Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering
1 januari 2018
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Het algemene doel van deze procedure is om een effectieve methode te demonstreren om muis-cochleae te decelluleren en te decalcificeren om een schaal voor inner ear weefselengineering toepassingen te gebruiken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de gehoor- en weefselengineering gebieden, zoals hoe 3D cochlea en verschillende componenten van de extracellulaire matrix stamceldifferentiatie beïnvloeden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeker in staat stelt te bestuderen hoe cellen rechtstreeks interageren met de extracellulaire matrix van de cochlea om sensorisch epitheel te vormen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de isolatie van het temporale bot en het cellenproefapparaat moeilijk correct te visualiseren kan zijn op basis van alleen tekstbeschrijvingen. Om deze procedure te beginnen, sneed de schedel in het midsagittale vlak met een scherp paar chirurgische schaar. Verwijder vervolgens het hersenweefsel van de schedel.
Identificeer vervolgens het temporale bot door de aanwezigheid van de gehoor- en vestibulaire zenuwwortels aan de binnenkant van de schedel en het gehoorkanaal vanaf de buitenkant. Snijd voorzichtig door de schedel om het temporale bot van de rest van de schedel te isoleren. Steek vervolgens de fijne forceps in de opening van het gehoorkanaal ongeveer vijf millimeter in, zodat de uiteinden de cochlea niet riskeren te doorboren.
Breek voorzichtig het bot van de bola open zodat het breekt. Gebruik fijne forceps om de rest van de bola van het temporale bot weg te prikken en het botlabyrint van de cochlea bloot te leggen. Dompel vervolgens het temporale bot in PBS met de ovale en ronde ramen van de cochlea omhoog.
Gebruik een ultrafijn paar forceps om de stapediale slagader te verwijderen die door de stapes gaat. Steek vervolgens een uiteinde van de ultrafijne forceps door de boog van de stapes waar de slagader doorheen gaat en til de stapes delicaat omhoog. Boor vervolgens de ovale en ronde ramen door.
Plaats vervolgens de buis die is verbonden met een met PBS gevulde 28,5 gauge spuit over het ovale venster. Profuseer twee millimeter 10%Antibiotic-Atimycotic en 10%Penicilline-Streptomycine in PBS gedurende vijf minuten door de cochlea om het perilymph te verwijderen. Verwijder vervolgens en gooi alle resterende spierweefsel en botfragmenten weg.
Voor decellulatie, trek met behulp van de transferpipet de cochlea voorzichtig omhoog in de pipet, zodat deze net de afgesneden rand met een paar millimeter passeert. Spuit vervolgens de cochlea in de met 1%SDS gevulde scintillatiefles. Circuleer twee milliliter 1%SDS in gedeïoniseerd water door de cochlea in de scintillatiefles met behulp van een transferpipet.
Plaats de scintillatiefles in een roterende en laat deze 72 uur bij kamertemperatuur draaien met 10RPM. Vervang elke 24 uur gedurende een periode van 72 uur door een verse 1%SDS oplossing en zorg ervoor dat de cochlea niet wordt blootgesteld aan lucht tijdens het vervangen van de oplossing. Was vervolgens de cochlea drie keer in dezelfde scintillatiefles gedurende 30 minuten elk in DI water.
In dit stadium zou de cochlea gedecelluleerd moeten zijn. Voor decalcificatie, verwijder het resterende DI water uit de scintillatiefles en laat er net genoeg over om de cochlea ondergedompeld te houden. Om decalcificatie te beginnen, voeg vijf milliliter 10%EDTA en DI water toe aan de scintillatiefles die de cochlea bevat.
Circuleer twee milliliter 10%EDTA in gedeïoniseerd water door de cochlea in de scintillatiefles met behulp van een transferpipet. Plaats de scintillatiefles terug in de roterende en laat de scintillatiefles 72 uur bij kamertemperatuur draaien met 10RPM. Vervang de 10%EDTA oplossing elke 24 uur gedurende een periode van 72 uur.
Wees voorzichtig bij het vervangen van oplossingen zodat de cochlea niet wordt blootgesteld aan de lucht. Spoel vervolgens de cochlea drie keer gedurende twee uur elk met PBS. In dit stadium zou de cochlea gedecalcificeerd moeten zijn.
Voordat cellen worden geïnfuseerd, begint u door gedecelluleerde en gedecalcificeerde cochlea gedurende minimaal een uur in een 5% koolstofdioxide, 37 graden Celsius celcultuur incubator te incuberen. Om de cochleae te profuseren, voeg vervolgens een druppel MSCGM toe aan elke cochlea om te voorkomen dat de cochlea uitdroogt. Breng ze over naar een nieuwe 24-well plaat met behulp van een transferpipet.
Richt de cochlea delicaat met ultrafijne forceps, zodat de ovale en ronde ramen omhoog wijzen. Gebruik vervolgens een steriele 28,5 gauge Insuline spuit met aangesloten buis om 0,2 milliliter van de re-gesuspendeerde Human Wharton's jelly cellen op te trekken. Plaats vervolgens de buis over het ovale venster met behulp van gesteriliseerde fijne forceps.
Profuseer delicaat en langzaam de cochlea met 0,2 milliliter van de re-gesuspendeerde Human Wharton's jelly cellen gedurende vijf minuten. Deze profuseringsstap is belangrijk. Succesvolle profusering van vloeistoffen door de cochlea heeft grote invloed op het resultaat van dit protocol.
Na profusering, voeg 0,8 milliliter 37 graden Celsius voorverwarmde MSCGM toe aan de put met cochlea om het totale volume op een milliliter te brengen. Herhaal de procedure voor elke cochlea. Gebruik elke keer een verse spuit en buis.
Plaats de geprofuseerde cochlea in een 37 graden Celsius celcultuur incubator en ververs het medium drie keer per week. Hier wordt de succesvolle decellulatie en decalcificatie van een muis cochlea zonder geïnjecteerde cellen getoond. Over het algemeen wordt de anatomie van de cochlea bewaard met holten achtergelaten zonder dappy kleuring.
Hier zijn de representatieve resultaten van succesvol gekweekte Human Wharton's jelly cellen op een cochlea schaal. Overvloedige dappy kleuring wordt waargenomen door de hele cochlea en op het buitenste botoppervlak. Nader onderzoek van individuele
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een effectieve methode om muis-slakkenshuisen te decellulariseren en te decalcificeren voor gebruik als scaffolds in weefseltechnische toepassingen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om de interactie tussen cellen en de extracellulaire matrix van het slakkenshuis te bestuderen, wat essentieel is voor het begrijpen van de vorming van het sensorische epitheel.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechnologie
- Gehooronderzoek
- Cellulaire interacties
Achtergrond
- Decellularisatie en decalcificatie zijn essentieel voor het creëren van scaffolds.
- Een goed begrip van de cochleaire structuur is cruciaal voor onderzoek naar het binnenoor.
- Stamceldifferentiatie wordt beïnvloed door de extracellulaire matrix.
- Visuele methoden verbeteren het begrip van complexe procedures.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor de preparatie van een cochleair steunweefsel.
- Om onderzoek naar interacties tussen cochleaire cellen te vergemakkelijken.
- Om de kennis in de velden van auditieve wetenschappen en weefselengineering te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van het slaapbeen uit de schedel.
- Decellularisatie van de cochlea's.
- Decalcificatieproces voor de voorbereiding van de scaffold.
- Visuele demonstratie van de procedure ter verduidelijking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle decellularisatie en decalcificatie van muis-slakkenshuisjes.
- Verdiept inzicht in interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix.
- Verbeterde methoden voor het bestuderen van de vorming van het sensorisch epitheel.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het begrip van de procedure aanzienlijk.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol instrument voor onderzoek naar het binnenoor.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van het gedrag van stamcellen in cochleaire scaffolds.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor complexe biologische procedures.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om fysiologisch relevante cochleaire scaffolds te genereren voor het bestuderen van stamcelinteracties met de natuurlijke extracellulaire matrix, ter ondersteuning van targetvalidatie in de auditieve regeneratieve geneeskunde. Door de architectuur van de extracellulaire matrix te behouden terwijl cellulaire componenten worden verwijderd, biedt deze methode een gedefinieerd systeem om mechanistische hypothesen over matrix-gemedieerd celgedrag in innerlijk oor weefselengineering te ontrisken. De aanpak ondersteunt de ontwikkeling van preklinische modellen voor therapieën tegen gehoorverlies door een gecontroleerde evaluatie van cel-scaffold-dynamiek in een 3D ziekterellevant systeem mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de invloed van de extracellulaire matrix op stamceldifferentiatie en de vorming van het sensorische epitheel.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van targets mogelijk door matrixspecifieke effecten te isoleren van cellulaire variabelen in een gecontroleerd scaffold-systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde, reproduceerbare biologische systemen voor voor kwantitatieve beoordeling van celinvasie, proliferatie en matrixinteractie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en het hergebruik van platforms door consistente decellularisatie- en decalcificatie-resultaten over meerdere cochlea's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt ziekterelevante systeemcontinuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het behoud van de oorspronkelijke cochleaire architectuur.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door longitudinale observatie van cel-scaffold-interacties over kweekperioden van 30 dagen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door na de isolatie extracellulaire matrix-steigers te bieden, wat hypothesetesten in de fasen van lead-identificatie mogelijk maakt voorafgaand aan preklinische efficiëntietesten.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en het mechanistisch minimaliseren van risico's door directe studie van interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix mogelijk te maken zonder storende cellulaire debris.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde steigerpreparatie die de structurele integriteit behoudt voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen of cellen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen via de invasiediepte van cellen, proliferatiesnelheden en matrixinteractiepatronen die waarneembaar zijn via kleuring en beeldvorming.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door de structuur van het orgaan van Corti te behouden, waardoor extrapolatie naar in vivo-achtige omgevingen mogelijk wordt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar steigerplatform dat toepasbaar is op verschillende celtypen en soorten, waardoor redundante isolatie-inspanningen in programma's voor auditieve weefseltechniek worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij target-validatie door vermindering van mechanische ambiguïteit in celgedrag gemedieerd door de extracellulaire matrix.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde decellularisatieprotocollen (72 uur SDS-rotatie) en decalcificatieprotocollen (72 uur EDTA-rotatie).
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen door vroege beoordeling van matrix-afhankelijke celresponsen mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium van auditieve regeneratieve programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van stamcel- of matrix-modulerende kandidaten op basis van functionele read-outs vanuit scaffolds.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in microsurgische isolatie van het slaapbeen en steriele celperfusietechnieken.
- Benodigde instrumentatie omvat ultrafijne pincetten, transferpipetten, rotatoren en steriele spuitenperfusiesystemen.
- Standaardisatie tussen teams vereist naleving van de schema's voor oplossingenuitwisseling en het vermijden van blootstelling aan lucht tijdens decellularisatie/decalcificatie.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten soortspecifieke timingaanpassingen en validatie van de integriteit van het scaffold voor alternatieve celtypen buiten MSC's afgeleid van de gelei van Wharton.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van de cochlea, waardoor zorgvuldige hantering noodzakelijk is om structurele schade tijdens isolatie en perfusie te voorkomen.
