Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering
January 1st, 2018
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Het algemene doel van deze procedure is om een effectieve methode te demonstreren om muis-cochleae te decelluleren en te decalcificeren om een schaal voor inner ear weefselengineering toepassingen te gebruiken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de gehoor- en weefselengineering gebieden, zoals hoe 3D cochlea en verschillende componenten van de extracellulaire matrix stamceldifferentiatie beïnvloeden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeker in staat stelt te bestuderen hoe cellen rechtstreeks interageren met de extracellulaire matrix van de cochlea om sensorisch epitheel te vormen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de isolatie van het temporale bot en het cellenproefapparaat moeilijk correct te visualiseren kan zijn op basis van alleen tekstbeschrijvingen. Om deze procedure te beginnen, sneed de schedel in het midsagittale vlak met een scherp paar chirurgische schaar. Verwijder vervolgens het hersenweefsel van de schedel.
Identificeer vervolgens het temporale bot door de aanwezigheid van de gehoor- en vestibulaire zenuwwortels aan de binnenkant van de schedel en het gehoorkanaal vanaf de buitenkant. Snijd voorzichtig door de schedel om het temporale bot van de rest van de schedel te isoleren. Steek vervolgens de fijne forceps in de opening van het gehoorkanaal ongeveer vijf millimeter in, zodat de uiteinden de cochlea niet riskeren te doorboren.
Breek voorzichtig het bot van de bola open zodat het breekt. Gebruik fijne forceps om de rest van de bola van het temporale bot weg te prikken en het botlabyrint van de cochlea bloot te leggen. Dompel vervolgens het temporale bot in PBS met de ovale en ronde ramen van de cochlea omhoog.
Gebruik een ultrafijn paar forceps om de stapediale slagader te verwijderen die door de stapes gaat. Steek vervolgens een uiteinde van de ultrafijne forceps door de boog van de stapes waar de slagader doorheen gaat en til de stapes delicaat omhoog. Boor vervolgens de ovale en ronde ramen door.
Plaats vervolgens de buis die is verbonden met een met PBS gevulde 28,5 gauge spuit over het ovale venster. Profuseer twee millimeter 10%Antibiotic-Atimycotic en 10%Penicilline-Streptomycine in PBS gedurende vijf minuten door de cochlea om het perilymph te verwijderen. Verwijder vervolgens en gooi alle resterende spierweefsel en botfragmenten weg.
Voor decellulatie, trek met behulp van de transferpipet de cochlea voorzichtig omhoog in de pipet, zodat deze net de afgesneden rand met een paar millimeter passeert. Spuit vervolgens de cochlea in de met 1%SDS gevulde scintillatiefles. Circuleer twee milliliter 1%SDS in gedeïoniseerd water door de cochlea in de scintillatiefles met behulp van een transferpipet.
Plaats de scintillatiefles in een roterende en laat deze 72 uur bij kamertemperatuur draaien met 10RPM. Vervang elke 24 uur gedurende een periode van 72 uur door een verse 1%SDS oplossing en zorg ervoor dat de cochlea niet wordt blootgesteld aan lucht tijdens het vervangen van de oplossing. Was vervolgens de cochlea drie keer in dezelfde scintillatiefles gedurende 30 minuten elk in DI water.
In dit stadium zou de cochlea gedecelluleerd moeten zijn. Voor decalcificatie, verwijder het resterende DI water uit de scintillatiefles en laat er net genoeg over om de cochlea ondergedompeld te houden. Om decalcificatie te beginnen, voeg vijf milliliter 10%EDTA en DI water toe aan de scintillatiefles die de cochlea bevat.
Circuleer twee milliliter 10%EDTA in gedeïoniseerd water door de cochlea in de scintillatiefles met behulp van een transferpipet. Plaats de scintillatiefles terug in de roterende en laat de scintillatiefles 72 uur bij kamertemperatuur draaien met 10RPM. Vervang de 10%EDTA oplossing elke 24 uur gedurende een periode van 72 uur.
Wees voorzichtig bij het vervangen van oplossingen zodat de cochlea niet wordt blootgesteld aan de lucht. Spoel vervolgens de cochlea drie keer gedurende twee uur elk met PBS. In dit stadium zou de cochlea gedecalcificeerd moeten zijn.
Voordat cellen worden geïnfuseerd, begint u door gedecelluleerde en gedecalcificeerde cochlea gedurende minimaal een uur in een 5% koolstofdioxide, 37 graden Celsius celcultuur incubator te incuberen. Om de cochleae te profuseren, voeg vervolgens een druppel MSCGM toe aan elke cochlea om te voorkomen dat de cochlea uitdroogt. Breng ze over naar een nieuwe 24-well plaat met behulp van een transferpipet.
Richt de cochlea delicaat met ultrafijne forceps, zodat de ovale en ronde ramen omhoog wijzen. Gebruik vervolgens een steriele 28,5 gauge Insuline spuit met aangesloten buis om 0,2 milliliter van de re-gesuspendeerde Human Wharton's jelly cellen op te trekken. Plaats vervolgens de buis over het ovale venster met behulp van gesteriliseerde fijne forceps.
Profuseer delicaat en langzaam de cochlea met 0,2 milliliter van de re-gesuspendeerde Human Wharton's jelly cellen gedurende vijf minuten. Deze profuseringsstap is belangrijk. Succesvolle profusering van vloeistoffen door de cochlea heeft grote invloed op het resultaat van dit protocol.
Na profusering, voeg 0,8 milliliter 37 graden Celsius voorverwarmde MSCGM toe aan de put met cochlea om het totale volume op een milliliter te brengen. Herhaal de procedure voor elke cochlea. Gebruik elke keer een verse spuit en buis.
Plaats de geprofuseerde cochlea in een 37 graden Celsius celcultuur incubator en ververs het medium drie keer per week. Hier wordt de succesvolle decellulatie en decalcificatie van een muis cochlea zonder geïnjecteerde cellen getoond. Over het algemeen wordt de anatomie van de cochlea bewaard met holten achtergelaten zonder dappy kleuring.
Hier zijn de representatieve resultaten van succesvol gekweekte Human Wharton's jelly cellen op een cochlea schaal. Overvloedige dappy kleuring wordt waargenomen door de hele cochlea en op het buitenste botoppervlak. Nader onderzoek van individuele
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont een effectieve methode om muis-cochleae te decelluleren en te decalcificeren voor gebruik als scaffolds in weefsel engineering toepassingen. De techniek stelt onderzoekers in staat om de interactie tussen cellen en de cochleaire extracellulaire matrix te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de vorming van sensorisch epitheel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefsel Engineering
- Auditief Onderzoek
- Cellulaire Interacties
Achtergrond
- Decellulering en decalcificatie zijn essentieel voor het creëren van scaffolds.
- Het begrijpen van de cochleaire structuur is vitaal voor binnenooronderzoek.
- Stamceldifferenciatie wordt beïnvloed door de extracellulaire matrix.
- Visuele methoden verbeteren het begrip van complexe procedures.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te bieden voor de voorbereiding van cochleaire scaffolds.
- Om onderzoek naar cochleaire celinteracties te vergemakkelijken.
- Om kennis op het gebied van audiologie en weefsel engineering te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van het temporale bot van de schedel.
- Decellulering van cochleae.
- Decalcificatieproces voor scaffold voorbereiding.
- Visuele demonstratie van de procedure voor duidelijkheid.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle decellulering en decalcificatie van muis-cochleae.
- Verbeterd begrip van cel-extracellulaire matrix interacties.
- Verbeterde methoden voor het bestuderen van de vorming van sensorisch epitheel.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het procedurele begrip aanzienlijk.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor binnenooronderzoek.
- Het opent wegen voor het bestuderen van stamceldonatie in cochleaire scaffolds.
- Visuele demonstraties zijn cruciaal voor complexe biologische procedures.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
