Name: Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer een eenvoudige methode om NK- en T-cellijnen te verkrijgen van patiënten met chronische actieve Epstein-Barr virusinfectie met minimale hoeveelheden bloed en lage IL-2 dosering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de sleutel projecten van Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategische biologische middelen technologie steunregeling van Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1 en ZSSB-004) en door subsidies van de National Science Foundation of China) 81401640) en Shanghai natuurwetenschappen Fonds (14ZR1434800).

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Instituut voor genetica en ontwikkelingsbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen, en het protocol volgt de institutionele richtsnoeren voor menselijk welzijn.
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de werkstroom.
1. isolatie van in PBMC van CAEBV patiënten
<ol><li>Zuiveren van primaire PBMC van 2 mL van de volbloed van CAEBV patiënten door verloop (bijvoorbeelddensiteitgradiënt-plaque) centrifugeren na instructies van de fabrikant. Als alternatief, ontdooi cryopreserved PBMC van vloeibare stikstof met RPMI 1640 medium.</li>
	<li>Voeg 2 µL van trypan blauw (0,4%) naar 18 µL celsuspensie, 3 min wachten om vlekken van cellen, spoel de suspensie op de plaat van de teller cel en meten van de concentratie en de levensvatbaarheid met een geautomatiseerde cel teller de cellen.</li>
	<li>Voorbereiden van de celsuspensie bij een dichtheid van 2-3 × 106 cellen/mL aangevuld met volledige RPMI 1640-kweekmedium dat 20% menselijk serum (warmte geïnactiveerd bij 56 ° C), 2 mM L-glutamine, en antibiotica (100 µg/mL streptomycine, 100 U/mL penicilline). Zaad 1 mL PBMC schorsing per putje in 24-well cel cultuur platen.</li>
	<li>Voeg 150 U rhIL-2 per putje.</li>
	<li>Plaats de platen van de cultuur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>Op dag 2, het observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting); cellen zijn in goede conditie wanneer ze licht en ronde zijn.</li>
</ol>2. uitbreiding van de cellen en de nummering van de levensvatbare cellen
<ol><li>Observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting) en de voorwaarde van celgroei controleren door de nummering van de cellen voordat u wijzigt medium: 2 µL van trypan blauw (0,4%) aan 18 µL celsuspensie toevoegen en bereken de concentratie de cellen (zie 1.2, Figuur 2).</li>
	<li>Verwijderen van 500 µL van het medium in een 24-well-plate, en toevoegen van 500 µL verse volledige kweekmedium. 150U rhIL-2 per putje toevoegen.</li>
	<li>Wijzig het medium twee keer per week zoals in stap 2.2.</li>
	<li>Trekken de cel groeicurve (Figuur 3).</li>
	<li>Wanneer de levensvatbare cellen concentratie groter is dan 5 × 10-6/mL, verdeel cellen in nieuwe putten met een concentratie van 1-2 × 10-6 cellen/mL in elk putje. Dit proces duurt 2-4 weken.</li>
</ol>3. cel fenotypering door Stroom Cytometry
<ol><li>Wanneer cellen hebben uitgebreid, verzamelen van 1 × 10-6 cellen om te bepalen van de fenotypen van cellijnen. Centrifugeer bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur cellen (NK/T cellen neerslaat op de onderkant van de buis).</li>
	<li>Verwijder het supernatant, wassen van de neerslag door 7 mL PBS toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 240 x g bij kamertemperatuur. Eenmaal herhaald.</li>
	<li>200 µL menselijk serum toevoegen aan elke buis, meng goed en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij 1 × 10-6/mL met koude PBSA (PBS+0.2%BSA). Verdeel cellen in 5 buizen, elke buis met 2 × 105 cellen.</li>
	<li>Centrifuge cellen bij 240 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met PBSA buffer of PBSA met 10 µL PE (of PE-Cy7) en 10 µL FITC label antilichamen om vlekken van cel receptoren van T of NK cellen op ijs, zoals is aangegeven in Figuur 4. Cellen met PBSA buffer geschorst worden gebruikt als een negatieve controle.</li>
	<li>Incubeer de cellen met antilichamen voor 20-30 min op ijs in het donker.</li>
	<li>Wassen van de cellen tweemaal met koude PBSA, resuspendeer de cellen met 300 µL koude PBSA.</li>
	<li>Analyseer het fenotype van de cel met een cytometer van de stroom.<ol>
<li>De Flow Cytometer in 'Werkblad maken' voorwaarde instellen. De experimentele sjabloon met een dot-perceel waarin vooruit scatter (FSC) versus kant scatter (SSC) instellen.</li>
		<li>Laad de isotype controle buis voor het optimaliseren van de FSC en SSC spanningen, en optimaliseren van de FSC-drempelwaarde te elimineren puin zonder zich te mengen met de bevolking van de cel van belang. Verwijder alle parameters staan, behalve de FSC, WS, FITC, PE en PE-Cy7.</li>
		<li>Compensatie met behulp van het besturingselement isotype en een enkele positieve controle in elke groep 2-kleur analyse uit te voeren.</li>
		<li>Laden van monsters en maak HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 en CD3 VS CD16 dot plots tonen verschillende bevolking van cellen. Opmerking: PBMC werden gebruikt voor het uitvoeren van compensatie met behulp van het negatief/isotype-besturingselement en de enkele positieve controle. 2-kleur immunofluorescentie met stroom cytometer werd routinematig gebruikt voor het analyseren van de expressie van oppervlakte markers. De volgende antistoffen zijn inbegrepen: anti-HLA-DR, anti-CD4 anti-CD16 geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 geconjugeerd met phycoerythrin (PE) en anti-CD19 geconjugeerd met PE-Cy7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. uitbreiding en cryopreservatie van NK/T cellen
<ol><li>Het medium veranderen nadat de cel fenotype analyse is voltooid. Verwijder de helft van het supernatans dat voorzichtig en raak de cellen aan de onderkant van de plaat. Voeg een gelijk volume verse kweekmedium dat 300 U/mL rhIL-2 aan de platen van de cel.</li>
	<li>De helft van het medium wijzigen om de 3 dagen (als 2.2) tot de cel clusters zijn duidelijk zichtbaar onder de Microscoop (Figuur 2). Dit proces duurt doorgaans 2-3 weken.</li>
	<li>Overbrengen in de cellen van 24-Wells-platen T25 cultuur kolven na het mengen van verschillende putjes van de dezelfde bloedlijn. Verdubbel de hoeveelheid kweekmedium het gele blijkt tot het volume van het medium breidt uit naar 10-15 mL. RhIL-2 met de concentratie van 150 U/mL toevoegen.</li>
	<li>Middellange 24u wijzigen voordat u bevriezing na 2-3 weken groeien, wanneer de cel massa met het blote oog kan worden waargenomen. Maatregel cel concentratie met een teller van de cel.</li>
	<li>De celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g centrifugeren en resuspendeer de pellet cel bij een dichtheid van 5-10 x 106 cellen/mL met de bevroren stockoplossing waarin foetale runderserum 90% en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Bevriezen met een snelheid van 1 ° C per min tot-80 ° C en breng direct in vloeibare stikstof.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
<li>Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronic+mononucleosis+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The chronic mononucleosis syndrome.</a> J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphomas+containing+Epstein-Barr+viral+DNA+in+patients+with+chronic+Epstein-Barr+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections.</a> N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).</li>
<li>Kikuta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+genome-positive+T+lymphocytes+in+a+boy+with+chronic+active+EBV+infection+associated+with+Kawasaki-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease.</a> Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
<li>Tabata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroa+vacciniforme-like+lymphomatoid+papulosis+in+a+Japanese+child%3A+a+new+subset%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset.</a> J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).</li>
<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. en X.C. zijn mede-uitvinders op in afwachting van octrooi-aanvragen die betrekking hebben op mogelijke toepassingen van deze methode voor de vaststelling van NK/T cellijnen en de cellijnen gevestigd in deze studie. D.Z., X.Z. en X.C. verklaren geen concurrerende financiële belangen bij dit werk. De resterende auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit protocol, heeft een nieuwe techniek voor de vaststelling van NK/T cellijnen van volbloed van CAEBV patiënten ontwikkeld. Vergeleken met de bestaande methoden, is het grote voordeel van deze methode zijn eenvoud en zijn eis van slechts een kleine hoeveelheid bloed, terwijl het vertoont een hoog slagingspercentage en goede voorwaarden voor de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien kunnen NK/T cellijnen worden vastgesteld door het kweken van PBMC zonder eerst te controleren de celtypes het EBV latent geïnfecteerd...

Epstein - Barr virus (EBV) is alomtegenwoordig en infecteert niet alleen B-cellen, maar ook T en natural killer (NK) cellen, waardoor een aantal EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten (LPD) en lymfoom/leukemie, zoals EBV-geassocieerde hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-achtige lymfoom, extranodal NK/T-cel lymfoom, nasale type en agressieve NK-cel leukemie1,2,3. Daaronder is ernstige chronische actieve EBV (SCAEBV) ziekte, die vooral in Oost-Azië incident, en die wordt nu beschouwd als een LPD veroorzaakt door klonen expansie van EBV-geïnfecteerde T of NK cellen4,5,6, 7, maar zonder de schijnbare immunodeficiëntie presenteren in klierkoorts (IM)-als symptomen waaronder koorts, hepatosplenomegaly, lymfadenopathie en lever dysfunctie aanhoudend of productlevering, evenals hoge EBV-DNA laden de perifeer bloed8,9. Patiënten met CAEBV hebben een slechte prognose10,11, en de pathogenese en de rol van de EBV is onduidelijk. Daarom, cellijnen afgeleid van EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten en lymfomen zijn zeer behulpzaam als cel modellen voor verduidelijking van het mechanisme van EBV NK of T-cel proliferatie en haar relatie met een hoge incidentie van leukemie geïnduceerde of lymfoom.
Tot op heden zijn verschillende cellijnen opgericht met verschillende technieken12,13,14,15,16. Een menselijke NK cellijn, NK-YS, ontstond uit de NK-cel lymfoom/leukemie, door samen met een muis stromale cellijn kweken als feeder, en in aanwezigheid van rhIL-2 bij een concentratie van 20U per mL15. KAI3 was een andere NK cellijn opgericht met ingang van patiënten met een ernstige mug allergie of SCAEBV met autologe lymphoblastoid cellijn (LCL), B-cellen getransformeerd door EBV, als feeder cellen en toevoeging van rhIL-2 at 100U/mL16. SNK6 en SNT8 werden afgeleid van tumor weefsels van nasale NK/T-cel lymfoom patiënten door toevoeging van hoge dosis van rhIL-2 (700U/mL)12. Met soortgelijke techniek was de SNK-1 cel van CAEBV patiënten, gekweekt uit PBMC door verwijderen van T-cellen en het toevoegen van 700U/mL van rhIL-213,17. SNT13 en SNT15 werden opgericht door CD4 +- en CD8 + cellen18te verwijderen. Tot nu toe, werden andere T-cel en NK cellijnen van EBV-NK/T LPD patiënten alle ontwikkeld met deze methode19.
De nadelen van de hierboven genoemde bestaande methoden omvatten de tewerkstelling van feeder cellen, de eis van een hoge dosis IL-2, of het gebruik van maar liefst 10 mL bloed, de zuivering van NK/T-cellen, die is een grote uitdaging in de kliniek worden de noodzaak om te verifiëren welke soorten cel dat EBV latent infecteert vóór begin aan cultuur. Zoals CAEBV treedt vooral op bij kinderen in Azië, is 10 mL bloed niet makkelijk te verwerven in alle regio's. In deze studie ontwikkelden we een nieuwe eenvoudige methode met een hoog slagingspercentage om NK en/of T cel lijnen door PBMC kweken van CAEBV patiënten met een lage dosis van rhIL2 en een volume van 2 mL van volbloed zonder feeder cellen. De resultaten van deze methode gebleken zijn hoge efficiëntie en tijdwinst.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td>560944</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>antilichaam voor FACS</td></tr><tr><td>human IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>human serum</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Centrifugatie</td></tr><tr><td>microscope</td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerde celteller</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>24 wel celkweekcluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polystyreen platen</td></tr><tr><td>25cm2 celkweekfles</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polystyreen</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Component van celmedium</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>life</td><td>22400089</td><td>Voor celmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Component van celmedium</td></tr><tr><td>100 x streptomycine penicilline oplossing BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Component van celmedium</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Voor in vitro isolatie van lymfocyten</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Voor het invriezen van cellen</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva software</td><td>FACS analyse</td></tr></tbody></table>

een efficiënte en eenvoudige methode om de nk- en t cellijnen van patiënten met chronische actieve epstein - barr virusinfectie

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Een aantal methoden zijn beschreven om NK/T cellijnen van patiënten met lymfoom of proliferatieve syndroom geweest. Deze methoden die feeder cellen, gezuiverde NK of T cellen met maar liefst 10 mL bloed of een hoge dosis van IL-2. Deze studie presenteert een nieuwe methode met een krachtige en eenvoudige strategie om NK en T cel lijnen door het kweken van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met de toevoeging van recombinante menselijke IL-2 (rhIL-2), en zo weinig als 2 mL bloed gebruikt. De cellen kunnen verspreiden snel in twee weken en worden gehandhaafd voor meer dan 3 maanden. Met deze methode 7 NK of T cel lijnen gelegd met een hoog slagingspercentage. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar, en die van toepassing zijn tot het vaststellen van cellijnen van meer gevallen van CAEBV of NK/T-cel lymfoom.

Na 3 dagen cultuur tijdens de totstandbrenging van cellijnen, wordt de polymorfe cellen beginnen te verschijnen (Figuur 2). Na 7 dagen groeien cellen snel, zoals het aantal en de levensvatbaarheid van cellen worden verhoogd met een hoge snelheid (Figuur 3). Kleine clusters van cellen zijn duidelijk zichtbaar na 10-14 dagen groeien, wanneer de concentratie van de cel kan groter zijn dan 3-6 × 10-6. In deze periode, moet...

Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Het algemene doel van deze procedure is om NK- of T-cellijnen te verkrijgen van CAEBV-patiënten, wat van groot belang is voor onderzoek naar deze dodelijke ziekte. Deze methode helpt om NK- of T-cellijnen te verkrijgen voor onderzoek naar de mechanismen van CAEBV, zoals het bestuderen van de ruwe VBV op celproliferatie, het screenen van remmers die de NK/T-celproliferatie verstoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer eenvoudige en efficiënte methode is die slechts een kleine hoeveelheid perifeer bloed en een lage dosis ijzer twee vereist om NK- of T-cellijnen van CAEBV-patiënten te vestigen.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat de celoverleving in de eerste twee weken van de cultuur onzeker is en deze methode zal u leren hoe u de celproliferatie van de vroege cultuur kunt bepalen. Toen we voor het eerst het idee voor deze methode hadden, ontdekten we dat menselijk serumijzer twee PBMC gedurende maximaal twee weken kan bevatten. We lieten een demonstratie van deze methode zien, omdat het de vorm van de cellen en de oorzaak van proliferatie laat zien.En dat uitbreiding van cellen en nummering van de Y-bar cellen Om deze procedure te beginnen, zuivert u primaire PBMC uit twee milliliter vol bloed van CAEBV-patiënten door middel van gradiëntcentrifugering. Als alternatief kunt u cryo-geconserveerd PBMC ontdooien uit vloeibare stikstof met RPMI-1640-medium. Voeg vervolgens twee microliter 0,4% trypanblauw toe aan 18 microliter celsuspensie om de cellen drie minuten te kleuren en breng vervolgens de suspensie over naar de celtellerplaat en meet de celconcentratie en levensvatbaarheid met een geautomatiseerde celteller.Bereid de celsuspensie voor op een dichtheid van twee tot drie keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter, aangevuld met compleet RPMI-1640-kweekmedium dat 20% menselijk serum, twee millimolair L-glutamine en antibiotica bevat. Zaai vervolgens één milliliter PBMC-suspensie per putje in de 24-wells celkweekplaten. Voeg vervolgens 150 eenheden per milliliter rhIL-2 toe aan elke put.Plaats de kweekplaten in een 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Observeer op dag twee de celmorfologie onder een microscoop bij 200-voudige vergroting. Cellen zijn in goede conditie wanneer ze helder en rond zijn.In deze stap voegt u twee microliter 0,4% trypanblauw toe aan 18 microliter celsuspensie en berekent u de celconcentratie. Observeer vervolgens de celmorfologie en bewaak de conditie van celgroei door de cellen te nummeren voordat het medium wordt ververst. Het is belangrijk om de celmorfologie en de conditie te bewaken.We kunnen beoordelen of de cellen overleven aan de hand van de polymorfe cellen en de conditie van de cellen in het vroege stadium van een cultuur. Vervolgens verwijdert u 500 microliter medium uit elke put van de 24-wellsplaat en voegt u 500 microliter vers compleet kweekmedium toe. Voeg vervolgens 150 eenheden per milliliter rhIL-2 toe aan elke put.Ververs het medium twee keer per week. Plot de celgroeicurve. Wanneer de levensvatbare celconcentratie vijf keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter overschrijdt, verdeelt u cellen in nieuwe putjes met een concentratie van één tot twee keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter in elke put.Dit proces duurt twee tot vier weken. Wanneer de cellen zijn uitgebreid, verzamelt u een keer 10-tot-de-zesde cellen om de fenotypen van de cellijnen te bepalen. Centrifugeer ze bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de NKNT-cellen te laten bezinken.Gooi daarna de supernatant weg, was de neerslag door zeven milliliter PBS toe te voegen. Centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 240 keer g bij kamertemperatuur. Herhaal de procedure nogmaals, voeg vervolgens 200 microliter humaan serum toe aan elke buis, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in een keer 10-tot-de-zesde cellen per milliliter met koud PBSA. Verdeel vervolgens de cellen in vijf buizen, elk met twee keer 10-tot-de-vijfde cellen. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 240 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw met PBSA-buffer of PBSA bevattende 10 microliter PE en 10 microliter FITC-gelabelde antilichamen om celreceptoren van T- of NK-cellen op ijs te kleuren.Cellen gesuspendeerd met PBSA-buffer worden gebruikt als negatieve controle. Incubeer vervolgens de cellen met antilichamen gedurende 20 tot 30 minuten op ijs in het donker. Was de cellen twee keer met koud PBSA en suspendeer de cellen opnieuw met 300 microliter koud PBSA voor de analyse met de flowcytometer.Wanneer de celfenotypeanalyse is voltooid, verwijdert u voorzichtig de helft van de supernatant en vermijdt u contact met de cellen op de bodem van de plaat. Voeg hetzelfde volume vers kweekmedium met rhIL-2 bij 300 eenheden per milliliter toe aan de platen, vervolgens ververst u de helft van het medium elke drie dagen totdat de celclusters duidelijk zichtbaar zijn onder de microscoop. Daarna brengt u de cellen over van de 24-wellsplaten naar T-25 kweekkolven na het mengen van verschillende putjes van dezelfde lijn.Verdubbel het volume van het kweekmedium naarmate het geel wordt totdat het volume van het medium uitbreidt tot 10 tot 15 milliliter. Voeg vervolgens rhIL-2 toe met een concentratie van 150 eenheden per milliliter. Ververs het medium 24 uur voor het invriezen na twee tot drie weken groeien, wanneer de celmassa met het blote oog kan worden waargenomen.Meet de celconcentratie met de cel

an-efficient-simple-method-to-establish-nk-t-cell-lines-from-patients

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

We beschrijven een methode voor het genereren van getransformeerde B cellijnen met behulp van Epstein-Barr virus. We hebben ook illustreren een nieuwe test die kan identificeren B-cellen die zijn bestemd om de transformatie te ondergaan al drie dagen na de infectie.

Oprichting van Epstein-Barr Virus Growth-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi sarcoom (KS) is een tumor die is veroorzaakt door infectie met de oncogene virus Humaan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). De endothelial cell cultuur model hier beschreven is uniek geschikt voor de studie van de mechanismen waarmee KSHV gastheer cellen transformeert.

Een In Vitro Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus

Een eenvoudige rode bloedcel lysis methode voor het vaststellen van B-LCL werd ontwikkeld met hoge efficiency immortalisatie, die een kleine hoeveelheid bloed en tijdsbesparing van initiatie tot cryopreservatie.

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen die endogeen tot expressie komen in epstein barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en spierbiopsie afgeleide satellietcellen gedifferentieerd in myotubes.

Functionele karakterisering van endogene uitgedrukte menselijke RYR1-varianten

Hier presenteren we een methode om perifere bloed natural killer (PBNK), NK-cellen uit leverweefsels en chimere antigeenreceptor (CAR) -NK-cellen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) uit te breiden. Dit protocol demonstreert de uitbreiding van NK- en CAR-NK-cellen met behulp van 221-mIL-21-feedercellen naast de geoptimaliseerde zuiverheid van geëxpandeerde NK-cellen.

Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Dit protocol maakt de isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes uit de menselijke P3HR1-cellijn mogelijk bij het induceren van de virale lytische cyclus met phorbol 12-myristate 13-acetaat. DNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit het virale preparaat en onderworpen aan real-time PCR om de virale deeltjesconcentratie te kwantificeren.

Isolatie en kwantificering van epstein-barrvirus uit de P3HR1-cellijn

Leer een eenvoudige methode om NK- en T-cellijnen te verkrijgen van patiënten met chronische actieve Epstein-Barr virusinfectie met minimale hoeveelheden bloed en lage IL-2 dosering.

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

Meer video's verkennen