De TUNEL-test

De TUNEL-test wordt meestal gebruikt om cellen te detecteren die apoptose ondergaan, een vorm van geprogrammeerde celdood. Apoptose is een belangrijk biologisch proces tijdens de ontwikkeling en voor het handhaven van weefselhomeostase. TUNEL-kleuring maakt het mogelijk om apoptotische cellen te visualiseren en te kwantificeren. Dit helpt wetenschappers de effectiviteit van nieuwe behandelingen te testen voor aandoeningen waarbij apoptose geremd is, zoals bij kanker, of verhoogd, zoals bij neurodegeneratie.

Deze video legt uit hoe de TUNEL-test kan worden gebruikt om cellen die apoptose ondergaan te labelen, een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van deze methode op weefselsecties en hoe onderzoekers deze techniek toepassen om mechanismen van celdood te begrijpen.

Voordat we ingaan op het protocol van de TUNEL-test, laten we de principes achter deze techniek bespreken.

Een van de vele kenmerkende kenmerken van apoptose is DNA-fragmentatie. Hoe gebeurt DNA-fragmentatie? Apoptose wordt uitgevoerd door enzymen die caspasen worden genoemd en die aanwezig zijn in het cytosol. Hun primaire rol is om eiwitten te kloven om de cel te ontmantelen. Bovendien activeren caspasen een enzym genaamd caspase-geactiveerde DNase, of CAD, door het los te maken van zijn remmer - ICAD. Geactiveerde CAD is een endonuclease die naar de kern reist en chromosomaal DNA kleft.

Cleavage van DNA veroorzaakt uiteindelijk accumulatie van DNA-fragmenten met geknikte uiteinden, en de TUNEL-test labelt deze geknikte uiteinden van gefragmenteerd DNA fluorescent, waardoor wetenschappers apoptose kunnen detecteren. Maar hoe gebeurt dit? Daarvoor moet je de TUNEL-reactie begrijpen. TUNEL staat voor terminal deoxynucleotidyl transferase-gemedieerde dUTP nick-end labeling. De twee belangrijkste TUNEL-reagentia zijn terminal deoxynucleotidyl transferase, of TdT, en deoxyuridinetrifosfaat, of dUTP, die fluorescent gelabeld kunnen worden voor gemakkelijke detectie.

Om de TUNEL-reactie te begrijpen, laten we teruggaan naar de apoptotische cellen met DNA-fragmenten. Deze geknikte fragmenten hebben vrije 3′ hydroxylgroepen. Zodra je de TUNEL-reagentia toevoegt aan een monster dat apoptotische cellen bevat, hechten de fluorescent gelabelde dUTP's zich aan deze 3′ hydroxylgroepen met behulp van het katalytische enzym TdT. De cellen die met deze procedure worden gekleurd, worden TUNEL-positieve cellen genoemd, die vervolgens kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Nu je de basisprincipes en concepten achter de TUNEL-test begrijpt, laten we een algemeen protocol schetsen voor het uitvoeren van deze techniek op weefselsecties. De belangrijkste stappen van de TUNEL-test omvatten het fixeren van het weefsel van belang, permeabilisatie van het weefsel, het toevoegen van TUNEL-reagentia, het stoppen van de TUNEL-reactie en ten slotte de analyse.

Eerst moet het weefsel van belang worden gefixeerd om biologische structuren te behouden. Fixatie werkt door eiwitten in cellen te crosslinken. Voor de TUNEL-test kunnen weefsels worden gefixeerd door ze 4-24 uur bij 4°C toe te voegen aan een oplossing die 4% paraformaldehyde bevat. Na fixatie cryosectie het weefsel in dunne plakjes van 10 µm of minder.

De volgende stap is permeabilisatie, die het mogelijk maakt voor reagentia zoals het TdT-enzym om het celkern te penetreren. Permeabilisatie van weefselsecties kan worden uitgevoerd door het weefsel 5-15 minuten bij 37°C toe te voegen aan een proteïnase K-oplossing. Spoel weefselsecties met fosfaatgebufferde zoutoplossing op een orbitale shaker gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur.

Na permeabilisatie worden het TdT-enzym en fluorescent gelabelde dUTP's toegevoegd aan de weefselsecties, samen met een labelbuffer die kobalt bevat dat werkt als cofactor voor de TUNEL-reactie. Samen worden de TUNEL-reactiemix en de weefselsectie gedurende 1-3 uur bij 37°C geïncubeerd en beschermd tegen licht om te voorkomen dat de fluorescentie vervaagt.

Na incubatie wordt stopbuffer toegevoegd aan de weefselsectie om de TUNEL-reactie te stoppen en na een korte incubatie worden de secties gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Ten slotte worden weefselsecties die zijn gekleurd met fluorescent gelabelde dUTP's gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie en beoordeeld op lokalisatie van TUNEL-positieve cellen in een bepaald weefsel. Celdood kan eenvoudig worden gekwantificeerd door het percentage TUNEL-positieve cellen in een bepaalde weefselsectie te tellen.

Nu je hebt gezien hoe je de TUNEL-test kunt uitvoeren om apoptotische cellen te detecteren, laten we bespreken hoe deze test kan worden gebruikt om vragen van celbiologen te beantwoorden.

Celdood vindt plaats als een normaal onderdeel van ontwikkeling voor het vormgeven van weefsels en structuren en voor het elimineren van onnodige cellen. Daarom bestuderen wetenschappers die in dit fenomeen geïnteresseerd zijn het effect van prenatale blootstelling aan verschillende stoffen op apoptose tijdens de ontwikkeling. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het onderzoeken van het effect van prenatale alcoholblootstelling op hersenontwikkeling. De resultaten van TUNEL-kleuring die op foetale hersenen werden uitgevoerd, toonden verhoogde apoptose in weefsels die prenataal aan alcohol waren blootgesteld, vergeleken met controledieren.

Wetenschappers gebruiken de TUNEL-test ook om apoptose te onderzoeken als reactie op bacteriële infectie. In dit experiment ontwikkelden wetenschappers een model van longontsteking door muizen te injecteren met Pseudomonas aeruginosa, die longontsteking induceert. Vervolgens werd longweefsel verwijderd en werd TUNEL-kleuring uitgevoerd om apoptose in reactie op de bacteriële infectie te onderzoeken. Resultaten tonen aan dat apoptotische celdood toeneemt bij muizen die aan de bacteriën zijn blootgesteld, vergeleken met controledieren.