De ATP-bioluminiscentieanalyse

De ATP-bioluminescentie-assay is een veelgebruikte techniek om ATP-niveaus te kwantificeren en levende, metabolisch actieve cellen te detecteren. ATP of adenosinetrifosfaat is de primaire energiebron voor alle levende organismen, en met 'alle' bedoelen we ALLES. Op cellulair niveau wordt ATP gegenereerd door een reeks metabolische processen die cellulaire ademhaling worden genoemd.

Vandaag bespreken we kort de paden die bij cellulaire ademhaling betrokken zijn. Vervolgens introduceren we de principes achter de ATP-bioluminescentie-assay en gaan we door een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van deze methode. Ten slotte zullen we zien hoe wetenschappers deze techniek toepassen in hun huidige onderzoek.

Laten we beginnen met het introduceren van cellulaire ademhaling. Dit fenomeen omvat verschillende metabolische processen, maar we zullen ons concentreren op het proces dat te maken heeft met glucosemetabolisme.

In het cytoplasma converteert de glycolyse-route glucose naar pyruvaat en genereert daarbij twee ATP-moleculen. Pyruvaat wordt naar de mitochondriën getransporteerd, waar het wordt omgezet in acetyl-co-enzym A - een proces dat ook koolstofdioxide genereert. Terwijl het nog in de mitochondriën is, gaat acetyl-co-enzym A vervolgens de tricarbonzuur- of TCA-cyclus in, waarbij koolstofdioxide opnieuw wordt gegenereerd, evenals de hoogenergetische moleculen van NADH en FADH2. Deze moleculen 'dragen' uiteindelijk elektronen naar de elektronentransportketen of ETC.

Binnen de ETC worden elektronen sequentieel overgedragen tussen verschillende eiwitcomplexen in de binnenste mitochondriale membraan, voordat ze zuurstof omzetten in water. Tijdens dit proces worden protonen 'gepompt' in de intermembranruimte van de mitochondriën. ATP wordt eigenlijk geproduceerd wanneer deze protonen teruggaan in de mitochondriale matrix terwijl ze een eiwit genaamd ATP-synthase passeren. Samen resulteren de TCA-cyclus en ETC in de synthese van 36 ATP-moleculen. Afbraak van andere nutriëntmoleculen, zoals vetten en eiwitten, kan ook invoeren in de TCA-cyclus en ETC, wat leidt tot ATP-productie.

Nu we weten hoe cellen ATP genereren, laten we leren over de principes achter de ATP-bioluminescentie-assay, die vaak wordt gebruikt om intracellulaire niveaus van deze molecuul te meten.

Structureel heeft ATP een adenine-base, een ribose-suiker en drie fosfaatgroepen - de laatste zijn verbonden door hoogenergetische bindingen. Deze bindingen geven energie vrij wanneer ze worden gebroken, en de ATP-bioluminescentie-assay maakt gebruik van deze energie.

Kortom, deze assay vereist het luciferine-compound, dat wordt verkregen uit 'glinsterende' organismen zoals vuurvliegjes, en het corresponderende katalysatorenzym genaamd luciferase. In aanwezigheid van zuurstof haalt luciferase energie uit ATP en converteert luciferine in oxyluciferine. Bijproducten van deze reactie zijn pyrofosfaat, dat twee fosfaatgroepen zijn die worden verkregen uit ATP - waardoor het wordt omgezet in adenosinemonofosfaat of AMP - koolstofdioxide, en licht of luminescentie. Luminescentie wordt gelezen door een luminometer, een apparaat dat lichtemissie kwantificeert. Aangezien de hoeveelheid geproduceerde luminescentie direct evenredig is aan de hoeveelheid ATP, dient dit als een goede indicator van celviabiliteit en metabolisme.

Nu u de principes achter de ATP-bioluminescentie-assay begrijpt, laten we een algemeen protocol schetsen.

Eerst worden cellen gezaaid in een 96-wellsplaat met kweekmedium. Cellen worden geplaatst in verschillende dichtheden in drievoudig, om rekening te houden met dichtheidsafhankelijke variatie. Omdat de buitenste wells niet aan alle vier de kanten worden omringd door andere wells, kunnen de temperatuur en verdampingssnelheid in deze wells variabel zijn. Daarom worden cellen niet in de buitenste wells geplaatst, en in plaats daarvan worden ze gevuld met water om plaatbrede verdamping en temperatuurvariatie te voorkomen die de reactie kunnen beïnvloeden. Platen worden vervolgens een nacht bij 37°C geïncubeerd om de cellen te laten hechten aan de kweekplaten.

Vervolgens wordt het medium verwijderd, wordt luciferase en luciferine aan elke well toegevoegd en wordt de plaat gedurende 5-15 minuten op een shaker geplaatst om de reactie te vergemakkelijken. Vervolgens wordt een deel van het mengsel uit elke well overgebracht naar een witte 96-wellsplaat; witte platen worden vaak gebruikt omdat ze licht omhoog reflecteren, wat zorgt voor nauwkeurigere luminescentiemetingen. Bovendien moeten bellen worden vermeden, omdat ze kunnen interfereren met latere analyses. Omdat het luminescentiesignaal in de loop van de tijd kan afnemen, wordt de plaat binnen 10-12 minuten op een luminometer gelezen.

Om de luminometerresultaten te analyseren, wordt een gemiddelde luminescentiewaarde berekend van wells met dezelfde cellendichtheid. Door luminescentiegegevens te vergelijken die op deze manier zijn verzameld uit zowel gezonde controlemonsters als behandelde cellen, kunnen onderzoekers de effecten van een specifieke behandeling op levensvatbaarheid en metabolisme evalueren - specifiek door te zoeken naar verminderde luminescentie in de experimentele groep.

Nu u hebt gezien hoe u een ATP-bioluminescentie-assay uitvoert, laten we de onderzoekstoepassingen bespreken.

Wetenschappers proberen altijd nieuwe antiviralen te ontwikkelen die gastheercellen niet beschadigen of doden. In dit onderzoek werden zoogdiercellen gezaaid in een multiwellsplaat en geïnfecteerd met een specifiek virus. Verschillende antivirale verbindingen werden aan deze monsters toegevoegd, en logaritmische concentratie-responscurven werden gegenereerd om de effectieve concentratie vijftig of EC50 te berekenen. EC50 is de concentratie van de verbinding waarbij de celviabiliteit 50 procent is. Dit is een veelgebruikte parameter om de cytotoxiciteit van een verbinding te beoordelen.

ATP-niveaus kunnen ook aanwijzingen geven over mitochondriale activiteit onder verschillende omstandigheden. Hier werd de ATP-bioluminescentie-assay uitgevoerd op preparaten van mitochondriën afgeleid van knaagdierlever en spiercellen, wat onderzoekers hielp om de mate van mitochondriale functie in normale weefsels te beoordelen. Be