Annexine V en Propidiumjodide-labeling

Annexin V en propidiumjodide (PI) markering van cellen is een techniek die wordt gebruikt om celdood te identificeren en onderscheid te maken tussen de verschillende routes: apoptose, of geprogrammeerde celdood, en necrose. Cellen ondergaan duidelijke morfologische veranderingen, afhankelijk van de route. Door de specifieke omstandigheden te identificeren die ervoor zorgen dat een cel apoptose of necrose ondergaat, krijgen wetenschappers inzicht in de cellulaire fysiologie en de pathofysiologie van ziekten. Annexin V en PI markering, gevolgd door flowcytometrie, is vastgesteld als een van de meest efficiënte methoden om het type celdood te categoriseren.

Vandaag beschrijven we hoe deze test helpt bij het identificeren van celdoodroutes, hoe deze techniek uit te voeren is en enkele spannende voorbeeldexperimenten die deze methode gebruiken om belangrijke vragen in het veld van de celbiologie te beantwoorden.

Eerst nemen we een kijkje achter de principes van annexin V en PI kleuring.

Zoals eerder vermeld, vertonen apoptotische cellen kenmerkende morfologische kenmerken. Deze omvatten celkrimp, membraan blaasjes, nucleaire fragmentatie en het verschijnen van apoptotische lichamen. Bovendien, na inductie van apoptose - dat wil zeggen, in het vroege apoptotische stadium - verschijnen er bepaalde karakteristieke veranderingen op het membraan. Een normale celmembraan heeft alle fosfatidyserine of PS residuen op de binnenste laag. Echter, in vroege apoptotische cellen worden sommige van deze PS residuen naar het buitenoppervlak getransloceerd - maar hoe?

Om dat te begrijpen, laten we een stap terug doen. Tijdens apoptose is het bekend dat cytosolische caspases worden geactiveerd. Deze enzymen activeren op hun beurt een membraangebonden enzym genaamd scramblase. Scramblase 'scrambles' het celmembraan door PS residuen van de cytoplasmatische kant naar het buitenoppervlak te transloceren. In tegenstelling, tijdens necrose blijven PS residuen waar ze zijn, maar het membraan zelf scheurt. Annexin V en PI markering profiteert van deze verschillen in membraanveranderingen van de twee soorten celdood.

Annexin V geconjugeerd met een fluorescerende kleurstof, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat - algemeen bekend als FITC - is een membraan ondoorlaatbaar, natuurlijk ligand voor PS en identificeert daarom gemakkelijk vroege apoptotische cellen door binding aan het geëxternaliseerde PS. Na de membraanbreuk, die optreedt tijdens necrose en ook tijdens latere stadia van apoptose, kan annexin echter ook aan PS op de binnenkant binden en valse positieven opleveren.

Om dit te voorkomen, gebruiken wetenschappers PI. Dit DNA-bindende kleurstofmolecuul is opnieuw membraan ondoorlaatbaar en kan alleen een cel binnendringen wanneer het membraan is gescheurd. Daarom is een cel die alleen met annexin is gekleurd vroeg apoptotisch, terwijl een cel die zowel PI als annexin is gekleurd necrotisch of laat apoptotisch kan zijn.

Nu je de basisprincipes achter deze test hebt geleerd, laten we de procedure van kleuring en analyse van celdood doornemen.

Eerst worden cellen geoogst en gecentrifugeerd bij lage snelheid om morfologische verstoring te voorkomen en opnieuw gesuspendeerd in fysiologische wasbuffer zoals fosfaat gebufferde zoutoplossing, ook bekend als PBS. Na een volgende centrifugeerstap worden cellen opnieuw gesuspendeerd in annexin V bindingsbuffer met calcium, wat noodzakelijk is voor annexin binding aan PS. Annexin V geconjugeerd met FITC wordt vervolgens toegevoegd aan de oplossing, die op kamertemperatuur in het donker wordt geïncubeerd om annexin en PS associatie mogelijk te maken. In de volgende stap wordt PI direct toegevoegd aan de annexin kleuring celoplossing en geïncubeerd in het donker. Na incubatie worden cellen gewassen in PBS door centrifugatie, opnieuw gesuspendeerd in wasbuffer en op ijs bewaard. Nu zijn ze klaar voor analyse.

Fluorescentieactiviteit van cellen wordt geanalyseerd door flowcytometrie, een lasergebaseerde techniek die fluorescentiegegevens van enkele cellen opvangt die in een stroom vloeistof zijn opgeschort. Na kalibratie van fluorescentie met cellen afzonderlijk gekleurd met elke kleurstof, worden gegevens van dubbel gekleurde cellen verkregen. Fluorescentiesignalen van de celpopulatie worden gebruikt om een plot te maken waarbij annexin-gebonden FITC intensiteit wordt uitgezet op de logaritmische X-as en PI op de logaritmische Y-as. Cellen die annexin-FITC positief en PI negatief zijn, zullen zich op de onderste rechterkant van de plot verzamelen, wat de vroeg apoptotische cellen vertegenwoordigt, en cellen die dubbel positief zijn voor annexin-FITC en PI zullen voorkomen op de bovenste rechterkant, wat de laat apoptotische of necrotische cellen vertegenwoordigt. De cellen die ongekleurd of onbeduidend gekleurd zijn voor zowel annexin als PI zijn levende cellen.

Aangezien je nu weet waarom celbiologen op deze techniek vertrouwen om celdood te bestuderen, laten we eens kijken naar enkele van de toepassingen.

Met behulp van deze procedure kunnen wetenschappers volgen welke intracellulaire eiwitten betrokken zijn bij apoptose. In deze video analyseerden onderzoekers het effect van cisplatine, een middel tegen kanker, op normale niercellen om te zien of het apoptose induceert. Een set cellen werd getransduceerd om een actieve vorm van het enzym proteïne kinase C, of PKC, overexpress te laten en de andere set werd getransduceerd met een niet-functionele vorm - dominante negatieve PKC. Cellen die PKC expresseerden en werden behandeld met cisplatine ondergingen apoptose na verloop van tijd, maar cellen die de inactieve dominante negatieve PKC expresseerden waren resistent tegen apoptose, wat aangeeft dat het enzym een sleutelrol speelt in de door cisplatine geïnduceerde apoptoseroute.

Onderzoekers gebruiken deze kleuringen ook om het cytotoxische potentieel van specifieke T-cellen te testen. Cytotoxische T-cellen kunnen specifieke membraaneiwitten op zijn doelcel herkennen en zijn dood induceren bij binding eraan. Hier hebben onderzoekers antigeen-specifieke T-cellen geïncubeerd met doelwit tumorcellen en annexin V en observeerden vervolgens inductie van tumorcel apoptose door T-cel betro