Name: Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Leer de isolatie van intacte muizenmammaklieren voor histologische analyse van extracellulaire matrixexpressie en ductale architectuur. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen April Wiles en Dr. Roger Broderson voor hulp bij het dierlijke necropsie en isolatie van de klier, respectievelijk. Financiering voor dit werk werd gesteund door de Philadelphia College of Osteopatisch Medicine centra voor chronische aandoeningen of Aging.

procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen in dit protocol werden herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité van de Philadelphia College of Osteopatisch Medicine en alle technieken werden uitgevoerd onder strikte ethische richtsnoeren.
 1. steekproef aanbestedingen en verwerking <ol><li>Selecteer passende dierlijke onderwerp en plaats een CO 2 zaal. Gebruik voor dit experiment, 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar B6. CG-Cav1tmMIs/J en C57BI/6J.</li>
	<li>Inschakelen gasstroom tot 30-40%. Zodra het dier zichtbaar bewusteloos is na ongeveer 2 minuten, open de gas klep aan de volledige druk voor een extra 5 min. 
	Opmerking: Bevestigen dier dood door het observeren van de zichtbare tekenen van de ademhaling (bv. de beweging van de borstkas) voor een periode van 10 minuten na beëindiging van de CO 2 levering. Als het dier nog leeft, kan het terug in de CO 2-kamer worden geplaatst. Cervicale dislocatie kan ook gebruikt worden, hoewel dit niet raadzaam is als bloed kan ophopen rond de borstklieren bemoeien met de dissectie en resultaten.</li>
	<li>Na offer, pin karkas in een liggende positie en verzadigen met 70% ethanol.</li>
	<li>Knijpen de pelt net boven het schaambeen met pincet en nick met een kleine chirurgische schaar. De schaar, roterende gesneden de pelt langs de ventral midline verplaatsen caudal craniale.</li>
	<li>Met grotere schaar of een hemostat, bot ontleden de subcutane fascia bilateraal, met voorzichtigheid niet aanprikken van het buikvlies. U snijdt langs de horizontale marges aan beide distale uiteinden van de incisie.</li>
	<li>Pin de pelt kleppen open en spuit weer met 70% ethanol. 
	Opmerking: Hoewel het gebruik van 70% ethanol toegestaan beter visueel onderscheid tussen de klier en de omringende subcutane weefsel, voorzichtig om te voorkomen dat het drogen van het weefsel als gevolg van gebruik van deze oplossing. Om te voorkomen drogen, verwijdert u de klier in een time frame niet meer bedragen dan 4 min. Als alternatief voor 70% ethanol, de onderzoeker kan ook vervangen door een algemene isoleren buffer, zoals 1 x PBS, om te voorkomen dat weefsel opdroging.</li>
	<li>Zoeken de borstklieren van belang, schuif een #4 scalpel mes langs de binnenkant van de kleppen van pelt, snijden de melkklier en bijbehorende cutane adipeus vrij van de dermis. 
	Opmerking: 3.5 x chirurgische micro loupes kan steun bij gemakkelijker visualisatie van de klieren.</li>
	<li>Direct dompelen nieuw geïsoleerd klier in conische buis met 10:1 oplossing-weefsel volume van 10% neutraal gebufferde formaline voor 24-48 h. 
	Opmerking: Afhankelijk van de opzet van de studie, veel alternatieve fixatives kunnen worden gebruikt zoals paraformaldehyde, ethanol voor genomic studies en verkrijgbare RNA behoud van buffers.</li>
	<li>Volg institutionele protocollen voor het insluiten van paraffine, dienen de monsters naar een leverancier voor verwerking, insluiten, en snijden/dia montage. Afdeling weefsels op 5 µm. 
	Opmerking: Als gevolg van overtollige obesitas omliggende klier, kunt u overwegen verwijderen 100-200 µm van weefsel voor segmenteren en kleuring.</li>
</ol> 2. Weefsel Staining <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>plaats dia's te worden gekleurd op warmte blok vastgesteldop 58 ˚C voor 1 h te smelten paraffine. 
		Let op: Smelten van paraffine dia kan wegvloeien. In de gaten of plaats van vegen onder de dia te vangen afvoer wax. 
		Opmerking: Deze stap is niet essentieel en kan worden overgeslagen. Als de resultaten zijn niet zoals verwacht, het toevoegen van deze stap terug resultaten kan verbeteren.</li>
		<li>Incubate dia's in een dia jar met 100% xyleen voor 30 min zorgen voor volledige onderdompeling. Eenmaal herhaald. 
		Opmerking: op dit punt, visuele inspectie moet worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat weefselsecties vrij van vetweefsel en paraffine zijn. Als extra adipeus weefsel of wax blijkt, moet de dia opnieuw worden ondergedompeld in xyleen. Wees voorzichtig om te minimaliseren van toegevoegde blootstelling aan xyleen, omdat dit leiden inkrimping van het weefsel tot kan.</li>
		<li>Hydrateren weefsels in een pot van de dia met 100% ethanol voor 10 min. eenmaal herhaald.</li>
		<li>Zet dia's aan een dia jar met 95% ethanol voor 10 min. eenmaal herhaald.</li>
		<li>Dia's aan een dia pot met 75% ethanol voor 5 min. verplaatsen</li>
		<li>Dia's aan een dia pot met 50% ethanol voor 5 min. verplaatsen</li>
		<li>10 mM Natriumcitraat oplossing (pH 6.0) in een hete plaat of een magnetron koken en giet in Coplin jar. 
		Let op: Zorgvuldig oplossing terwijl verwarming controleren en verzorgen om te voorkomen dat kook. Container zullen erg warm. Bescherming te gebruiken om te voorkomen dat brandwonden.</li>
		<li>Langzaam plaats dia's Coplin jar, zorgen voor volledige onderdompeling, en Incubeer bij 100 ° C gedurende 10 minuten ophalen epitopes. Verwijderen en zorgvuldig droog dia.</li>
		<li>Tekent een barrière rond weefsel met een hydrofobe marker. Voeg genoeg endogene enzym blocker (waterstofperoxide en natriumazide, beschikbaar commercieel) te dekken weefsel en incubeer gedurende 10 min.</li>
		<li>Submerge dia's in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 10 minuten</li>
		<li>Toevoegen genoeg serum 10% ezel in 1 x PBS te dekken weefsel en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. 
		Opmerking: Het experiment kan hier onderbroken worden door de dia's op te slaan in de bevochtigde zaal bij 4 ° C's nachts. Terwijl donkey serum bleek optimale kleuring resultaten oplevert, kan de onderzoeker wil verschillende testsera zoals bovien serumalbumine (BSA), geit serum of paard serum om optimale resultaten. Als BSA, de onderzoeker deze vers vóór gebruik moet bereiden.</li>
		<li>Overtollige blocker uit dia's decanteren en behoorlijk verdunde primair antilichaam in 1% serum rechtstreeks toevoegen aan dia's ervoor te zorgen dat het weefsel in de oplossing gelijkmatig bedekt is. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. 
		Opmerking: Deze stap kan worden voortgezet voor langere tijdsduur met vochtige kamer bewaard bij 4 ° C. Zorg ervoor op te nemen van de juiste negatieve controle dia's (bijvoorbeeld een dia met geen primair antilichaam, bekend antigeen-negatieve weefsel, etc.) bij deze stap.</li>
		<li>Zorgvuldig wassen van dia's door stroomt ongeveer 1 mL diH 2 O over weefsel en incubeer in 1 verandering van 1 x PBS voor 5 min.</li>
		<li>Overtollige PBS decanteren en genoeg horseradish peroxidase label weefsel en incubeer gedurende 30 min. in een bevochtigde kamer toevoegen. 
		Opmerking: Bij deze stap, de onderzoeker kan wil overgaan tot fluorescerende vlekken met behulp van fluorescently geconjugeerd secundaire antilichamen. Indien dit is gewenst, de volgende stappen moeten dienovereenkomstig worden gewijzigd.</li>
		<li>Zorgvuldig wassen van dia's door stroomt ongeveer 1 mL diH 2 O over weefsel en incubeer in 1 verandering van 1 x PBS voor 5 min.</li>
		<li>Maken diaminobenzidine (DAB) plus chromogeen oplossing volgens de voorgestelde verhouding van fabrikant en meng door vortex. 
		Opmerking: Veel kant en klare kits zijn commercieel beschikbaar afgezien van degene die in dit protocol worden gebruikt.</li>
		<li>Decant overmaat buffer van dia's en voeg 2-3 druppels (10-50 µL) chromogeen vlek direct naar weefsels en Incubeer gedurende 5 min. in vochtige kamer. Dia's door vloeiende ongeveer 1 mL diH 2 O grondig te wassen over weefsel. 
		Let op: DAB-chromogeen is zeer giftig. Vermijd direct contact van de vlek met huid en verzamelen stroom uit in gevaarlijke afvalstoffen.</li>
	</ol></li> <li>Haematoxyline en eosine (H &#38; E) <ol><li>laatste spoeling na chromogeen incubatie, dia's in Harris Haematoxyline voor 2-2,5 min. spoelen dia voorzichtig onder leidingwater voor 1-2 min. onderdompelen 
		Opmerking: zorgen om rechtstreekse waterstraal op weefsels.</li>
		<li>Submerge dia's voor 2-3 s in differentiatie oplossing (0,25 mL zoutzuur in 100 mL 70% ethanol). Spoel van dia's voorzichtig onder de kraan water voor ongeveer 1-2 min.</li>
		<li>Onderdompelen van dia's in blauwe agent (4.5 mg calciumcarbonaat in 100 mL leidingwater, pH aangepast aan 9.4) voor 60 s. Rinse dia's in 95% ethanol voor 30 s.</li>
		<li>Submerge dia's in alcoholische eosine Y gedurende 2-3 minuten</li>
		<li>Weefsel in 2 wijzigingen van 95% ethanol voor 1 min elke uitdrogen.</li>
		<li>Weefsel van de Dehydrate in 1 wijzigen van 100% ethanol voor 1 min.</li>
		<li>Zorgvuldig droog dia's met een pluisvrij doekje. Toepassing 1 druppel (ongeveer 100-200 µL) van kunststof, niet-waterige, hars gebaseerde montage media naar dia en breng dekglaasje aan. 
		Opmerking: Indien een verschillende kleuringstechniek werd verkozen, een montage van verschillende media kan worden verlangd. Bijvoorbeeld, als de onderzoeker koos een TL-geconjugeerde secundair antilichaam, een waterige mount zou idealere.</li>
		<li>Toestaan van dia's instellen 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius rood (PSR) Staining <ol><li>Selecteer dia's die moeten worden gekleurd en volgen van immunohistochemistry protocol via stap 6 (50% ethanol soak).</li>
		<li>Submerge dia's in PSR vlek voor 1 h.</li>
		<li>Onderdompelen van dia's in 0,5% azijnzuur voor 1-2 s, tweemaal om te onderscheiden van vlek.</li>
		<li>Weefsels in 2 wijzigingen van 95% ethanol voor 1 min elke uitdrogen.</li>
		<li>Weefsels van de Dehydrate in 1 wijzigen van 100% ethanol voor 1 min.</li>
		<li>Schakelt u dia's door kort opgedeeld in 100% xyleen voor over 3-4 s.</li>
		<li>Zorgvuldig droog dia's met een pluisvrij doekje. Toepassing 1 druppel (ongeveer 100-200 µL) van kunststof, niet-waterige, hars gebaseerde montage media naar dia en breng dekglaasje aan.</li>
	</ol></li></ol> 3. Proef de analyse <ol><li>Ductaal analyse <ol><li>Selecteer dia's gekleurd voor α-SMA. Met behulp van een lichte Microscoop uitgerust met een camera gemonteerd doelstelling, het verzamelen van representatieve beelden met 20 X vergroting.</li>
		<li>Using ImageJ (NIH), onderscheiden en tellen van leidingen in elk beeld. Dit kunnen handmatig worden geïnventariseerd of een een numerieke score kan toewijzen aan individuele leidingen. Toewijzen van een numerieke score, ImageJ openen en selecteer Plugins. Selecteer vervolgens analyseren en cel item te kiezen uit het drop down menu. Klik op Initialize en markeer Type 1 om te beginnen met het labelen van leidingen. Wanneer u klaar bent, selecteer resultaten weergeven van de ductaal graaf. 
		Nota: zorg om te controleren of structuren zijn Ductaal en niet vasculaire.</li>
		<li>In &#39; meting instellen &#39; opties, Controleer &#39; omtrek &#39; en &#39; gebied &#34;.</li>
		<li>Met het freehand vormgereedschap, tekent u een lijn rond elke buis op het myoepithelial compartiment (zichtbaarheid geholpen door α-SMA vlek). Selecteer &#39; maatregel &#39; en neem de omtrek en oppervlakte.</li>
		<li>Opnieuw met behulp van het freehand vormgereedschap, teken een lijn langs de apicale zijde van de ductaal epitheel binnen het interieur van de lumen. Selecteer &#39; maatregel &#39; en neem de omtrek en oppervlakte.</li>
		<li>Aftrekken de omtrek van de luminal afdeling van de omtrek van het compartiment van de myoepithelial met het oog op de omtrek van de ductaal epitheel. Aftrekken van het gebied van de luminal afdeling van het gebied van het compartiment van de myoepithelial te verkrijgen op het gebied van het ductaal epithelium.</li>
	</ol></li> <li>Immunohistochemistry analyse <ol><li>helderveld afbeeldingen uploaden naar een analytische software, zoals ImageJ of FIJI Suite. 
		Opmerking: Dit protocol beschrijft de stappen voor de kleuring van de analyse met behulp van ImageJ en de plugin IHC Toolbox.</li>
		<li>Open IHC werkset in het menu Plugin. In de &#34; Selecteer Model &#34; keuzelijst met invoervak dat opent, selecteert u de juiste vlek (d.w.z. H-DAB, PSR, enz.). Selecteer de &#34; kleur &#34; optie te isoleren van de vlek. Hiermee opent u een resultaatvenster. 
		Opmerking: Deze methode is geschikt als een proteïne van belang in de extracellulaire of cytosolische ruimten ligt, of afhankelijk is van het plasma-membraan. Als de proteïne van belang nucleaire is, selecteren &#34; kernen &#34; wordt gevraagd de plugin voor het analyseren van de afbeelding voor positief gebeitst kernen.</li>
		<li>Gebruiken de kleur Chooser Slide om te zorgen voor goede isolatie van de vlek zonder achtergrond opgenomen in of uitgesloten van de buitensporige vlek. 
		Opmerking: Als de automatische modus niet kan detecteren van de vlek of niet leidt een aanvaardbare afbeeldingen tot, teken een vierkant regio van belang (ROI) over een geïdentificeerde gekleurd regio. Selecteer op het IHC Toolbox venster, &#34; trein &#34; direct van de plugin om de juiste doelgroep.</li>
		<li>De afbeelding omzetten in 16-bits. Ga naar Image &#8594; Type &#8594; 16bits.</li>
		<li>Drempel de afbeelding. Ga naar Image &#8594; aanpassen &#8594; Auto drempel.</li>
		<li>Stel de schaal van de meting van het beeld door een streep ROI direct boven de bar van de schaal in de afbeelding vervolgens de lengte toe te wijzen. Om de schaal lat, ga naar analyseren &#8594; schaal instellen. Ingang van het aantal pixels per de gewenste eenheid van lengte (bijvoorbeeld 120 pixels per 50 µm).</li>
		<li>Meten van de resulterende gebied en grijze waarde betekenen. Ga naar analyseren &#8594; Set metingen en het verzamelen van de meting door te klikken op analyseren &#8594; maatregel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de krant, hebben we een techniek om te isoleren van de borstklieren intact muis voor downstream histologische analyses van ECM expressie en ductaal morfologie beschreven. Met betrekking tot de analyses van ductaal morfologie maakt deze methode het snelle onderzoek van ductaal het platform gebaseerd off van gebeitst histologische secties. Andere methoden van ductaal analyses, is afhankelijk van injecties van kleurstoffen om de visualisatie van de ductaal boom, methoden die technisch uitdagende en tijdrovend kunnen zijn...

Borstkanker wordt gekenmerkt door een aanzienlijke mate van weefsel fibrose1,2,3,4. Hierna de ECM, deze niet-cellulair entiteit wordt gevonden in wisselend in alle weefsels en bestaat voornamelijk uit een complexe Zitschalen van fibrillar en niet-fibrillar collagens, elastine en glycoproteïnen naast verschillende signalering moleculen die zijn afgezonderd in deze matrix. Homeostatische omstandigheden, is de afzetting en de aantasting van de ECM streng gecontroleerd. 5 tijdens borst tumorvorming, het evenwicht van ECM afzetting en afbraak wordt verstoord. Tumoren van de borst zijn als zodanig gemeld uitspreken overvloedige ECM eiwitten zoals collagens, fibronectin en tenascin-C o.a.. 6 de abnormale uitdrukking van deze proteïnen naast verhoogde patronen van matrix crosslinking is gedocumenteerd ter bevordering van de borst tumor progressie, metastase en therapie resistentie1,3, 4,7,8,9.
Om te beoordelen ECM samenstelling en ductaal morfologie, werd isolatie van intact borstklieren uitgevoerd. Hier hebben we vrouwelijke nullipaar muizen gebrekkig gebruikt voor caveolin-1, een integraal membraan eiwit die is gekoppeld aan een agressieve borstkanker tumor handtekening10,11,12, en controle over vrouwelijke nullipaar B6 muizen. Histologische verwerking en kleuring van deze weefsels toegestaan de identificatie van verschillende ECM eiwitten samen met de karakterisering van ductaal morfologie.
Over het geheel genomen geeft het isolement van geheel, intact borstklieren onderzoekers de mogelijkheid te onderzoeken weefsel bestrijkende morfologische of cellulaire veranderingen naar aanleiding van exogene of endogene factoren. Nadelen van de techniek worden geassocieerd met analyses van 2 dimensie (2D) weefselsecties in tegenstelling tot een 3D perspectief, die een vollediger beeld van de complexe morfologie van de ductaal boom zou opleveren. Gezien de complexiteit van cel-cel en cel-ECM interacties die in de melkklier plaatsvinden, is het isolement van de klieren van het geheel, intact gunstig voor het efficiënt analyseren ductaal morfologie en eiwit expressie in verschillende regio's van de borstklier RattenUitrustingen klier.

<table><tbody><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Olympus</td><td>cellSens Entry software</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R chirurgische micro loep</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Vergroting naar keuze van onderzoeker</td></tr><tr><td>Mayo schaar</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Kleurbak</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Kleurschaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Coplin potten</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Glazenvellen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Maat geschikt voor weefsel</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Muis, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Rood Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y, alcoholisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylinen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Ezelserum</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutraal Gebufferd Formaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen, Reagenskwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>geschikt voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Citraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Carbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Montage Medium</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt's Montage Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Gladde Spier Actine antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire matrix expressie en klier morfologie

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Het doel van deze procedure was om te oogsten van de #4 abdominale borstklieren van vrouwelijke nullipaar muizen teneinde ECM expressie en ductaal architectuur. Hier is een klein zakje onder de huid gemaakt met behulp van Mayo schaar, waarmee een scheiding van de klieren in het onderhuidse weefsel van de onderliggende buikvlies. Visualisatie van de klieren was geholpen door het gebruik van 3.5 x-R chirurgische micro loupes. De pelt werd omgekeerd en gespeld terug waardoor identificatie van de intact borstklier vet pads. Elk van de #4 abdominale klieren was ronduit ontleed door te schuiven van het scalpel blad lateraal tussen de subcutane laag en de klieren. Onmiddellijk na de oogst, de klieren werden geplaatst in 10% neutraal gebufferde formaline voor latere bewerking. Excisie van de hele klier is voordelig omdat het voornamelijk het risico elimineert uit te sluiten van belangrijke weefsel bestrijkende interacties tussen ductaal epitheliale cellen en andere microenvironmental cellulaire populaties die kunnen worden gemist in een gedeeltelijke biopsie. Een nadeel van de methode is het gebruik van seriële secties uit vaste weefsels die analyses van ductaal genuitdrukking en eiwit expressie naar een discrete locatie in de klier beperkt. Wijzigingen in ductaal architectuur en eiwit expressie in 3 dimensies (3D) is als zodanig niet makkelijk verkrijgbare. De techniek is over het algemeen van toepassing op studies vereisen geheel intact lymfkliertest borstklieren voor downstream onderzoeken zoals ontwikkelingsstoornissen ductaal morfogenese of borst kanker.

Vrouwelijke muizen hebben 5 paar melkklieren. Er is met name één paar van cervicale klieren (#1), twee paren van thoracale klieren (#2 en #3), één paar abdominale klieren (#4), en 1 paar inguïnale klieren (#5)(Figuur 1). Hier, we geïsoleerd van de #4 klieren zoals ze duidelijk herkenbaar zijn. In sommige gevallen werden zowel #4 en #5 klieren geïsoleerd samen zoals het onderscheid tussen de twee was moeilijk. Om te isoleren intact #4 abdomina...

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Het algemene doel van deze techniek voor het oogsten van de gehele borstklier is om de analyse van de histologische presentatie van borstweefsel van een intacte klier ex-vivo te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de tumorbiologie, zoals hoe stromaweefsel in tumoren wordt gemodelleerd of hoe abnormale gen- of eiwitexpressie de borstductale architectuur verandert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om eiwitexpressie en ductale architectuur in gehele borstklieren van gezonde en zieke muizen te karakteriseren en kwantificeren.Chris Thompson, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Na het doden van vrouwelijke nullipare muizen van acht tot 10 weken volgens het protocol in de tekst, speldt u het karkas in een rugligging en verzadig het met 70% ethanol. Gebruik een pincet om de vacht net boven het schaambeen vast te knijpen en knip hem door met kleine chirurgische schaar.Draai vervolgens de schaar en snijd de vacht langs de ventrale middenlijn, van het staartgedeelte naar het hoofdgedeelte. Gebruik een grotere schaar of een hemostaat om de subcutane fascia bilateraal te dissecteren, waarbij u voorzichtig moet zijn om het buikvlies niet te puncteren. Snijd langs de horizontale randen aan beide distale uiteinden van de incisie.Prik vervolgens de vachtkleppen open en spuit het weefsel met PBS om het vochtig te houden. Zoek vervolgens de belangrijke borstklieren en schuif een scalpelmes langs de binnenkant van de vachtkleppen, waarbij u de borstklier en de bijbehorende subcutane vetlaag vrij snijdt van de dermis. Voordat u de buikklier van de lies scheidt, zorg ervoor dat u de klieren zo duidelijk mogelijk identificeert.Dompel de zojuist geïsoleerde klier onmiddellijk onder in een kegelbuis met ongeveer zes milliliter van een 10 tot 1 oplossing op weefselvolume 10% neutraal gebufferd formaline, en incubeer deze gedurende 24 tot 48 uur. Na het smelten van het paraffine van de schuiven en het opnieuw hydrateren van de plakjes volgens het protocol in de tekst, kook 10 millimolair natriumcitraat oplossing op een hot plate of in een magnetron en giet de oplossing in een Coplin-pot. Plaats de schuiven langzaam in de Coplin-pot, zorg ervoor dat ze volledig ondergedompeld zijn, en incubeer de schuiven gedurende 10 minuten bij 100 graden Celsius om epitopen terug te krijgen.Verwijder vervolgens en droog de schuiven voorzichtig. Teken vervolgens een barrière rond het weefsel met een hydrofobe marker. Zodra deze is opgedroogd, spoel de schuiven een tot twee seconden met PBS.Voeg vervolgens voldoende endogene enzymblokker toe om het weefsel te bedekken en incubeer de schuiven gedurende 10 minuten. Dompel de schuiven gedurende 10 minuten in 1X PBS. Voeg vervolgens voldoende 10%ezelserum en PBS toe om het weefsel te bedekken en incubeer de monsters op kamertemperatuur in een bevochtigde kamer gedurende één uur.Decanteer overtollige blokker van de schuiven en voeg voldoende verdunde primaire antilichaam in 1%serum toe direct op de schuiven, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel gelijkmatig bedekt is met oplossing. Incubeer de schuiven op kamertemperatuur in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten. Was de schuiven voorzichtig door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water over het weefsel te laten stromen en incubeer vervolgens de schuiven in één verandering van 1X PBS gedurende vijf minuten.Decanteer het overtollige PBS en voeg voldoende paardenradish-peroxidase geconjugeerd secundair antilichaam toe en incubeer de monsters in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten. Was de schuiven voorzichtig door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water over het weefsel te laten stromen en incubeer vervolgens het weefsel in één verandering van 1X PBS gedurende vijf minuten zoals eerder. Na het bereiden van de DAB plus chromogen-oplossing, decanteer het overtollige buffer van de schuiven en voeg twee tot drie druppels chromogenkleur direct toe aan het weefsel.Incubeer de monsters in een bevochtigde kamer gedurende vijf minuten. Was vervolgens de schuiven voorzichtig door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water over het weefsel te laten stromen. Na een laatste spoeling na de chromogen-incubatie, dompelt u de schuiven gedurende twee tot twee en een half minuut in Harris hematoxylinen.Spoel vervolgens de schuiven zachtjes onder stromend water gedurende een tot twee minuten. Dompel de schuiven gedurende twee tot drie seconden in het differentiatie-oplossing. Spoel vervolgens de schuiven zachtjes onder stromend water gedurende ongeveer één tot twee minuten.Dompel de schuiven gedurende 60 seconden in blauwe agent. Spoel vervolgens de schuiven gedurende 30 seconden in 95%ethanol. Breng de schuiven over in alcoholisch eosin Y gedurende twee tot drie minuten voordat u het weefsel in twee veranderingen van 95%ethanol gedurende één minuut elk dehydrateert.Dehydrateer ten slotte het weefsel eenmaal gedurende één minuut in 100%ethanol. Droog de schuiven voorzichtig af met een pluisvrije doek. Breng vervolgens een druppel synthetische, niet-waterige hars-gebaseerde montagemedium aan op de schuif en breng een dekglas aan.Om ductale analyse uit te voeren, selecteert u schuiven die gekleurd zijn voor alfa SMA. Gebruik vervolgens een lichtmicroscoop uitgerust met een camera-objectief om representatieve beelden bij 20X vergroting te verzamelen. Om de ducten in elk beeld te tellen, tel ze handmatig of open ImageJ en selecteer plugins.Selecteer vervolgens analyseren en kies uit het vervolgkeuzemenu de celteller. Klik op initialiseren en markeer vervolgens type één om te beginnen met het labelen van ducten. Wanneer u klaar bent, selecteert u resultaten om het ductale aantal te bekijken.

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.

Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode

We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.

Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

Leer de isolatie van intacte muizenmammaklieren voor histologische analyse van extracellulaire matrixexpressie en ductale architectuur. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en kanker.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Meer video's verkennen