Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

Het algemene doel van deze techniek is om te meten hoe nematoden en hun neuronen reageren op externe mechanische stimuli met behulp van een microfluïdische chipopstelling met drukactuators. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van mechanobiologie en sensorische biologie, zoals hoe cellen, weefsels en dieren reageren op mechanische stimulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de mobiliteit van de worm op een niet-invasieve manier voldoende vermindert om beeldvorming met hoge resolutie mogelijk te maken, terwijl nog steeds toegang tot de cuticula van de worm is voor mechanische stimulatie.

Deze methode kan ook worden gebruikt om de invloed van mechanische signalen op de ontwikkeling te bestuderen. Het kan zelfs worden toegepast op andere systemen zoals ex vivo orgaanexpons of andere dieren van vergelijkbare grootte als C.Elegans. Stel een microscoopsysteem in voor gelijktijdige excitatie van GCaMP en RFP.

Een optie is een discrete lichtbron die alleen cyaan en geel licht overbrengt. Gebruik voor het bekijken een 10-voudige objectief en een objectief met hoge vergroting. Stuur ook de afbeelding naar een computer via een digitale camera.

Voeg vervolgens een floressentie-kubus toe en, indien nodig, een excitatiefilter. Voeg een dichrooïsche spiegel toe aan de kubus die cyaan en geel licht reflecteert en groen en rood licht doorlaat. Stel een straapsplitter in met een lang-doorlaat-dichroöische spiegel met een afsluiting bij 570 nanometer.

Zorg ook voor een banddoorlaat-emissiefilter voor groen licht bij 525 nanometer met een breedte van 50 nanometer en een banddoorlaat-emissiefilter voor rood licht bij 632 nanometer met een breedte van 60 nanometer. Projecteer beide stralen in het beeldveld van de camera. Zorg ervoor dat het groene deel wordt geprojecteerd naar de bovenste helft van het scherm en het rode deel naar de onderkant.

Gebruik altijd microfluïdische chips die minder dan een maand oud zijn. Laad voor de opstelling eerst het zwaartekrachtstroomreservoir met gefilterde M9. Plaats het reservoir ongeveer 60 centimeter boven de chip en verbind het met een chipuitlaat. Verbind vervolgens de andere uitlaat met een afvalicontainer met twee ingangen en verbind de tweede ingang naar de afvalicontainer met een peristaltische pomp.

Maak alle verbindingen met polyethyleen buis. Monteer vervolgens interconnecties, 50 millimeter buislengten met metalen buisconnectoren aan beide uiteinden. Druk op en sluit de interconnect op elk van de zes activeringsvingers en in de worminlaat.

Plaats nu de chip onder de optiek. Zorg ervoor dat de interconnects aan de chip zijn verbonden, omdat de PDMS snel slijt bij herhaalde manipulaties. Het is van vitaal belang dat de PDMS-actuator en de buis die de chip met het luchtreservoir verbinden goed zijn afgedicht om een goede chromatische activering van het diafragma te garanderen.

Voordat u dieren laadt, controleert u op drukverlies in de microfluïdische chip. Meet de doorbuiging van het diafragma door meerdere activeringscycli uit te voeren bij de gewenste druk. Vergelijk vervolgens de kwantitatieve waarden met theoretische voorspellingen.

Als de gemeten waarden niet zoals verwacht zijn, controleert u op lekken in de buis of buisconnectoren. De PDMS kan ook een andere elasticiteit hebben vanwege een alternatieve verhouding tussen basispolymeer en verhardingsmiddel, of de PD-massa kan oud en overmatig verknoopt zijn. Zorg voor age-gesynchroniseerde-naar-jonge-volwassen of volwassen-dag-één C.elegans zoals beschreven door Porta-de-la-Riva en bedrijf in hun Jove-publicatie uit 2012.

Kies nu twee tot vijf jonge volwassenen of een dag oude hermafrodiet. Het kiezen van dieren van de juiste grootte is cruciaal. Kleine dieren zullen niet vast komen te zitten in het kanaal en te grote dieren zullen moeilijk te verwijderen zijn en kunnen het apparaat verstoppen.

Trek de gekozen wormen in een druppel gefilterde M9. Trek ze vervolgens in een lengte buis met behulp van een ene-milliliter spuit zonder ze in het spuitlichaam zelf te trekken. Verbind vervolgens de buis met de interconnect bij de worminlaat van de chip. Activeer vervolgens de zwaartekrachtstroom door de klep naar het reservoir te openen en de pomp te starten.

Bekijk nu het vangenkanaal met viervoudige vergroting en duw de dieren voorzichtig in het apparaat. Nadat de dieren in de wachtkamer zijn geladen, gebruikt u de plunjer om een van hen voorzichtig naar de voorkant van het vangenkanaal te laten stromen zodat de kop in de taps toelopende vorm van het kanaal komt. Als de worm niet de volledige dwarsdoorsnede van het kanaal van de neus tot bijna het einde van het lichaam vult, verwijdert u de worm.

Vaak zullen wormen die te klein zijn, recht door de chip gaan zonder vast te komen te zitten. Als een dier dat in het vangenkanaal is gevangen moet worden verwijderd, drukt u eenvoudig op de plunjer van de spuit totdat de worm uit het kanaal verdwijnt en laadt u een nieuwe worm. Zodra een worm correct is geladen, schakelt u over naar de fluorescentiemodus en verhoogt u de vergroting.

Om verzadiging te voorkomen, zorg ervoor dat u de excitatie-intensiteit aanpast op basis van de fluorescentie-intensiteit. Controleer of de neuriet van een neuron van belang over de diafragma van een van de actuatoren ligt. Die actuator moet ook vooraan de cellichaam van het neuron liggen.

Zo niet, pas dan de positie van het dier aan door aan de plunjer te trekken of te duwen. Als dat niet helpt, verwijdert u de worm en laadt u een nieuwe. Ook als er autofluorescentie rond het neuron optreedt, vervangt u de worm.

Zodra een worm correct is geladen, richt u zich op het cellichaam van het neuron van belang, bepaal vervolgens welke actuator de chip op zijn voorste zijde heeft en verbind deze actuator met de programmeerbare drukpomp met behulp van de bijbehorende interconnect. Als het experiment vereist dat de afstand tussen de actuator en het neuron wordt gemeten, past u beide in het beeldveld met de kanaalwand evenwijdig aan de bovenste en onderste rand van de afbeelding. Definieer vervolgens een drukprotocol met behulp van de programmeerbare drukpomp.

Begin altijd met het maken van minimaal 50 afbeeldingen bij nul