Name: Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Leer hoe je volledig humane monoklonale antistoffen genereert uit circulerende B-lymfocyten in bloed. Deze methode discrimineert nauw verwante antigenen en is essentieel voor immunotherapie-toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Cytometry faciliteit "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor deskundige technische bijstand. Wij danken ook al het personeel van de productie van recombinante eiwitten (P2R) en IMPACT platformen (INSERM 1232 SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor hun technische ondersteuning. Wij danken Emmanuel Scotet en Richard Breathnach voor constructieve opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd financieel ondersteund door het IHU-Cesti project gefinancierd door de Franse regering «Investissements d'Avenir» programma, beheerd door de Franse nationale onderzoek Bureau (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door de Nantes Métropole en Région Pays de la Loire. Dit werk werd gerealiseerd in het kader van het programma van de LabEX IGO ondersteund door de National Research Agency via de investering van het toekomstige programma ANR-11-LABX-0016-01.

<ol><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+therapeutics%3A+history+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).</li>
<li>Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment.</a> Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).</li>
<li>Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+therapeutic+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies.</a> Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).</li>
<li>Kwakkenbos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+monoclonal+antibody-producing+B+cell+receptor-positive+human+memory+B+cells+by+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming.</a> Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Morris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+human+anti-HIV+gp41+membrane+proximal+region+neutralizing+antibody+by+antigen-specific+single+B+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting.</a> PLoS One. 6 (9), e23532(2011).</li>
<li>Iizuka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cytomegalovirus+%28CMV%29pp65+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies+using+single+B+cell-based+antibody+gene+cloning+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients.</a> Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).</li>
<li>Ouisse, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+single+B+cell+sorting+and+expression-cloning+from+immunoglobulin+humanized+rats%3A+a+rapid+and+versatile+method+for+the+generation+of+high+affinity+and+discriminative+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).</li>
<li>Kerkman, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+citrullinated+antigen-specific+B+cells+in+peripheral+blood+of+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis.</a> Ann Rheum Dis. , (2015).</li>
<li>Hamilton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Approach+for+Tetramer-Based+Identification+of+Autoantigen-Reactive+B+Cells%3A+Characterization+of+La-+and+snRNP-Reactive+B+Cells+in+Autoimmune+BXD2+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice.</a> J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).</li>
<li>Sanjuan Nandin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vitro+booster+vaccination+to+rapidly+generate+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Bowers, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+display+for+the+discovery+and+optimization+of+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics.</a> Methods. 65 (1), 44-56 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het voorgestelde protocol is een krachtige methode voor het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks vanuit Ag-specifieke B-cellen in het bloed circuleren. Het combineert drie belangrijke aspecten: (i) het gebruik van een tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking, waarmee een ex vivo isolatie van zelfs zeldzame Ag-bindende B cellen; (ii) een gating strategie die gebruikmaakt van drie Ag tetramers (twee relevante enen en één irrelevant) geëtiketteerd met drie verschillende fluorochromes te isoleren, door s...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>

Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

De hier beschreven methode kan de snelle en veelzijdige productie van volledig menselijke monoklonale antistoffen (mAbs) tegen een gewenste antigeen (Ag). mAbs zijn essentiële instrumenten in veel basisonderzoek toepassingen in vitro en in vivo: stroom cytometry, histologie, westelijke bevlekken en blokkerende experimenten bijvoorbeeld. Bovendien worden mAbs gebruikt meer en meer in de geneeskunde voor de behandeling van auto-immuunziekten, kanker, en zo de besturing van transplantatie afwijzing1. Bijvoorbeeld, werden de anti-CTLA-4 en anti-PD-1 (of anti-PD-L1) mAbs onlangs gebruikt als immuun checkpoint-remmers in kanker behandelingen2.
De eerste mAbs werden geproduceerd door immunoglobuline (Ig)-afscheidende hybridomas verkregen uit de milt cellen van geïmmuniseerde muizen of ratten. Echter, de sterke immuunrespons tegen RattenUitrustingen of rat mAbs belemmert hun therapeutisch gebruik bij de mens, als gevolg van hun snelle goedkeuring en de waarschijnlijke inductie van overgevoeligheid reacties3. Om dit probleem aan te pakken, zijn dierlijke eiwitten sequenties van mAbs gedeeltelijk vervangen door menselijke degenen voor het genereren van zogenaamde Chimeer muis-mens of gehumaniseerd antilichamen. Deze strategie vermindert echter slechts gedeeltelijk immunogeniciteit, terwijl zowel de kosten en de tijd-schaal van de productie aanzienlijk te verhogen. Een betere oplossing is het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks uit menselijke B-cellen en verschillende strategieën daarvoor zijn beschikbaar. Een van hen is het gebruik van bacteriofaag of gist display. Hierbij weergeven van variabele domeinen vanuit een combinatorische bibliotheek met willekeurige menselijke Ig zware en lichte kettingen op bacteriofagen of gisten en het uitvoeren van een selectie stap met behulp van het specifieke antigeen van belang. Een groot nadeel van deze strategie is dat zware en lichte kettingen willekeurig gekoppeld zijn, leidt tot een zeer grote toename in de diversiteit van de gegenereerde antilichamen. Antilichamen verkregen zijn onwaarschijnlijk overeen moeten komen met degenen die uit een natuurlijke immuunrespons tegen een bepaalde Ag voortvloeien zou. Bovendien, menselijke eiwitvouwing en posttranslationele modificaties zijn niet systematisch gereproduceerd in prokaryoten of zelfs in gisten. Een tweede menselijke mAb productiemethode is de immortalization van natuurlijke menselijke B cellen, door Epstein - Barr virusinfectie of expressie van de anti-apoptotic factoren BCL-6 en BCL-XL4. Echter, deze methode is alleen van toepassing op geheugencellen B en is inefficiënt, vereisen screening van talrijke mAb-producerende vereeuwigd B cellen te identificeren van de weinig (eventuele) mAb-klonen met de gewenste antigene specificiteit. De methode is dus zowel dure en tijdrovende.
Onlangs werd een nieuw protocol voor de productie van menselijke mAbs van geïsoleerde één B cellen5beschreven. Zij beroept zich op een geoptimaliseerde eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor versterking van zowel de zware - en licht-keten segmenten van een enkele cel voor gesorteerde B-codering. Dit wordt gevolgd door het klonen en de uitdrukking van deze segmenten in een eukaryoot expressie systeem, waardoor de wederopbouw van een volledig mens mAb. Dit protocol is gebruikt met succes vanaf B cellen van gevaccineerde donoren. Cellen zijn enkele weken na de vaccinatie verkrijgen van hogere frequenties van B-cellen die gericht is tegen de gewenste Ag, en dus het beperken van de tijd die nodig is voor het screenen van6geoogst. Er zijn ook andere volledig menselijk mAbs verkregen uit HIV+ (Human Immunodeficiency Virus) besmette patiënten7 en melanoom patiënten8. Ondanks deze vooruitgang is er nog steeds geen procedure beschikbaar waarmee het isolement van de Ag-specifieke B cellen onafhankelijk van hun geheugen fenotype of frequentie.
De procedure beschreven hier leidt tot efficiënte ex vivo isolatie van menselijke circulerende B cellen op basis van hun BHG specificiteit, gevolgd door de productie van volledig menselijk antigeen-specifieke mAbs in hoog rendement en met een tijd van lage screening. De methode is niet beperkt tot de geheugencellen B of antilichaam-afscheidende B cellen na een immuunrespons veroorzaakte, maar kan ook worden toegepast op het repertoire van de B-cel menselijke naïef. Dat het werkt zelfs vanaf Ag-specifieke B-cellen aanwezig bij zeer lage frequenties is een goede indicatie van de efficiëntie. Het uitgangspunt van de methode is als volgt: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gekleurd met twee tetramers het antigeen van belang presenteren, elk gemarkeerd met een verschillende fluorescerende (b.v.Phycoerythrin (PE) en Allophycocyanin (APC)), en een derde tetrameer presenteren een verwant antigeen geconjugeerd met een derde fluorescerende (bijvoorbeeldBrillant Violet 421 (BV421)). Om te verrijken voor antigeen-bindende cellen, cellen worden vervolgens geïncubeerd met kralen met anti-PE gecoat en anti-APC Abs, en in cel scheiding kolommen gesorteerd. De Fractie van de cel PE+ APC+ is geselecteerd, gekleurd met een scala aan mAbs specifiek voor verschillende PBMC celtypes toe te staan van de identificatie van B-cellen, en onderworpen aan stroom cytometry cel sorteren. B-cellen die PE+ en APC+, maar briljante Violet-, zijn geïsoleerd. Deze stap selecteert tegen cellen die geen B-cellen of niet binden aan de tetramerized antigeen, maar binden aan PE of APC (deze cellen zullen PE+ - APC of PE- APC+) of aan het deel van de niet-antigeen van de tetramers gebruikt (deze cellen zullen BV421+). B-cellen niet zeer specifiek voor de epitoop van belang zijn ook contra geselecteerd bij deze stap (deze cellen zullen ook BV421+). Dus, kan deze methode zeer specifieke B-cellen, uiting van B-cel receptoren (BCRs) te discrimineren tussen twee zeer nauw verwante antigenen kunnen zuiveren. Enkele specifieke B-cellen worden verzameld in buizen en hun PCR-versterkte Ig cDNAs (complementaire deoxyribonucleic zuren) wordt gekloond en wordt geuit door een menselijke cellijn als secreted IgG mAbs.
Als een proof of concept, deze studie beschrijft de efficiënte generatie van menselijke mAbs, die herkennen een peptide gepresenteerd door een grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul en kan onderscheid maken tussen dit peptide en andere peptiden geladen op dezelfde MHC-ik allel. Hoewel het niveau van complexiteit van deze Ag is belangrijk, kunt met deze methode (i) hoge opbrengst herstel van Ag-specifieke mAbs; (ii) de productie van mAbs staat te discrimineren tussen twee structureel sluit Ags. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot gevaccineerde en besmette patiënten zonder enige wijziging van het protocol, en ook al met succes is uitgevoerd in een gehumaniseerd rat systeem9. Deze studie beschrijft dus, een veelzijdige en efficiënte aanpak voor het genereren van volledig menselijk mAbs die kunnen worden gebruikt in basisonderzoek en immunotherapie.

<table><tbody><tr><td>HEK 293A cell line</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - lymphocytes separation medium</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>density 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>streptavidin R-phycoerythrin conjugate</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide</td></tr><tr><td>Streptavidin, allophycocyanin conjugate</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM azide premium grade</td></tr><tr><td>Brilliant violet 421 streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs or QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Used dilution 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Used dilution 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Used dilution 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Used dilution 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Used dilution 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-strip PCR tubes</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks for 96 microtubes</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>qty:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Distilled Water Dnase/Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Random hexamers</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>qty : 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Reverse transcriptase</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>qty : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, Molecular biology grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td>

generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke b-cellen in bloed circuleert

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antilichamen (mAbs) zijn krachtige instrumenten nuttig voor zowel fundamenteel onderzoek en medische biologie. Hun hoge specificiteit is onmisbaar wanneer het antilichaam moet onderscheid worden gemaakt tussen sterk verwante structuur (b.v., een normaal eiwit en een gemuteerde versie ervan). De huidige manier van het genereren van dergelijke discriminerende mAbs omvat uitgebreide screening van meerdere B Ab-producerende cellen, die is zowel duur en tijdrovend. Wij stellen hier een snelle en kosteneffectieve methode voor de generatie van discriminatoire, volledig mens mAbs vanaf menselijk bloed circuleren van B-lymfocyten. De originaliteit van deze strategie is te wijten aan de celselectie specifiek antigeen bindende B gecombineerd met de contra selectie van alle andere cellen, met behulp van gemakkelijk beschikbare perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zodra bepaalde B-cellen geïsoleerd zijn, worden cDNA (bijkomende deoxyribonucleic acid) sequenties codering voor de overeenkomstige mAb verkregen met behulp van eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) technologie en vervolgens uitgedrukt in mens cellen. Binnen zo weinig als 1 maand is het mogelijk om te produceren milligram van hoogst discriminatoire menselijke mAbs gericht tegen vrijwel elke gewenste antigeen natuurlijk gedetecteerd door de B-cel-repertoire.

Vanaf PBMC van gezonde donoren, dit project presenteert de generatie van menselijke mAbs, die de peptide Pp65495 herkennen (Pp65, van menselijke cytomegalovirus) gepresenteerd door de grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul HLA - A * 0201 () HLA-A2). Deze mAbs kan onderscheid maken tussen deze complex en complexen die andere peptiden geladen op de dezelfde MHC-ik molecuul.
PBMC werden gekleurd met...

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Het algemene doel van deze procedure is om volledig menselijke monoklonale antilichamen te produceren tegen een gewenst antigeen, beginnend vanaf humane B-lymfocyten die circuleren in het bloed. Dit protocol maakt het mogelijk om monoklonale antilichamen te genereren die kunnen onderscheiden tussen nauw verwante antigenen. Voor sommige toepassingen zoals immunotherapie kan precies targeten van een antigeen onmisbaar zijn.De voordelen van deze techniek zijn dat dit kan worden uitgevoerd vanaf het bloed van gezonde of geïmmuniseerde donoren en het isoleert zelfs zeldzame antigeen-bindende B-cellen. Hoewel deze methode wordt beschreven vanaf humane monsters, kan deze ook worden toegepast op dieren die vooraf geïmmuniseerd kunnen worden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de procedure echt onder een vrij complexe meervoudige analytische gatingstrategie van gediscrimineerde B-lymfocyten valt.De procedure wordt uitgevoerd door Melinda. Zij is een assistent-ingenieur uit ons laboratorium. Pipetteer eerst 35 milliliter verdunde celsuspensie op 15 milliliter dichtheidsgradiënt in een 50 milliliter kegelbuis.Plaats vervolgens de kegelbuis in een draaibare emmerrotor met de remmen uit en centrifugeer gedurende 25 minuten bij 1290 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur. Vervolgens, bij het kruispunt van het dichtheidsgradiëntmedium en de plasmalaag, aspireer voorzichtig de mononucleaire cel laag en breng deze over in een nieuwe 50 milliliter kegelbuis. Voeg de celsuspensie toe aan een 15 milliliter kegelbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 460 keer de zwaartekracht.Resuspendeer vervolgens het pellet in 200 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum. Voeg geconjugeerde tetrameren toe tot een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter. Meng goed en incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de laminare stroomkap, beschermd tegen licht.Voeg vervolgens 10 milliliter ijskoud celscheidingsbuffer toe aan de celsuspensie. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 460 keer de zwaartekracht. Voeg aan het verkregen celpellet 500 microliter ijskoud celscheidingsbuffer en 50 microliter van twee varianten van magnetische microbeads toe en incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten.Resuspendeer vervolgens het celpellet in ijskoud celscheidingsbuffer. Breng de celsuspensie voorzichtig over op de bovenkant van een geëquilibreerde kolom en laat het volledig uitlekken. Spoel vervolgens de buis met drie milliliter celscheidingsbuffer en breng de buffer over naar de kolom.Na het drie keer spoelen van de kolom, verwijder deze van de magneet en plaats deze op een 25 milliliter kegelvormig opvangbuisje. Na het toevoegen van vijf milliliter ijskoud scheidingsbuffer bovenop de kolom, spoel de cellen snel uit de kolom met behulp van een plunjer. Resuspendeer het celpellet met een cocktail van anti-menselijke antilichamen en 7AAD in een totaal volume van 100 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum.Incubeer vervolgens de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een celsorter cytometer om specifieke B-cellen op het niveau van één cel te sorteren, niet meer dan 1.000 gebeurtenissen per seconde. Verzamel vervolgens de gesorteerd geïsoleerde B-cellen in 8-strip PCR-buisjes die eerder zijn gevuld met 10 microliter 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing en 10 eenheden RNAse-remmer en plaats deze op een rek voor 96 microbuisjes.Vries de buisjes snel in bij minus 80 graden Celsius. Verwarm de bevroren monsters in een droogbad op 70 graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen te lyseren. Plaats vervolgens de strip op ijs en begin met het samenstellen van de omgekeerde transcriptie mastermix.Zodra de omgekeerde transcriptie mastermix is voorbereid, programmeer de thermocycler. Voer aan het einde van de omgekeerde transcriptie nested PCR's uit om immunoglobuline-genen te versterken. Identificeer de positieve klonen door de migratie van een 500 basenpaar PCR-product voor variabele zware keten en coderende segmenten en 350 basenpaar PCR-product voor variabele lichte keten coderende segmenten te visualiseren op een 1,5% agarosegel.Voeg een microliter van het kloningsproduct toe aan 45 microliter elektrocompetente TOP10 E.coli-cellen. Elektroporeer. Voeg vervolgens snel 500 microliter 2X YT-medium toe aan de cellen en incubeer in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Verspreid de getransformeerde bacteriën op een 2X YT-ampicillineplaat.Incubeer vervolgens de platen een nacht bij 37 graden Celsius. Stel vervolgens een reactiepremix samen en voeg 25 microliter ervan toe in per 8-strip PCR-buisje op ijs. Gebruik vervolgens een steriele tandenstoker om kolonies te plukken en streken de kolonies op de 2X YT-ampicillineplaat.Dompel vervolgens de tandenstokken in het PCR-reactiebuisje. Identificeer de positieve klonen door de migratie van een 850 basenpaar PCR-product voor de zware keten vector en een 600 basenpaar PCR-product voor de lichte keten vector te visualiseren op een 1,5% agarosegel. In twee milliliter LB-medium, inoculeer vier positieve kolonies.Incubeer het inoculaat gedurende een nacht bij 37 graden Celsius met 200 omwentelingen per minuut schudden. Zaai 15.000 menselijke embryonale niercellen in 200 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium gesupplementeerd met 10% foetaal bovien serum in elke put van een vlakbodem 96-wells plaat een dag voor de transfectie. Incubeer vervolgens de plaat een nacht bij 37 graden Celsius bij 5% koolstofdioxide.Cotransfecteer de cellen met behulp van een lineair polyethyleenimide derivaat transfectiereagens. Verdun 0,5 microliter DNA-transfectiereagens met 10 microliter 150 millimolar natriumchloride. Verdun vervolgens 0,125 microgram van elk variabele zware en lichte keten expressievectoren in 10 microliter 150 millimolar natriumchloride.</

generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Synthese van humane monoklonale antilichamen is de eerste stap in studies die gericht zijn op het ontrafelen van de pathofysiologische mechanismen van auto-antilichaam-gemedieerde immuunresponsen. We hebben een protocol ontwikkeld om recombinante humane immunoglobuline G (IgG) monoklonale antilichamen te genereren van uit bloed gesorteerd B-cellen, inclusief B-cel isolatie, antilichaam klonen en in vitro synthese.

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Leer hoe je volledig humane monoklonale antistoffen genereert uit circulerende B-lymfocyten in bloed. Deze methode discrimineert nauw verwante antigenen en is essentieel voor immunotherapie-toepassingen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Meer video's verkennen