau uitsteken en scherpe stijgende fasen in een sub-millisecondenbereik. Wanneer de opname-elektrode enkele micrometers van de synaptische bouton wordt verplaatst, nemen de amplituden van de opgenomen MEJC's bijna af tot het ruisniveau.
De opgenomen EJC's kunnen nauwelijks worden onderscheiden van het ruis en ze hebben verlengde stijgende fasen. Focale opnames maken nauwkeurige detectie van MEJC's in de complexe en gnome mutant mogelijk. Terwijl de intercellulaire opnames van deze mutant release-gebeurtenissen vertonen die overlappen en niet betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd.
Aanpassing van de hoeken van de elektro-chip is cruciaal voor het positioneren van de elektrode. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals het controleren van beeldvorming van individuele release-gebeurtenissen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de integratie van de activiteit van individuele actieve zones.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek om de synaptische activiteit te monitoren van gevisualiseerde synaptische boutons bij de neuromusculaire junctie van Drosophila-larven in het derde stadium. Door het mogelijk te maken synaptische stromen bij een enkele bouton te meten, beoogt deze methode te onderzoeken hoe mutaties in synaptische eiwitten de synaptische transmissie beïnvloeden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila-larven dienen als een uitstekend model voor genetische manipulaties.
- Focale opnames kunnen stromingen met een snelle kinetiek vanuit synaptische boutons resolveren.
- Het begrijpen van synaptische transmissie is cruciaal voor het ontcijferen van neurale communicatie.
- Het monitoren van individuele release-sites biedt inzichten in de functie van synaptische eiwitten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het nauwkeurig monitoren van synaptische activiteit.
- Het onderzoeken van de impact van genetische mutaties op de synaptische transmissie.
- Onderzoekers in staat stellen om mechanismen van de synaptische functie direct te observeren.
Gebruikte methoden
- De methode maakt gebruik van focale macro patch-registraties van de neuromusculaire junctie van Drosophila-larven.
- Levende larven in het derde stadium werden voorbereid, vastgepind en onderworpen aan dissectie voor toegang tot de cellen.
- Het proces omvat de voorbereiding en positionering van elektroden, en monitoring met voltage-clamp instellingen.
- Kritieke stappen omvatten het nauwkeurig buigen van elektroden en het behouden van de seal-resistentie tijdens de registraties.
Belangrijkste resultaten
- Focale opnames maken een duidelijke detectie van miniature excitatoire junctionele stromen (MEJC's) vanuit geïdentificeerde synaptische boutons mogelijk.
- Veranderingen in de amplitudes van MEJC's geven de effecten van de elektrodepositionering aan.
- Elektrofysiologische veranderingen waren duidelijk zichtbaar in mutante condities, wat inzicht biedt in synaptische dysfunctie.
- De techniek identificeerde verschillend synaptisch gedrag vóór en na manipulatie in genetische modellen.
Conclusies
- Deze studie illustreert een waardevolle aanpak voor het onderzoeken van synaptische activiteit bij individuele afgifteplaatsen.
- Inzicht in synaptische stromen vergroot de kennis over neuronale mechanismen en synaptische plasticiteit.
- Uiteindelijk draagt deze methode bij aan bredere implicaties voor het bestuderen van genetische invloeden op de synaptische functie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Focale macropatch-registraties bij de neuromusculaire junctie van Drosophila-larven maken een precieze analyse van de synaptische transmissie bij individuele release-sites mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicobeperking in de vroege ontdekkingsfase. Deze benadering levert kwantitatieve gegevens met een hoge resolutie over synaptische stromen, wat de functionele validatie van targets en de verduidelijking van pathways voor genetisch gedefinieerde perturbaties faciliteert. De methode versterkt het voorspellende vertrouwen in synaptische biologische modellen, wat een leidraad vormt voor portfolio-triage en beslissingen over verdere ontwikkeling in neurobiologisch georiënteerde R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe beoordeling mogelijk van hoe genetische mutaties in synaptische eiwitten de neurotransmissie veranderen.
- Ondersteunt functionele validatie van kandidaat-targets door synaptische activiteit bij specifieke boutons te isoleren.
- Biedt mechanistische helderheid voor het onderzoeken van signaalpaden en biologische risicoreductie.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij het selecteren of deprioriteren van synaptische targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gevalideerd, kwantitatief assay-systeem vast voor het meten van synaptische stromen met een hoge temporele resolutie.
- Maakt reproduceerbare detectie van miniature en opgewekte synaptische gebeurtenissen mogelijk voor screening van verbindingen of genetische screening.
- Ondersteunt de standaardisatie van elektrofysiologische read-outs over verschillende experimentele condities.
- Bereidt een robuust platform voor om modulatoren van de synaptische functie te evalueren in een genetisch hanteerbaar systeem.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante mechanismen door glutamaterge synaptische transmissie te modelleren in een genetisch toegankelijk organisme.
- Biedt continuïteit van moleculaire ontdekking tot preklinische validatie van synaptische fenotypes.
- Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang van targets mogelijk met een aangetoonde functionele impact op synaptische stromen.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers via kwantitatieve elektrofysiologische eindpunten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot preklinische modelvalidatie, waarbij genetische manipulatie wordt verbonden met functionele synaptische read-outs.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten over de rol van specifieke synaptische eiwitten en signaalpaden.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van synaptische stromen voor assayontwikkeling en screeninggereedheid.
- Analytics: Biedt elektrofysiologische gegevens van hoge getrouwheid voor comparatieve analyse van genetische of farmacologische interventies.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire perturbaties aan functionele synaptische uitkomsten die relevant zijn voor ziektemodellen.
- Enterprise hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor continue targetvalidatie en mechanistische studies over meerdere programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit bij de validatie van synaptische targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert elektrofysiologische workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie door de functionele impact in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van synaptische targets en pathways voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en nauwkeurige manipulatie van micro-elektroden.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder DIC/fluorescentiemicroscopie met hoge vergroting en voltage clamp-versterkers.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie van elektrodefabricage en opnameprotocollen tussen teams.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan protocoloptimalisatie vereisen voor weefseltoegankelijkheid en synaptische architectuur.
- Beperkingen omvatten de gevoeligheid voor de positionering van de elektrode en de noodzaak van een stabiele seal-weerstand om de datakwaliteit te waarborgen.
