Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis
30 januari 2018
Uranium is bekend dat het invloed op bot metabolisme. Hier presenteren we een protocol gericht op het onderzoeken van het effect van natuurlijk uranium blootstelling op de levensvatbaarheid, de differentiatie en de functie van osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk is voor bot resorptie.
Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van blootstelling aan natuurlijk uranium op osteoclast-levensvatbaarheid, differentiatie en functie te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van omgevingstoxiciteit over de impact van uraniumblootstelling op de botfysiologie en het metabolisme. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een interessant nieuw hulpmiddel biedt voor de screening van uranium-originelen.
Wanneer de RAW 264.7-cellencultuur 85 tot 90% confluency heeft bereikt, gebruik een cellscraper om de cellen mechanisch van de bodem van de cellencultuurfles te tillen en breng de cellen over in een steriele 50-milliliter conische buis. Pipet de celsuspensie een paar keer om de klonten te breken en tel de resulterende enkelcellig suspensie. Verdun de cellen tot een eenmaal 10-tot-de-vierde cellen-per-milliliter concentratie in alfa-gemodificeerd Minimum Essential Medium, aangevuld met L-glutamine en 5% foetaal bovien serum en voeg een milliliter cellen per putje toe aan een 24-well cellencultuurplaat voor een zes uur incubatie bij 37 graden Celsius.
Een belangrijke parameter voor de reproduceerbaarheid van de osteoclast-differentiatie en reabsorptie-assay is de celzaaidichtheid. Besteed bijzondere aandacht aan het celtelling, de bereiding van de cellulaire suspensie en de homogeniteit ervan voor het plateren van de cellen. Om de urinezout oplossing te bereiden, begint u vanuit een steriele celcultuur geteste 7,5% natriumbicarbonaat waterige oplossing, bereidt u eerst en koelt u 100 millimolair bicarbonaat in water op ijs af en voegt u één volume van 100 millimolair urinalacetaat oplossing, druppel voor druppel, toe aan negen volumes van de ijskoude bicarbonaat oplossing met zacht schudden.
Laat de oplossing op kamertemperatuur in evenwicht komen. Na drie uur verdunt u het geschikte volume van de urinal-oplossing, druppel voor druppel, in differentiatiemedium bevattend 50 nanogram per milliliter RANKL totdat de gewenste urinal-werkconcentratie is bereikt en laat nog eens drie uur in evenwicht komen op kamertemperatuur. De lange incubatiestappen na elke verdunning van het urinal-zout zijn essentieel voor de stabilisatie van de urinal-complexen in de oplossingen.
Aan het einde van de tweede evenwichtsperiode, vervangt u voorzichtig het medium in elk putje met één milliliter urinal-behandeld of controlemedium, zoals gepast, en brengt u de cellen terug naar de incubator. Multinucleaire osteoclasten zouden tussen dag drie en vier van de cultuur moeten verschijnen. Om de grootte en morfologie van de nieuw gedifferentieerde osteoclasten te beoordelen, kleurt u de cellen met tartraat-resistente zure fosfatase, volgens de instructies van de fabrikant en beeldt u het hele oppervlak van elk putje af met een resolutie die voldoende is om celkernen te onderscheiden.
Wanneer alle putjes zijn afgebeeld, opent u een afbeelding van één putje met open-source ImageJ software en controleert u de schaaleenheden. Controleer vervolgens het Globale vakje in het pop-upvenster om de nieuwe schaaleenheden toe te passen op alle latere afbeeldingen. Onder het Analyseren menu, selecteert u Meetwaarden instellen en controleert u de Vakjes Gebied en Label weergeven.
Vink alle andere vakjes uit. Onder het Analyseren menu, opent u Hulpmiddelen en vervolgens de Belangrijkste Regio Manager en selecteert u het rechthoekige selectiegereedschap in het hoofdvenster van ImageJ. Schets een gebied van belang van ongeveer 1.000-bij-1.000 micrometer en klik op de Toevoegen knop om de selectie toe te voegen aan de Belangrijkste Regio Manager.
Klik vervolgens op Meer, Sla op om de regio op te slaan. Om een kopie van een van de vijf te analyseren regio's te maken, selecteert u de regio van belang in de Belangrijkste Regio Manager en klikt u met de rechtermuisknop in het geselecteerde gebied om de regio te dupliceren. Controleer de Vakjes Toon Alles en Labels en selecteer het polygoon selectiegereedschap om een van de osteoclasten in de gedupliceerde regio van belang handmatig te omlijnen.
Om deze omlijning toe te voegen aan de Belangrijkste Regio Manager, klikt u op Toevoegen in het Belangrijkste Regio Manager venster. Wanneer alle osteoclasten zijn toegevoegd, selecteert u alle omlijningen en klikt u op Meten om hun oppervlakken te meten. Breng vervolgens de metingen die in het resultatenvenster verschijnen over naar een spreadsheet.
Om de functie van urinal-behandelde osteoclasten te beoordelen, plateert u RAW-cellen van een 85 tot 90% confluente cellencultuur een dag voor het toevoegen van het differentiatiemedium op een 24-well osteo assay plaat in groeimedium, zoals net gedemonstreerd. De volgende dag, vervangt u voorzichtig het supernatant met differentiatie urinal-bevattend medium en laat u de RAW-cellen differentiëren tot osteoclasten, zoals net gedemonstreerd. Op dag vijf van osteoclastogenese, vervangt u het urinal-bevattend medium met 10% bleekoplossing om de cellen van het bot-mimetiekoppervlak te verwijderen.
Na vijf minuten bij kamertemperatuur, spoelt u de putjes twee keer met gedeïoniseerd water en laat u ze aan de lucht drogen. Vervolgens kleurt u de calciumzouten in de niet-geresorbeerde gebieden van elk putje met een 1% Alizarine Rood S natriumzout oplossing. Na 10 tot 15 seconden verwijdert u de Alizarine oplossing en spoelt u de putjes voorzichtig drie tot vier keer met water.
Om een RGB-afbeelding van de Alizarine-gekleurde putjes om te zetten in een grijswaarden, 8-bits formaat, selecteert u onder het Afbeelding menu Type en 8-bits. Selecteer vervolgens, met behulp van het ovale selectiegereedschap, het hele oppervlak van het putje om te analyseren voor resorptie en slaat u de regio van belang op, zoals net gedemonstreerd. Om de drempelselectie te vergemakkelijken, selecteert u Bewerk en Helder buiten om alle functies buiten de gedefinieerde regio van belang te wissen.
Dupliceert u de regio van belang zoals net gedemonstreerd en selecteert u Drempel aanpassen onder het Afbeelding menu, door
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van natuurlijke uraniumblootstelling op de levensvatbaarheid, differentiatie en functie van osteoclasten. Het protocol is bedoeld om het begrip van uranium's impact op het botmetabolisme te verbeteren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Milieutoxicologie
- Botfysiologie
Achtergrond
- Uranium is bekend om zijn invloed op het botmetabolisme.
- Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor botreabsorptie.
- Het begrijpen van uranium's effecten kan bijdragen aan milieugezondheid.
- Dit onderzoek draagt bij aan het gebied van milieutoxiciteit.
Doel van het onderzoek
- Om de impact van uranium op osteoclasten te onderzoeken.
- Om cellevensvatbaarheid en differentiatie te beoordelen.
- Om de functionele implicaties van uraniumblootstelling op botgezondheid te verkennen.
Gebruikte methoden
- RAW 264.7 cellencultuur wordt gebruikt voor het onderzoek.
- Cellen worden mechanisch opgetild en geteld voor analyse.
- Cellen worden verdund en geïncubeerd in een gecontroleerde omgeving.
- De methode maakt screening van uraniumeffecten op botcellen mogelijk.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol biedt inzichten in osteoclastgedrag onder uraniumblootstelling.
- Resultaten kunnen veranderingen in levensvatbaarheid en functie aangeven.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van milieueffecten op botmetabolisme.
- Mogelijkheid voor verder onderzoek naar biologische effecten van uranium.
Conclusies
- Deze studie biedt een nieuwe tool voor het onderzoeken van uraniumtoxiciteit.
- Het begrijpen van osteoclastrespons is cruciaal voor botgezondheid.
- Toekomstig onderzoek kan op deze bevindingen voortbouwen om bredere implicaties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of uranium's effects on osteoclastogenesis enables mechanistic de-risking in bone toxicity studies and supports predictive confidence for environmental hazard assessment. This protocol provides standardized, reproducible workflows for evaluating cytotoxicity and functional impacts on bone-resorbing cells, informing early-stage target validation and risk triage. The approach is directly relevant for biopharma teams investigating bone metabolism, toxicology, and environmental exposure liabilities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of uranium's mechanistic impact on osteoclast differentiation and function.
- Supports biological de-risking by quantifying cytotoxicity and resorptive activity changes.
- Facilitates predictive confidence in environmental and bone-targeted toxicity models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vitro systems for screening heavy metal effects on bone cell biology.
- Standardizes cell seeding, media preparation, and image-based quantification for reproducibility.
- Generates quantitative outputs such as osteoclast size and matrix resorption percentage for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant endpoints in bone metabolism and toxicology.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical hazard identification.
- Enables risk-adjusted advancement of environmental toxicity programs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for bone toxicity and environmental hazard assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on uranium's cellular effects and pathway clarification in osteoclastogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative assay outputs for compound or exposure evaluation.
- Analytics: Provides image-based measurements of cell size and resorbed matrix area for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic data to preclinical toxicology endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for assessing other heavy metals or environmental agents on bone cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone toxicity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in environmental and bone-targeted R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of environmental hazard and bone metabolism programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, image analysis, and quantitative assay design.
- Needs access to imaging platforms and analytical software such as ImageJ.
- Demands rigorous standardization of cell seeding and media preparation for reproducibility.
- Adaptable to other cell lines or heavy metal exposures with protocol optimization.
- Limitations include in vitro model constraints and the need for careful thresholding in image analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
RAW 264.7 Differentiation in the Presence of Uranyl Ions [U(VI)]
3:14
Osteoclast Size and Morphology Analyses
5:27
Osteoclast Function in the Presence of U(VI)
8:30
Results: Representative Effects of U(VI) on Osteoclast Size and Function
9:34
Conclusion
