Synthese en evaluatie van een Ruthenium gebaseerde mitochondriale Calcium opname Inhibitor

Het algemene doel van de synthese en zuivering is om relatief eenvoudig een ruthenium 360 analoog te produceren dat wordt gebruikt in mitochondriale calciumopname-assays en dat 10 keer effectiever is dan commercieel verkrijgbaar ruthenium 360. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van mitochondriale calciumbiologie door een zuivere remmer van mitochondriale calciumopname te leveren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het eindproduct zowel zeer krachtig als zuiver is.

Mensen die nieuw zijn met deze methode kunnen worstelen omdat zuivering tijd en geduld vereist. De producent die dit zal demonstreren is Sarah Nathan, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Begin deze procedure met de synthese van pentaammine chloorrutheniumdichloride zoals beschreven in het tekstprotocol.

Los 100 milligram pentaammine chloorrutheniumdichloride op in 50 milliliter van een 1 molaaire oplossing van ammoniumhydroxide in een ronde 200 milliliter kolf met platte bodem. Dek de kolf losjes af met een glazen stop en verwarm het reactiemengsel gedurende zes uur op 75 graden Celsius. Het verwarmen van een afgesloten vat resulteert in een drukverhoging.

Zorg ervoor dat de glazen stop los zit om overtollige druk vrij te laten komen. Verwijder na zes uur het reactiemengsel van de warmte. En roer gedurende vier dagen op kamertemperatuur om een donkergroene oplossing te verkrijgen.

Om de resulterende trans-diaqua octo amine mu-oxo diruthenium pentachloride te zuiveren door middel van kationenuitwisselingschromatografie, suspendeer eerst vijf gram van een gaasmaske kationenuitwisselingshars in 10 milliliter van 0,1 molaaire HCL in een 25 milliliter beker. Laad deze suspensie in een 10 milliliter kolom voorzien van een 50 milliliter oplosmiddelreservoir. Was de hars met ongeveer 20 tot 30 milliliter van 0,1 molaaire HCL totdat de eluaat kleurloos is.

Voeg vervolgens geconcentreerd HCL toe aan de eerder geïsoleerde groene reactieoplossing om de PH aan te passen op twee, waarbij de kleur van de oplossing verandert in bruin. Laad deze aangezuurde oplossing op de kationenuitwisselingsharskolom door deze voorzichtig bovenop de hars te pipetten. Laat de eluaat volledig weglopen en blijf de oplossing laden.

Herhaal dit proces totdat de hele oplossing is toegevoegd. De bovenkant van de hars zal donkerbruin of zwart worden. De hars zal iets in volume afnemen.

Bedek vervolgens de bovenkant van de hars met glazen bollen om te voorkomen dat de hars wordt verstoord wanneer nieuwe oplossingen worden toegevoegd. Elueer de kolom met 20 milliliter van 1 molaaire HCL. Elueer vervolgens de kolom met 50 milliliter van een verhoogde HCL-concentratie van 1,5 molaar.

Een gele oplossing zal beginnen te komen van de kolom. Verhoog vervolgens de HCL-concentratie tot twee molaar en blijf elueren met 150 tot 200 milliliter. De eluaat zal beginnen als een zeer lichtgele en gaan naar een heldergele.

Wacht tot de eluaat die uit de kolom komt weer zeer licht is. Geduld is cruciaal in deze stap. De eluaat moet zeer licht zijn.

Verhoog de HCL-concentratie verder tot 2,5 molaar. Verzamel de eluaat als fracties in testbuisjes. Verhoog tenslotte de concentratie tot drie molaar HCL.

Het product zal van de kolom elueren als een groenbruine oplossing. Een roodbruine fractie kan ook beginnen te komen van de kolom. Deze fracties zijn rutheniumbruine onzuiverheden en mogen niet worden gepoold met de groenbruine fracties.

Om alle fracties te testen door middel van UV-Vis spectroscopie, voeg 100 microliter van een bepaalde fractie toe aan twee milliliter van drie molaar ammoniak. Analyseer vervolgens het mengsel door middel van UV-Vis spectroscopie. Fracties die puur product bevatten, zullen een grote absorptieband hebben bij 360 nanometer en een minder intense absorptie bij 600 nanometer.

Absorptie bij 480 nanometer is indicatief voor rutheniumbruin en absorptie bij 533 nanometer vertegenwoordigt rutheniumrode onzuiverheden. Andere onzuiverheden worden gezien bij een absorptie van minder dan 300 nanometer. Pool fracties die puur product bevatten en verdampe de oplossing tot droogheid door rotatievevaporatie voor analyse van het monster in vaste toestand door IR-spectroscopie.

Ga verder met het evalueren van mitochondriale calciumopnameremming door middel van fluorescentiespectroscopie zoals beschreven in het tekstprotocol. UV-Vis-spectra van gezuiverd trans-diaqua octo amine mu-oxo diruthenium pentachloride worden gekenmerkt door de belangrijkste en kleine absorpties respectievelijk bij 360 nanometer en 600 nanometer. Omgekeerd vertoont een onzuiver mengsel absorptiebanden bij 533 nanometer van rutheniumrode onzuiverheden en bij 275 tot 300 nanometer van het uitgangsmateriaal.

Karakterisering in vaste toestand met behulp van infraroodspectroscopie heeft de verwachte strekkingen van de aminen. Evenals de ruthenium zuurstof ruthenium rek bij 850 inverse centimeters. Permeabiliseerde HeLa-cellen behandeld met een calciumgevoelige fluorescente kleurstof en trans-diaqua octo amine mu-oxo diruthenium pentachloride vertonen remming van calciumopname in de mitochondriën.

Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat de fracties volledig moeten elueren. Geduld levert een zuiver product op. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze krachtige ruthenium 360 analoog kunt synthetiseren, zuiveren en karakteriseren.

Mitochondriale calciumniveaus reguleren een breed scala aan intercellulaire processen, waaronder bio-energetica en gecontroleerde celdood. De remmer die uit deze methode wordt geproduceerd, kan worden toegepast in studies om de rol van mitochondriale calciumbiologie in het mediëren van andere biologische processen te begrijpen. Vergeet niet dat het werken met geconcentreerde zuren en basen corrosief is en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van geschikte PPE altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.