Een geautomatiseerde snelle iteratieve negatieve Geotaxis Assay voor het analyseren van volwassen klimmen gedrag in een Drosophila Model van neurodegeneratie
12 september 2017
Dit stapsgewijze protocol analyseert Drosophila negatieve geotaxis gedrag met behulp van een geautomatiseerd systeem van meerdere cilinders die honderden vliegen en synchroniseert hun optreden door een elektromotor. Bij synchronisatie, is vliegen negatieve geotaxis gedrag vehiculumcontrolegroep, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van de zelf ontworpen RflyDetection software.
Het algemene doel van deze geautomatiseerde snelle, iteratieve negatieve geotaxis-test is om de tekortkomingen in het klimmen van volwassen Drosophila die geassocieerd zijn met neurodegeneratie te analyseren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het neurologische veld te beantwoorden, zoals het mechanisme van locomotieve tekortkomingen die geassocieerd zijn met neurodegeneratie. Het grote voordeel van deze techniek is dat de klimactiviteit van vliegen op een geautomatiseerde en professionele manier kan worden geanalyseerd.
De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie en diagnose van neurodegeneratie, omdat neurodegeneratieve ziekten vaak geassocieerd zijn met een progressieve vermindering van de bewegingscapaciteit en een verkortte levensduur en ouderdomsgerelateerde neurodegeneratie. We hadden eerst het idee voor deze methode. We wilden de locomotieve activiteit van volwassen Drosophila nauwkeuriger meten.
Om de vliegen te verzamelen, begint u door de vliegen op standaard vliegenvoer te houden bij 25 graden Celsius, 70% vochtigheid en een cyclus van 12 uur licht, 12 uur donker. Verzamel UAS-Dicer2 DDC-GAL4 vrouwelijke vliegen onder koolstofdioxide-anesthesie. Kruis de vrouwtjes met twee dagen oude volwassen mannelijke vliegen met de volgende genotypen, met een verhouding van mannetjes tot vrouwtjes van een-op-twee.
Verzamel afzonderlijk nieuw uitgeslopen mannetjes en vrouwtjes in drie flesjes voor elke groep per experiment, met 10 vliegen in elk regulier vliegflesje met standaardvoedsel. Zet de flesjes vervolgens op 25 graden Celsius. Om de geautomatiseerde RING-test uit te voeren, zet u 10 verzamelde unisex vliegen per genotype in elk flesje.
Bevestig vervolgens de fles met een schroef. Analyseer controlevliegen en vliegen met verschillende genotypen samen voor elke set experimenten. Zet de digitale camera aan die voor het apparaat staat en start de opname zodra de vliegen zijn geladen en klaar zijn.
De camera moet horizontaal worden geplaatst en op een goede afstand van het RING-apparaat om de posities van alle vliegen op een relatief nauwkeurige locatie vast te leggen. Laat de vliegen een minuut de tijd om zich in de flesjes te nestelen, zet vervolgens de stapcontroller aan die de stapdriver bestuurt. Dit drijft de kleine elektromotor aan om de bevestigde hendel te besturen, zodat deze achtereenvolgens stijgt en het apparaat vier keer in twee seconden tikt.
Na het tikken van het apparaat, merk op dat de vliegen beginnen de muur op te klimmen. Terwijl de opname nog loopt, herhaalt u de synchronisatie zoals net gedemonstreerd, in intervallen van 60 seconden voor drie tot vijf opeenvolgende proeven. Herhaal het experiment voor vijf, 15, 25 en 35 dagen oude vliegen.
Voer minstens drie onafhankelijke experimenten uit voor elke groep voor elk experiment, met minimaal 30 verzamelde vliegen of drie flesjes. Om de gegevens te analyseren, importeer de opgenomen video in de computer. Voor elke proef, neem een momentopname van de video zes seconden na het tikken.
Gebruik in de R-fly detectiesoftware het menubestand om de momentopname afbeelding te importeren. Gebruik vervolgens het basislijnpictogram op de werkbalk om de bovenste en onderste basislijnen van de fles precies in te stellen en gebruik vervolgens de cursor om de bovenste en onderste basislijnen op de afbeelding te markeren. Voer in het instellingenveld het aantal vliegen per fles in en voer in het veld Buishoogte de lengte van de fles in.
Individuele vliegposities worden voor elke fles gedetecteerd en gelabeld met stipjes op het scherm. Merk op dat in een tabel op het rechterpaneel de software automatisch de klimafstand voor elke vlieg bepaalt en de gemiddelde waarden weergeeft van 10 vliegen in elke fles. Presenteer de gegevens als het gemiddelde plus of min SEM.
Bereken de P-waarden van significantie met behulp van een eenrichtings ANOVA met een Bonferroni-test voor meerdere vergelijkingen. Analyse van Dicer2-vliegen met behulp van de geautomatiseerde RING-test gepresenteerd in deze video toonde een leeftijdsafhankelijke afname van de klimafstand in een tijdsbestek van zes seconden voor zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen, wat suggereert dat aux-expressie in dopaminerge of DA-neuronen cruciaal is voor de locomotorische activiteit van vliegen. De klimcapaciteit lijkt niet te worden beïnvloed door auxGFP-overexpressie in DA-neuronen en co-expressie van auxR en auxGFP in DA-neuronen gered van het RNAi-fenotype.
Eenmaal onder de knie, kan dit in twee tot drie uur worden gedaan als het goed wordt uitgevoerd. Dit ontwikkelen is nu een manier voor onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen om neurodegeneratie in Drosophila melanogaster te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met elektrische RING-apparaten uiterst gevaarlijk kan zijn en dat elke bevestiging stevig moet worden vastgemaakt en zorgvuldig moet worden gecontroleerd voordat u deze procedure uitvoert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde methode voor het analyseren van het negatieve geotaxis-gedrag van Drosophila, met de nadruk op klimtekorten bij volwassenen die verband houden met neurodegeneratie. De techniek maakt gebruik van een systeem met meerdere cilinders om de bewegingen van vliegen te synchroniseren en vast te leggen, wat inzicht biedt in locomotiegebreken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Neurodegeneratie
Achtergrond
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten.
- Negatieve geotaxis is een maatstaf voor het locomotieve vermogen bij vliegen.
- Neurodegeneratie leidt vaak tot progressief verlies van bewegingsvermogen en een verkorte levensduur.
- Geautomatiseerde systemen verbeteren de nauwkeurigheid van gedragsassays.
Doel van de studie
- Om klimtekorten bij Drosophila die geassocieerd zijn met neurodegeneratie te analyseren.
- Om de mechanismen die ten grond liggen aan locomotiedefecten te onderzoeken.
- Om de meetnauwkeurigheid van de locomotieactiviteit van vliegen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerd systeem met meerdere cilinders voor gesynchroniseerde beweging van vliegen.
- Digitale registratie van negatief geotaxisgedrag.
- Analyse met behulp van zelfontworpen RflyDetection-software.
- Snel iteratieve assay voor high-throughput datacollectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synchronisatie van vliegenbewegingen voor een nauwkeurige analyse.
- Identificatie van klimdeficiten gekoppeld aan neurodegeneratie.
- Geautomatiseerde analyse bleek efficiënt en betrouwbaar.
- Potentiële implicaties voor de therapie en diagnose van neurodegeneratieve ziekten.
Conclusies
- De geautomatiseerde assay biedt een robuuste methode voor het bestuderen van het locomotieve gedrag bij Drosophila.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan therapeutische benaderingen voor neurodegeneratie.
- Deze techniek verdiept het begrip van de relatie tussen beweging en neurodegeneratieve aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze geautomatiseerde high-throughput assay maakt een snelle kwantificering van locomotorische defecten in Drosophila-modellen van neurodegeneratie mogelijk, wat vroege targetvalidatie ondersteunt door objectieve, reproduceerbare gedragsmatige resultaten te leveren. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen bij preklinische screening door gelijktijdige analyse van honderden vliegen over meerdere genotypen en leeftijdsgroepen toe te staan, wat een efficiënte evaluatie van verbindingen of genetische modifiers faciliteert. De integratie in discovery-workflows helpt bij het mechanistische de-risking van neurodegeneratieve targets door middel van gestandaardiseerde, schaalbare fenotypering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het kwantificeren van leeftijdsafhankelijke klimdeficiten gekoppeld aan neurodegeneratie in genetische modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via high-throughputmeting van locomotorische activiteit als maatstaf voor neuronale integriteit.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gedragsgegevens die portfolio-triage ondersteunen door het identificeren van genotypen met significante motorische beperkingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metrieken voor negatieve geotaxis die geschikt zijn voor assay-validatie in screeningcampagnes gericht op neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Maakt snelle screening van genetische of farmacologische modifiers mogelijk via geautomatiseerde videocaptures en analyse met RflyDetection-software.
- Schaalbaarheid: Verwerkt gegevens van honderden vliegen per run, waardoor de doorvoer toeneemt en de variabiliteit afneemt in vergelijking met handmatige assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Biedt een ziekterelevant systeem voor het beoordelen van locomotorische fenotypen die parallel lopen aan klinische bewegingsstoornissen bij neurodegeneratieve aandoeningen.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt longitudinale beoordeling over verschillende vliegenleeftijden (5, 15, 25, 35 dagen) om progressieve neurodegeneratie te modelleren.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt evaluatie van genetische rescue-experimenten mogelijk (bijv. auxR/auxGFP co-expressie) om doelspecificiteit en betrokkenheid van signaalpaden te valideren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een kwantitatief gedragsmatig eindpunt dat de brug slaat tussen genetische manipulatie en fenotypische uitkomst in modellen voor neurodegeneratie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door genexpressie (bijv. aux in dopaminerge neuronen) te koppelen aan locomotieve functie via iteratieve metingen van negatieve geotaxis.
- Screening: Levert assay-klare, gestandaardiseerde resultaten (klimafstand over 6 seconden) die een betrouwbare vergelijking tussen verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Analytics: Genereert data als gemiddelde ± SEM met statistische precisie (éénweg-ANOVA, Bonferroni-correctie) ter ondersteuning van intergroepsvergelijkingen en significantietoetsing.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt gedragsmatige read-outs met neurodegeneratieve mechanismen, wat bijdraagt aan biomarker-afgestemde fenotypische beoordeling in preklinische modellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor longitudinale gedragsscreening over meerdere genotypen, leeftijden en behandelingsgroepen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via kwantificeerbare, hoge-resolutie gedragsfenotypering.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via geautomatiseerde synchronisatie, digitale registratie en softwarematige analyse.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door snelle beoordeling van locomotorische deficiënties over grote steekproefgroottes mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van robuuste, leeftijdsafhankelijke gegevens over fenotypische progressie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met Drosophila, het onderhoud van genetische kruisingen en het opzetten van gedragsassays.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder het geautomatiseerde RING-apparaat, een stappenregelaar, een digitale camera en compatibele verlichting.
- Vereist een computationele infrastructuur voor video-import, snapshot-extractie en het bedienen van de RflyDetection-software.
- Omvat de standaardisatie van omgevingscondities (25°C, 70% luchtvochtigheid, 12u licht/donkercyclus) en protocollen voor de bereiding van vials.
- Bevat veiligheidsoverwegingen vanwege elektrische componenten; het apparaat moet worden vastgezet en gecontroleerd voor gebruik.
