DNA kleuring methode gebaseerd op Formazan neerslag veroorzaakt door blootstelling aan blauw licht
28 januari 2018
Met deze methode kunt selectieve kleuring en kwantificering van DNA in gels door inweken de gel in een groene SYBR ik / Nitro blauwe Tetrazolium oplossing en vervolgens blootstelling aan zonlicht of een blauwe lichtbron. Dit produceert een zichtbaar neerslag en bijna geen apparatuur, waardoor het ideaal is voor gebruik van veld vereist.
Het DNA-kleuringsprotocol heeft drie algemene stappen. De eerste is om het gel in een oplossing van SYBR Green I en nitro blauw tetrazolinium te doen, ook bekend als NBT. Het gel wordt vervolgens 25 minuten geroerd als het een polyacrylamide-gel is en een uur als het een agarose-gel is.
De laatste stap is om het gel bloot te stellen aan een blauwe lichtbron zoals blauwe LED's of zonlicht. Tijdens deze stap verschijnen er enkele precipitaatbanden. Deze banden hebben een directe correlatie met de DNA-concentratie en het gel kan vervolgens worden gedigitaliseerd in een kantoorscanner om het DNA te kwantificeren.
Voor de polyacrylamide-gel wordt een niet-denaturerende polyacrylamide-gel bereid. Het gel wordt vervolgens geladen met de monsters en het elektroforeseproces begint. SYBR Green I wordt verdund tot 1,2X en de NBT 20 millimolar oplossingen worden nu bereid.
Het gel wordt in een plastic container geplaatst en er worden 16,75 ml van de verdunde SYBR Green I en 325 ml van de NBT bij 20 millimolar toegevoegd. Vervolgens wordt de container bedekt met Parafilm en aluminiumfolie en gedurende 25 minuten geroerd bij 60 tpm. Ten slotte wordt het aluminiumfolie en een Parafilm verwijderd en wordt het gel blootgesteld aan zonlicht of een blauwe lichtbron.
Voor bandkwantificering en kalibratiecurves wordt het gel in een kantoorscanner geplaatst, vervolgens wordt het beeld geanalyseerd met behulp van een beeldanalysesoftware. Ten slotte wordt een grafiek van genormaliseerd signaal versus concentratie gemaakt. Er wordt een agarose-gel gemaakt.
De putjes worden geladen met een plasmide dat ampicilline-resistentie heeft en het gel wordt in twee stukken gesneden, die elk worden gekleurd met een verschillende kleurstof. Vervolgens wordt de plasmideband geëxtraheerd en getransformeerd via chemische transformatie in competente cellen met media die ampicilline bevat. Een 1% agarose-gel wordt bereid in TAE 1X buffer en geladen met vier microliter plasmide bij ongeveer 100 nanogram per microliter.
Het gel in de elektroforesekamer wordt vervolgens gedurende een uur op 100 volt gelopen. De helft van het gel wordt gekleurd met SYBR Green I en NBT methode en de andere helft met SYBR Green I UV methode. Voor agarose-gel wordt de SYBR Green I NBT methode uitgevoerd met SBYR Green I bij een concentratie van 1,2X en NBT bij 2 millimolar.
Het gel wordt in een plastic container geplaatst en het oplossingsvolume wordt geschaald om het gel te bedekken en de roertijd wordt verlengd tot een uur. Voor agarose-gels wordt de gebruikelijke SYBR Green I methode uitgevoerd door het gel te bedekken met 1X SYBR Green I oplossing en een uur te roeren. Vervolgens wordt het gel blootgesteld aan een UV-transilluminator gedurende twee minuten voor bandvisualisatie.
Zodra het gel is gekleurd, wordt de plasmideband gesneden met een scalpel en wordt het plasmide geëxtraheerd met een commercieel extractiekit. Het DNA wordt genormaliseerd tot 9,1 nanogram per microliter voor het transformeren van chemische competente Escherichia coli XL 10 bacteriën. Ten slotte worden de kolonies geteld.
De kolonievormingseenheden worden berekend. Het resultaat wordt geplot en de resultaten verkregen uit SYBR Green I NBT en SYBR Green I UV worden vergeleken. Een paarse formazan precipitaat verschijnt waar het DNA zich bevindt.
In het experiment werd een DNA ladder geladen om een kalibratiecurve te maken met een detectielimiet van 192 picogrammen bij 1.500 basenparen. Het gebruik van agarose-gels maakt de monsterherstel mogelijk met behulp van commercieel verkrijgbare kits en interfereert niet met de extractie. Sommige herstel met deze methode met blauwe LED geeft betere kwaliteit in vergelijking met de SYBR Green I met behulp van transilluminator.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode maakt selectieve kleuring en kwantificering van DNA in gels mogelijk met behulp van een SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium-oplossing. Het proces vereist minimale apparatuur, waardoor het geschikt is voor toepassingen in het veld.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biochemie
- Moleculaire Biologie
- Veldtoepassingen
Achtergrond
- DNA-kwantificatie is essentieel voor diverse biologische studies.
- Traditionele methoden vereisen vaak complexe apparatuur.
- Deze methode vereenvoudigt het proces aanzienlijk.
- Maakt gebruik van gangbare reagentia voor effectieve resultaten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige methode voor DNA-kleuring.
- Het mogelijk maken van de kwantificering van DNA in verschillende geltypen.
- Het faciliteren van veldwerk met minimale vereisten aan apparatuur.
Gebruikte methoden
- Het weken van de gel in een SYBR Green I- en NBT-oplossing.
- Het roeren van de gel gedurende 25 minuten (polyacrylamide) of 1 uur (agarose).
- Het blootstellen van de gel aan een blauwe lichtbron of zonlicht.
- Het digitaliseren van de gel voor DNA-kwantificatie.
Belangrijkste resultaten
- Zichtbare precipitaatbanden correleren met de DNA-concentratie.
- Effectieve kleuring bereikt met minimale apparatuur.
- Resultaten kunnen worden gekwantificeerd met standaard officescanners.
- De methode blijkt betrouwbaar onder veldomstandigheden.
Conclusies
- De methode biedt een praktische aanpak voor DNA-kwantificatie.
- Deze is geschikt voor diverse geltypen en toepassingen in het veld.
- Het verbetert de toegankelijkheid voor onderzoekers op afgelegen locaties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze DNA-kleuringsmethode maakt directe visualisatie en kwantificering van nucleïnezuren mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur, wat een snelle targetvalidatie in omgevingen met beperkte middelen ondersteunt. Door de afhankelijkheid van UV-transilluminatoren weg te nemen, worden de veiligheidsrisico's en de operationele complexiteit in vroege discovery-workflows verminderd. De aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door een reproduceerbare, op kleurstof gebaseerde signaalcorrelatie met de DNA-concentratie, wat go/no-go-beslissingen in pipelines voor lead-identificatie vergemakkelijkt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetoetsing mogelijk via directe correlatie tussen de intensiteit van het formazan-precipitaat en de DNA-concentratie, wat de beoordeling van target-engagement ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van roeren bij kamertemperatuur en blootstelling aan blauw licht, waardoor gevaarlijke UV-protocollen en gespecialiseerde beeldvormingsapparatuur worden vermeden.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve output die compatibel is met kantorescanners, waardoor een snelle vergelijking van de opbrengst aan nucleïnezuren over verschillende experimentele condities mogelijk is.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert stabiele, zichtbare precipitaatbanden die dienen als gestandaardiseerde uitlezingen voor high-throughput screeningformaten van nucleïnezuren.
- Reproduceerbaarheid: Gedefinieerde roertijden (25 min voor polyacrylamide, 60 min voor agarose) en schaalbare reagensconcentraties zorgen voor een consistente signaalgeneratie tussen verschillende batches.
- Platformcompatibiliteit: Werkt met zowel agarose- als polyacrylamidegels, wat een naadloze integratie mogelijk maakt in bestaande elektroforese-workflows voor variant- of plasmidanalyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt het herstel van functionele plasmiden na kleuring, zoals aangetoond door hogere colony-forming units in vergelijking met UV-gebaseerde methoden, wat functionele validatie in downstream-toepassingen mogelijk maakt.
- Mechanische risicoreductie: Voorkomt UV-geïnduceerde DNA-schade, waardoor de integriteit van het monster behouden blijft voor een nauwkeurige genotype-fenotype correlatie in fenotypische screeningsassays.
- Preklinisch nut: Maakt veldinzetbare kwantificering van genexpressieconstructen of virale titers in preklinische modellen mogelijk zonder laboratoriuminfrastructuur.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van nucleic acid-extractie tot validatie van functionele assays, met name wanneer de toegang tot apparatuur beperkt is of wanneer snelle iteratie vereist is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt targetvalidatie door kwantificeerbare DNA-readouts te leveren die correleren met transcriptionele of editing-efficiëntie in studies naar pathwaymodulatie.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde nucleic acid kwantificatie mogelijk voor hit-bevestiging in CRISPR- of overexpressie-bibliotheken, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Analytica: Genereert lineaire signaal-concentratiecurven via imaging met een officescanner, wat datanormalisatie ondersteunt over multi-well platen of gel-gebaseerde formaten.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert het terugwinnen van intacte nucleic acids voor in vitro functionele assays, waardoor de brug wordt geslagen tussen ontdekking en preklinisch onderzoek naar effectiviteit.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vereist enkel SYBR Green I, NBT en een blauwe lichtbron, waardoor het een kosteneffectieve, herbruikbare module is voor meerdere projectteams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door UV-geïnduceerde artefacten te vermijden, wat de betrouwbaarheid van gegevens in target-validatie-assays verbetert.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor donkere kamers of transilluminatoren, waardoor de doorvoersnelheid toeneemt en knelpunten in gedeelde kernfaciliteiten worden verminderd.
- Strategische waarde: Verlaagt de kapitaaluitgaven voor de kwantificering van nucleïnezuren, wat gedecentraliseerd testen in satellietlaboratoria of collaboratieve locaties mogelijk maakt.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door vroege, apparatuuronafhankelijke bevestiging van de constructopbrengst te bieden voordat er wordt geïnvesteerd in downstream zuivering.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist basisopleiding in moleculaire biologie voor de bereiding van gels en elektroforese.
- Toegang tot een blauwe lichtbron (bijv. 470 nm LED's) of zonlicht en standaard laboratoriumroerapparatuur is nodig.
- Standaardisatie van kleurtijden en reagensconcentraties is vereist om reproduceerbaarheid tussen laboratoria te garanderen.
- Optimalisatie voor high-throughput formats kan nodig zijn vanwege de handmatige stappen bij de gelverwerking.
- Beperkt tot de detectie van nucleïnezuren; niet toepasbaar voor eiwit- of kleine molecuulassays zonder aanpassing.
