Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Het algemene doel van deze procedure is om intacte en verrijkte bacteriën die Phagosomes bevatten te isoleren. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van Immunologie te beantwoorden, zoals veranderingen in Phagosome-rijping en antigeenverwerking wanneer pathogene micro-organismen gastheercellen binnendringen. Het grote voordeel van de techniek is dat het hoge kwaliteit bacteriën produceert die Phagosomes bevatten met behulp van eenvoudige stappen en zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.

Personen die nieuw zijn met de methode zullen het technisch toegankelijk vinden in vergelijking met de niet-methodologieën. We hadden eerst het idee om deze methode te ontwikkelen toen we de mechanismen bestudeerden waarmee intracellulaire pathogenen de Phagosomes voor hun voordeel gebruiken. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Saray Gutierrez, een post-doc uit mijn laboratorium.

Om een Salmonella Typhimurium-cultuur te starten, gebruik een bacterie-lus om een enkele bacteriekolonie in 5 milliliter hersenhartinfusiebouillon te inoculeren. Bewaar vervolgens de suspensie in een 37 graden Celsius-incubator gedurende de nacht terwijl je schudt. Breng de volgende dag een milliliter van deze bacteriesuspensie over in 19 milliliter BHI-bouillon in een conische kolf.

Bewaar opnieuw in een 37 graden Celsius-incubator terwijl je schudt. Wanneer de OD600 een bereikt, verwijder de kolf uit de incubator en breng de cultuur over in een 50 milliliter buis. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 15 minuten bij 5400 x G bij 4 graden Celsius.

Na het verwijderen van de supernatant, suspendeer het bacteriële pellet opnieuw in 10 milliliter steriele PBS. Na het herhalen van de centrifugatie eenmaal, suspendeer het pellet opnieuw in 4,9 milliliter PBS. Voeg vervolgens 100 microliters vers bereide Biotin-koppeloplossing toe aan de bacteriesuspensie.

Na het verdelen van deze suspensie in vijf 1,5 milliliter buisjes, incubeer in een thermische blok bij kamertemperatuur met constant schudden bij 350 tpm gedurende twee uur. Na het centrifugeren van de buisjes bij 15.000 x G bij kamertemperatuur gedurende tien minuten, gooi de supernatant weg. Na nog twee centrifugatiestapjes en volledige verwijdering van de Biotin-koppeloplossing, suspendeer deze Biotin-gecodeerde bacteriën opnieuw in een milliliter steriele PBS in een enkele 1,5 milliliter buis.

Breng 100 microliters streptavidin-geconjugeerde magnetische parelsoplossing over naar een verse 1,5 milliliter buis en plaats deze gedurende vijf minuten in een magnetisch rek. Na het verwijderen van het oplosmiddel uit de buis, verwijder de buis uit het magnetische rek. Suspendeer vervolgens de parels die in de buis achterbleven met een milliliter Biotin-gecodeerde bacteriesuspensie.

Incubeer de buis op een thermoblok bij kamertemperatuur gedurende een uur terwijl je schudt bij 350 tpm. Plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten op het magnetische rek. Gebruik een pipet om de bacteriën die niet aan de wand hebben gehecht te verwijderen en breng ze over naar een nieuwe buis gelabeld als niet-gecodeerde bacteriën.

De buis met magnetische parels die aan de wand hechten, bevat Biotin Streptavidine gecodeerde bacteriën. Verwijder de buis met Biotin Streptavidine gecodeerde bacteriën uit het magnetische rek en suspendeer deze opnieuw in een milliliter steriele PBS. Nadat de buis vijf minuten op het magnetische rek heeft gestaan, verwijder de PBS.

Suspendeer ten slotte de gewassen Biotin Streptavidine gecodeerde bacteriën in 500 microliters steriele PBS en label de buis als gecodeerde bacteriën. Op de dag voorafgaand aan de infectie, plateer volledig gedifferentieerde BMDM's in een zes centimeter schotel in RPMI's aangevuld met tien procent FBS. Breng de volgende dag de gecodeerde bacteriesuspensie gedurende vijf minuten bij 15.000 x G bij vier graden Celsius in een centrifuge.

Na het verwijderen van het supernatant, suspendeer het bacteriële pellet in RPMI-medium aangevuld met tien procent FBS. Verwijder het medium van de BMDM's en voeg vijf milliliter gecodeerde bacteriesuspensie toe in RPMI-medium om de cellen te infecteren. Om Phagocytose te synchroniseren, incubeer gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Om vervolgens Phagocytose te initiëren, incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een incubator met vijf procent Kooldioxide. Na de incubatie, verwijder het medium van de schalen en was de cellen drie keer bij RPMI om niet-geïnternaliseerde bacteriën te verwijderen. Om eventuele niet-fagocyteerde bacteriën te doden, gebruik tien milliliter RPMI bevattend tien procent FBS in 50 microgram per milliliter Gentamicin.

Incubeer tenslotte de geïnfecteerde BMDM's gedurende de gewenste tijdstip bij 37 graden Celsius in een incubator met vijf procent Kooldioxide. Bereid eerst het vereiste volume Phagosome Isolatiebuffer A voor door DTT en Cytochalasin B toe te voegen net voor gebruik en Protease en Fosfatase Remmers zoals aanbevolen door de fabrikant. Verwijder het medium van de geïnfecteerde cellen op het gewenste tijdstip en was de cellen met steriele PBS voorverwarmd tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 750 microliters Phagosome Isolatiebuffer A toe aan de schotel en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Vergeet niet om de plaat af en toe te schudden. Voeg vervolgens 250 microliters Phagosome Isolatiebuffer B toe en schudden vervolgens de platen om ervoor te zorgen dat de buffer het oppervlak volledig bedekt.

Schraap voorzichtig de cellen met een rubberen politieman om de cellen van de schotel te verwijderen en breng ze over naar een voorgekoelde 1,5 milliliter buis. Gebruik vervolgens een 1 milliliter spuit om de celsuspensie minstens 15 keer door een 26-gauge naald te laten gaan. Plaats vervolgens de celsuspensie gedurende vijf minuten op het magnetische rek.

Deeltjes die aan de magnetische parels zijn gehecht, zijn Phagosomes die gecodeerde S.Typhimurium bevatten. Breng vervolgens de suspensie die de rest van de cellulaire componenten bevat over naar een