Name: Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-bevattende fagosomen uit macrofagen met behulp van biotine en streptavidine. Deze techniek is toegankelijk voor beginnende onderzoekers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in de Robinson's lab wordt ondersteund door financiële middelen van Keulen Excellence Cluster op cellulaire Stress reacties in Aging-Associated ziekten, Universiteit van Keulen, Duitsland (CECAD; gefinancierd door de DFG binnen het Excellence-initiatief van de Duitse federale en staat regeringen) en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln fortuin en Maria-Pesch Stichting van de Universiteit van Keulen, Duitsland.

alle stappen met betrekking tot het gebruik van pathogene S. typhimurium moeten worden uitgevoerd in een BSL-2 of een hogere biologische veiligheid niveau faciliteit. De cultuur en de coating van S. Typhimurium, evenals de infectie van het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) moet worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow om verontreiniging te voorkomen. De isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes kan worden uitgevoerd op een bankje van de laboratorium BSL-2.
 de extractie van het beenmerg van muizen voor de differentiatie in macrofagen werd uitgevoerd overeenkomstig institutionele richtsnoeren inzake dierenwelzijn en goedgekeurd door de Noordrijn-Westfaalse staat agentschap voor de natuur, Milieu en bescherming van de consument [Landesamt für Natur, Umwelt en Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Neen File: 84-02.05.40.14.082 en 84-02.04.2015.A443] en de Universiteit van Keulen.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>Inoculate S. typhimurium (SL1344-stam) uit een enkele bacteriële kolonie in hersenen hart infusie (BHI) bouillon met een bacteriële lus 5 mL.</li>
	<li>De bacteriële suspensie in een incubator bij 37 ° C's nachts met schudden Incubeer.</li>
	<li>Op de volgende dag, 1 mL van de bacteriële suspensie in 19 mL BHI Bouillon in een erlenmeyer en Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof met schudden.</li>
	<li>Volgen de S. typhimurium groei door het meten van de optische dichtheid (OD) op 600 nm (OD 600) met een spectrofotometer. Metingen moeten worden verricht ongeveer elke 30 min.</li>
	<li>Bij OD 600 bereikt 1.0, bacteriële schorsing uit de incubator en overdracht in tube 50 mL verwijderen. Centrifugeer bacteriën bij 5400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijderen van supernatant en resuspendeer in 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Centrifugeer bij 5400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën in 4.9 mL steriele PBS.</li>
</ol> 2. Coating van S. typhimurium met magnetische kralen NHS-Biotine/streptavidine-geconjugeerd <ol><li>Voeg 100 µL van 10 mg/mL Biotine koppelen oplossing (NHS-Biotine opgelost in dimethylsulfoxide, DMSO) vers bereid, tot de bacteriële schorsing bereid in de vorige stap. Bijvoorbeeld, Verdun 5 mg NHS-Biotine in 0,5 mL steriele DMSO. Meng goed door pipetteren op en neer meermaals.</li>
	<li>Splitsen de mix in vijf buizen van 1,5 mL.</li>
	<li>Incubate gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) op een thermoblock met constante schudden bij 350 rpm.</li>
	<li>Centrifugeren buizen bij 15.000 x g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer in 1 mL steriele PBS, centrifuge op 15.000 x g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 twee meer tijden voor het verwijderen van de overtollige Biotine koppelen oplossing.</li>
	<li>Na de laatste wash, resuspendeer de pellet in 1 mL steriele PBS.</li>
	<li>Breng 100 µL van 10 mg/mL streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen oplossing in een buis 1,5 mL en laat het op de magnetische rek voor 5 min.</li>
	<li>Verwijder het oplosmiddel met een pipet, nemen de magnetische kralen oplossing daar-geconjugeerd uit de magnetische rek en resuspendeer het met 1 mL van biotine gecoat-bacteriële suspensie bereid in stap 2.7.</li>
	<li>Voor 1 h op RT op een thermoblock met constante schudden bij 350 rpm Incubate.</li>
	<li>Plaats van de oplossing op het magnetische rek; 5 min wachten en verwijder met een pipet van de bacteriën die niet op de wand houden (Houd het in een buis aangeduid als &#34; niet-gecoate bacteriën &#34;). De Fractie vast te houden aan de wand van de buis in contact met de magneet is de bacteriën Biotine/streptavidine-gecoate.</li>
	<li>Verwijderen van de buis met de gelabelde bacteriën uit de magnetische rek en resuspendeer in 1 mL steriele PBS.</li>
	<li>Plaats van het weer op de magnetische rek, 5 min wachten en gebruik een pipet voor het verwijderen van de PBS.</li>
	<li>Herhaal stappen 2.13 en 2.14 twee meer tijden om alle bacteriën die niet zijn bekleed met de streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen.</li>
	<li>Na de laatste wash, resuspendeer de gecoat-bacteriën in 500 µL van steriele PBS en label van de buis als &#34; gecoat bacteriën &#34;.</li>
	<li>Rekenen de kolonievormende eenheden (kve) van beide &#34; niet-gecoate bacteriën &#34; en &#34; bekleed bacteriën &#34; oplossingen door plating seriële verdunningen op BHI agar platen. Ongeveer 2 x 10 8 cfu/mL gecoat-bacteriën worden verkregen van 20 mL van eerste bacteriële suspensie met OD 600 voor 1.0. De gecoate-bacteriële suspensie houden bij 4 ° C tot de volgende dag worden gebruikt voor het infecteren van macrofagen.</li>
</ol> 3. Infectie van BDMDs <ol><li>op dezelfde dag als de bacteriën zijn bekleed met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen, plaat volledig de gedifferentieerde BMDMs 22 in 6 cm schotels bij een dichtheid van 5 x 10 6 cellen per schotel.</li>
	<li>Op de volgende dag, centrifugeer de gecoat-bacteriële schorsing bij 15.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) met een concentratie van 10 x 10 6 cfu/mL.</li>
	<li>Te infecteren macrofagen op een veelheid van infectie (MOI) van 10, verwijder het medium van de BMDMs en voeg 5 mL van gecoat-bacteriële suspensie bereid. Optimale MOI kan worden beoordeeld voor elke celtype of experimentele doeleinden van de geïsoleerde phagosomes.</li>
	<li>Incubate op RT gedurende 10 minuten om te synchroniseren van fagocytose.</li>
	<li>Incubate bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator voor 30 min tot fagocytose. Andere celtypes kunnen vereisen verschillende incubatie keer om internalisering van de bacteriën.</li>
	<li>Verwijderen de bacteriën-bevattende medium van de schotels en spoel de cellen met RPMI driemaal te verwijderen bacteriën niet-geïnternaliseerd.</li>
	<li>Ten slotte voeg 10 mL van RPMI met 10% FBS en 50 µg Mo/mL gentamycine te doden alle bacteriën niet-phagocytized.</li>
	<li>Broeden de besmette BMDMs bij 37 ° C met 5% CO 2, totdat de gewenste tijd wijs. De gewenste tijdstip moet experimenteel worden bepaald volgens de bacteriën en celtype gebruikt en het doel van de analyse. Voor de studie van de vroege gebeurtenissen van de fusie van de phagosome-endosome in S. Typhimurium besmette BMDMs, een 30 min incubatie wordt aanbevolen. Voor de analyse van latere gebeurtenissen, kan phagosomes na 2 uur of 4 uur incubatie worden geëxtraheerd. Langdurige incubatie van macrofagen met S. Typhimurium dan 24u resulteert in de dood van de macrofagen. Uitgebreid intracellulaire infectie voordat de phagosome extractie waarschijnlijk tot afbraak van biotine moleculen leiden kan. Echter hebben we niet waarnemen verlies van biotine op gecoat-bacteriën tot 24 h.</li>
</ol> 4. Isolatie van S. typhimurium-met Phagosomes <ol><li>voorbereiden de omvang van de vereiste phagosome isolatie buffer een (50 mM buizen, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) door toevoeging van dithiothreitol (DTT) aan een eindconcentratie van 1 mM, Cytochalasin B voor een finale concentratie van 10 µM, en protease en phosphatase inhibitors als door de fabrikant aanbevolen. 
	Opmerking: DTT en Cytochalasin B moeten worden toegevoegd aan de phagosome isolatie buffer A altijd onmiddellijk voordat gebruiken. Cytochalasin B verstoort het cytoskelet, vergemakkelijking van de breuk van de celmembraan.</li>
	<li>Op het gewenste tijdstip wijs, verwijder het medium van de geïnfecteerde cellen en wassen met steriel PBS opgewarmd op RT.</li>
	<li>Toevoegen 750 µL van phagosome isolatie A buffer per schotel en incubeer 20 min op ijs. Wanneer u verschillende cel nummers, de hoeveelheid isolatie buffer A proportioneel moet worden aangepast.</li>
	<li>Voeg toe 250 µL van phagosome isolatie buffer B (50 mM buizen, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol en 68 mM sacharose). Rock de plaat om ervoor te zorgen dat de buffer het volledige oppervlak van de schotel bereikt. Wanneer u verschillende cel nummers, de hoeveelheid isolatie buffer B proportioneel moet worden aangepast.</li>
	<li>Verwijderen van de cellen van de schotel door voorzichtig afschrapen met behulp van een rubberen politieagent en hen overbrengen in een tube pre gekoeld 1,5 mL.</li>
	<li>Wordt de celsuspensie passeren door een 26G naald met behulp van een injectiespuit 1 mL minstens 15 keer (één aspiratie plus één uitwerpen van de graven van de opschorting van de cel als één keer). Dit is voldoende om de cytosolische inhoud van BMDMs vrij te geven. Het aantal passeert de naald moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype.</li>
	<li>Plaats van de celsuspensie op het magnetische rek en 5 min wachten. De deeltjes die zijn gekoppeld aan de magneet zijn de phagosomes met gecoate - S. Typhimurium. De schorsing de rest van de cellulaire componenten bevat.</li>
	<li>Spoel de suspensie in een tube van 1,5 mL aangeduid als &#34; cytosol &#34;.</li>
	<li>De buis met de geïsoleerde phagosomes verwijderen uit het magnetische rek en resuspendeer hen in 1 mL steriele PBS.</li>
	<li>Plaats van de opschorting van de phagosome op de magnetische rek, 5 min wachten en verwijderen van de PBS.</li>
	Herhaal stap 4.9 en 4.10 te wassen van de geïsoleerde S. <li> typhimurium-bevattende phagosomes.</li>
	<li>Ten slotte Verwijder de PBS en resuspendeer de phagosomes in de vereiste buffer, bijvoorbeeld in een radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer voor eiwit analyse. Ongeveer 50-200 µg eiwit wordt verkregen per monster volgens dit protocol, afhankelijk van het aanvankelijke bedrag van cellen en de MOI van infectie.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758(2008).</li>
<li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+ATPases%3A+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li>
<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes%3A+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+Compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li>
<li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+A+few+bugs+in+the+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li>
<li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+cathepsins%3A+From+structure%2C+function+and+regulation+to+new+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Proteins+Proteom%22%5BJournal%5D)">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li>
<li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://serials.unibo.it/cgi-ser/start/en/spogli/df-s.tcl?prog_art=5883500">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li>
<li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li>
<li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li>
<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li>
<li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li>
<li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella%3A+A+model+for+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li>
<li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li>
<li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li>
<li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells%3A+fluorescence+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li>
<li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+phagosomal+proteomes%3A+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li>
<li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li>
<li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een nieuwe methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen wordt hier beschreven. Na de zachte verstoring van het celmembraan, kunnen bacteriën-bevattende phagosomes worden gemakkelijk gewonnen met behulp van een magnetische rek. We laten zien dat etikettering van de bacteriën de capaciteit van het pathogene agens oplevert behoudt voor het opwekken van ontsteking en niets aan de fagocytische eigenschap van de...

Macrofagen circuleren gespecialiseerde fagocytische cellen die detecteren, verzwelgen en degraderen van een buitenlandse deeltje in perifere weefsels, variërend van apoptotic cellen tot invasie van micro-organismen zoals bacteriën aanwezig. Oppervlakte receptor-gemedieerde erkenning van pathogen specifieke markers vaak aanwezig op het oppervlak van micro-organismen (bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen of PAMPs) leidt macrofagen een complexe reorganisatie van cellulaire membraan in om te omringen en phagocytize van de pathogeen-1.
Het overspoeld pathogeen is vervolgens opgenomen door de macrofaag in een intracellulair vesikel bekend als phagosome. Door een reeks van kernfusie en kernsplijting evenementen met andere blaasjes zoals Endosomen en lysosomes verwerft de pathogeen-bevattende phagosome een reeks eiwitten die nodig zijn voor de afschaffing van de phagosomal inhoud. Daarom is de enzymatische samenstelling van de phagosome in de loop van dit proces, bekend als phagosome rijping2zeer variabel.
Kort na de fagocytose, de multimeric complexe vacuolar ATPase (v-ATPase) is opgenomen in het phagosome-membraan door fusie met Endosomen3. Dit complex maakt gebruik van ATP aan pomp protonen uit het cytosol naar het lumen van het phagosome4. Verzuring van de phagosome is essentieel voor de gebeurtenissen van de fusie met andere blaasjes5 en voor de activatie van een groot aantal pH-afhankelijke afbraakroutes enzymen6. Een ander multimeric enzymatische complex dat is snel gemonteerd op het phagosome-membraan is het complex van NADPH-oxidase (NOX). NOX complexe oxideert NADPH om te produceren van reactieve zuurstof soorten (ROS) die worden uitgescheiden in de phagosome lumen en die aanzienlijk bijdragen tot het doden van de overspoeld micro-organismen7.
Tijdens de eerste stappen van rijping presenteren phagosomes markeringen typisch zoals Rab5 en Rab7 van vroege en late Endosomen respectievelijk samen met de subeenheid0 V van de v-ATPase-8. Fusie van phagosomes met lysosomen en laat Endosomen resulteert in de blootstelling van de phagocytized pathogen aan een breed scala aan hydrolytische enzymen zoals β-galactosidase9cathepsin proteasen en lipasen. Verzuring van de lumen is ook vereist voor de activering van deze enzymen. Bijvoorbeeld, is het splijten van cathepsin D voor de productie van de actieve korte vorm pH-afhankelijke10. Deze enzymen degraderen van het pathogene agens en bemiddelen van de productie van pathogen afkomstige korte peptides, die door de macrofaag grote histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen naar T cellen activeren een adaptieve immuunrespons11gepresenteerd.
Vandaar, phagosome rijping is cruciaal voor de aangeboren immuunrespons en verbindt de aangeboren en adaptieve takken van het immuunsysteem. Het is geen verrassing dat de ziekteverwekkers geëvolueerd zijn strategieën om te overwinnen afschaffing door macrofagen door het hierboven beschreven proces van rijping van de phagosome. Bijvoorbeeld de intracellulaire bacteriën Mycobacterium tuberculosis en Legionella pneumophila voorkomen dat phagosome rijping remmende v-ATPase vergadering en daaruit voortvloeiende lumen verzuring met12,13 . Andere bacteriën, zoals Listeria monocytogenes of Shigella flexneri induceren porie vorming in het membraan van de phagosome te ontsnappen naar het cytosol14,15. Aan de andere kant, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is het kundig voor wijzigen van de eigenschappen van de phagosome binnen de vacuole om te zetten in een geschikte locatie voor de replicatie-16. Dit vermogen maakt S. typhimurium een zeer interessant model te bestuderen van de pathogeen-gemedieerde inmenging van phagosome rijping.
S. typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. Typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en deel uitmaakt van phagosomes17. Sommige rapporten hebben eerder beschreven dat S. typhimurium-met phagosomes presenteren makers voor zowel Endosomen als lysosomen18, en andere studies hebben gevonden phagosome-lysosoom fusion voorkomen op S. Typhimurium infectie19.
In eerste instantie phagosome rijping op S. typhimurium infectie is onderzocht door immunofluorescentie microscopie. De ontwikkeling van technieken voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes ingeschakeld een nauwkeuriger onderzoek van de inhoud van de phagosome in termen van endosome en lysosoom markers. Tot op heden, de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes is de subcellular fractionering op sacharose stap verlopen18,20. Deze methode vereist echter meerdere centrifugeren stappen die kunnen leiden tot mechanische schade aan phagosomes, kunnen invloed hebben op de stabiliteit van de phagosomal componenten (eiwitten en lipiden) en tijdrovend is. Bovendien, het vereist het gebruik van een ultracentrifuge: een stuk van gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk zijn voor elke laboratorium.
Onlangs, een nieuwe aanpak is toegepast op de isolatie van bacteriële-bevattende phagosomes, waarin de bacteriële pathogenen worden aangeduid met biotinyleerd lipopetide (Lipobiotin) en later geëxtraheerd met behulp van streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen21 . Wij stellen een alternatieve complementaire methode door het labelen van bacteriële oppervlakte amine-bevattende macromoleculen met NHS-Biotine gevolgd door daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen zijn hoogverrijkt in endosome en lysosoom markers en kunnen worden gebruikt voor een breed scala van tests, uit eiwit analyse omics analyse. Bovendien, vereist het geen gespecialiseerde apparatuur zoals ultracentrifuges. Bovendien, door het elimineren van de stappen van centrifugeren, zowel de mechanische schade aan phagosomes en de hoeveelheid tijd werkzaam zijn aanzienlijk kleiner zijn. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de isolatie van de phagosomes met andere bacteriën, zoals de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, ook opgenomen in dit manuscript. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is een eenvoudige, kosteneffectieve, en minder tijdrovend dan het klassieke isolement door sacharose verrijkt verloop-ultracentrifugatie, waardoor zeer phagosomes bacteriën bevatten.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van salmonella typhimurium-met phagosomes van macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en in blaasjes bekend als phagosomes om te worden afgebroken. Isolatie van S. typhimurium-met phagosomes hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hoe S. typhimurium infectie verandert het proces van rijping van het phagosome ter voorkoming van bacteriële afbraak. Klassiek, het isolement van de bacteriën-bevattende phagosomes is verricht door sacharose kleurovergang centrifugeren. Dit proces is echter tijdrovend, en vereist gespecialiseerde apparatuur en een zekere mate van beweeglijkheid. Hier beschreven is een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine-daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen kunnen worden opgeschort in een buffer van keuze, waardoor het gebruik van geïsoleerde phagosomes voor een breed scala van tests, zoals eiwitten, metaboliet, en lipide-analyse. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is specifiek, efficiënte, snelle, vereist minimale apparatuur en is veelzijdiger dan de klassieke methode van isolatie door sacharose verloop-ultracentrifugatie.

Isolatie van bacteriën-bevattende phagosomes door dit protocol vereist de biotinylation van de bacteriën als een eerste stap. We daarom beoordeeld de effectiviteit van S. typhimurium biotinylation door analyse van de confocal microscopie van BMDMs geïnfecteerd met biotinyleerd mCherry -S. typhimurium aangeduid met Cy5-daar. Kort, BMDMs waren besmet, zoals beschreven in dit protocol met mCherry -S. typhimurium eerder biotinyleerd maar n...

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Het algemene doel van deze procedure is om intacte en verrijkte bacteriën die Phagosomes bevatten te isoleren. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van Immunologie te beantwoorden, zoals veranderingen in Phagosome-rijping en antigeenverwerking wanneer pathogene micro-organismen gastheercellen binnendringen. Het grote voordeel van de techniek is dat het hoge kwaliteit bacteriën produceert die Phagosomes bevatten met behulp van eenvoudige stappen en zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.Personen die nieuw zijn met de methode zullen het technisch toegankelijk vinden in vergelijking met de niet-methodologieën. We hadden eerst het idee om deze methode te ontwikkelen toen we de mechanismen bestudeerden waarmee intracellulaire pathogenen de Phagosomes voor hun voordeel gebruiken. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Saray Gutierrez, een post-doc uit mijn laboratorium.Om een Salmonella Typhimurium-cultuur te starten, gebruik een bacterie-lus om een enkele bacteriekolonie in 5 milliliter hersenhartinfusiebouillon te inoculeren. Bewaar vervolgens de suspensie in een 37 graden Celsius-incubator gedurende de nacht terwijl je schudt.

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Gutiérrez, S., et. al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the culturing and preparation of Salmonella typhimurium to obtain a clean, metabolically active bacterial suspension suitable for experimental use.

Preparation of Salmonella typhimurium Culture

Source: Sigal, N., et al. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the isolation of internalized pathogenic bacteria from infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Bacteria are allowed to attach to host cells, and unattached bacteria are washed away. After internalization, an antibiotic is added to eliminate non-internalized bacteria. The host cells are lysed, centrifuged, and the supernatant is...

Isolation of Intracellular Pathogenic Bacteria from Infected Host Cells

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin,...

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.

High-throughput Assay om Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

We beschrijven de kwantificering van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium in uit beenmerg afgeleide macrofagen met behulp van differentiële digitonine permeabilisatie.

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Bacteriofagen, alomtegenwoordig en divers op aarde, infecteren en vermenigvuldigen zich in bacteriële gastheren en spelen een cruciale rol in microbiële ecosystemen. Ondanks hun belang kan hun aanwezigheid industriële processen verstoren. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van bacteriële lipopolysacchariden om bacteriofagen uit Salmonellaculturen te elimineren.

Bacteriofaagverwijdering uit geïnfecteerde Salmonellaculturen

Leer een eenvoudige methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-bevattende fagosomen uit macrofagen met behulp van biotine en streptavidine. Deze techniek is toegankelijk voor beginnende onderzoekers.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Meer video's verkennen