Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

Het algemene doel van deze procedure is om NK- of T-cellijnen te verkrijgen van CAEBV-patiënten, wat van groot belang is voor onderzoek naar deze dodelijke ziekte. Deze methode helpt om NK- of T-cellijnen te verkrijgen voor onderzoek naar de mechanismen van CAEBV, zoals het bestuderen van de ruwe VBV op celproliferatie, het screenen van remmers die de NK/T-celproliferatie verstoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer eenvoudige en efficiënte methode is die slechts een kleine hoeveelheid perifeer bloed en een lage dosis ijzer twee vereist om NK- of T-cellijnen van CAEBV-patiënten te vestigen.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat de celoverleving in de eerste twee weken van de cultuur onzeker is en deze methode zal u leren hoe u de celproliferatie van de vroege cultuur kunt bepalen. Toen we voor het eerst het idee voor deze methode hadden, ontdekten we dat menselijk serumijzer twee PBMC gedurende maximaal twee weken kan bevatten. We lieten een demonstratie van deze methode zien, omdat het de vorm van de cellen en de oorzaak van proliferatie laat zien.

En dat uitbreiding van cellen en nummering van de Y-bar cellen Om deze procedure te beginnen, zuivert u primaire PBMC uit twee milliliter vol bloed van CAEBV-patiënten door middel van gradiëntcentrifugering. Als alternatief kunt u cryo-geconserveerd PBMC ontdooien uit vloeibare stikstof met RPMI-1640-medium. Voeg vervolgens twee microliter 0,4% trypanblauw toe aan 18 microliter celsuspensie om de cellen drie minuten te kleuren en breng vervolgens de suspensie over naar de celtellerplaat en meet de celconcentratie en levensvatbaarheid met een geautomatiseerde celteller.

Bereid de celsuspensie voor op een dichtheid van twee tot drie keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter, aangevuld met compleet RPMI-1640-kweekmedium dat 20% menselijk serum, twee millimolair L-glutamine en antibiotica bevat. Zaai vervolgens één milliliter PBMC-suspensie per putje in de 24-wells celkweekplaten. Voeg vervolgens 150 eenheden per milliliter rhIL-2 toe aan elke put.

Plaats de kweekplaten in een 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Observeer op dag twee de celmorfologie onder een microscoop bij 200-voudige vergroting. Cellen zijn in goede conditie wanneer ze helder en rond zijn.

In deze stap voegt u twee microliter 0,4% trypanblauw toe aan 18 microliter celsuspensie en berekent u de celconcentratie. Observeer vervolgens de celmorfologie en bewaak de conditie van celgroei door de cellen te nummeren voordat het medium wordt ververst. Het is belangrijk om de celmorfologie en de conditie te bewaken.

We kunnen beoordelen of de cellen overleven aan de hand van de polymorfe cellen en de conditie van de cellen in het vroege stadium van een cultuur. Vervolgens verwijdert u 500 microliter medium uit elke put van de 24-wellsplaat en voegt u 500 microliter vers compleet kweekmedium toe. Voeg vervolgens 150 eenheden per milliliter rhIL-2 toe aan elke put.

Ververs het medium twee keer per week. Plot de celgroeicurve. Wanneer de levensvatbare celconcentratie vijf keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter overschrijdt, verdeelt u cellen in nieuwe putjes met een concentratie van één tot twee keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter in elke put.

Dit proces duurt twee tot vier weken. Wanneer de cellen zijn uitgebreid, verzamelt u een keer 10-tot-de-zesde cellen om de fenotypen van de cellijnen te bepalen. Centrifugeer ze bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de NKNT-cellen te laten bezinken.

Gooi daarna de supernatant weg, was de neerslag door zeven milliliter PBS toe te voegen. Centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 240 keer g bij kamertemperatuur. Herhaal de procedure nogmaals, voeg vervolgens 200 microliter humaan serum toe aan elke buis, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in een keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter met koud PBSA. Verdeel vervolgens de cellen in vijf buizen, elk met twee keer 10-tot-de-vijfde cellen. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw met PBSA-buffer of PBSA bevattende 10 microliter PE en 10 microliter FITC-gelabelde antilichamen om celreceptoren van T- of NK-cellen op ijs te kleuren.

Cellen gesuspendeerd met PBSA-buffer worden gebruikt als negatieve controle. Incubeer vervolgens de cellen met antilichamen gedurende 20 tot 30 minuten op ijs in het donker. Was de cellen twee keer met koud PBSA en suspendeer de cellen opnieuw met 300 microliter koud PBSA voor de analyse met de flowcytometer.

Wanneer de celfenotypeanalyse is voltooid, verwijdert u voorzichtig de helft van de supernatant en vermijdt u contact met de cellen op de bodem van de plaat. Voeg hetzelfde volume vers kweekmedium met rhIL-2 bij 300 eenheden per milliliter toe aan de platen, vervolgens ververst u de helft van het medium elke drie dagen totdat de celclusters duidelijk zichtbaar zijn onder de microscoop. Daarna brengt u de cellen over van de 24-wellsplaten naar T-25 kweekkolven na het mengen van verschillende putjes van dezelfde lijn.

Verdubbel het volume van het kweekmedium naarmate het geel wordt totdat het volume van het medium uitbreidt tot 10 tot 15 milliliter. Voeg vervolgens rhIL-2 toe met een concentratie van 150 eenheden per milliliter. Ververs het medium 24 uur voor het invriezen na twee tot drie weken groeien, wanneer de celmassa met het blote oog kan worden waargenomen.

Meet de celconcentratie met de cel