Name: Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer hoe verzadigde vetzuren macrofaagceldood induceren via ceramide-accumulatie in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar metabole ontsteking en obesitas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Louisville start-up fondsen en National Cancer Institute (Bethesda, MD) verleent R01CA177679, R01CA180986.

het protocol is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Louisville.
 1. muis beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) <ol><li>euthanaseren een 6 tot 8-weken oude, gezond wild type muis met behulp van CO 2. PIN het neer aan een Raad van schuim en spuiten met 70% ethanol totdat het is doorweekt. Verwijder de botten van de tibia/dijbeen met Tang en schaar. Leg ze in een petrischaal met 5 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Uitvoeren van alle procedures onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Opengesneden op beide uiteinden van het bot van het scheenbeen/dijbeen met een schaar in een steriele weefselkweek kap. Spoelen van het bot met een 25 G naald met PBS + 2% foetale runderserum (FBS) in een tube van 15 mL.</li>
	<li>Centrifugeer de beenmergcellen 4 ° C gedurende 5 min. 500 x g</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellet in 1 mL rode bloedcellen lysis-buffermengsel lyse van rode bloedcellen (RBC) voor minder dan 1 min. Dilute onmiddellijk met 9 mL 1 x PBS. Centrifuge weer zoals in stap 1.3. Giet het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 10 mL 1 x PBS, filter de celsuspensie via een steriele 40 μm nylon gaas in een andere tube van 15 mL verwijderen cel puin/klontjes. Centrifuge weer zoals in 1.3. Giet het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 15 mL Roswell Park Memorial Instituut middellange (RPMI) 1640 met 5% FBS en 10 μg/mL gentamicine, plate die de cellen in een schaal van 100-mm weefselkweek op 37 o C incubator voor 60 min. zachtjes swirl de schotel, de drijvende nemen cellen, en ze tellen.</li>
	<li>6 x 10 6 cellen in een schaal van 100-mm plaat met 12 mL macrofaag differentiëren media (RPMI 1640 met 5% FBS en 10 μg/mL gentamicine, vermengd met 30% L929 geconditioneerde media 10) met 10 ng/mL recombinante muis macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) voor 2 dagen.</li>
	<li>Na het kweken voor 2 dagen in een incubator 37 ° C met 5% CO 2, elk gerecht te voeden met 6 mL verse macrofaag differentiëren van media met 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Op dag 5, 8 mL van de oude media uit te nemen zonder verstoring van de cellen en toevoegen van 10 mL verse macrofaag differentiëren van media met 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Op dag 7, oogst het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) met behulp van een cel lifter. 
	Opmerking: Bijgevoegde macrofagen kunnen ook los worden gezien met 5 mL 1 mM EDTA in 1 x PBS gedurende 5 tot 10 minuten na het verwijderen van de float cellen en uitwassen plaat tweemaal met 5 mL 1 x PBS. Centrifugeer de cellen zoals in stap 1.3. resuspendeer hen in verse macrofaag media te differentiëren en ze tellen met een hemocytometer.
	<ol><li>Bevestigen de BMDMs &#39; fenotype door stroom cytometry als beschreven 5. Voorbereiden van de afgeleide muis macrofagen in een bepaalde concentratie voor de volgende studies.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-fatty Acid conjugaat voorbereiding <ol><li>voorbereiden 2 mM BSA in steriele PBS. Bijvoorbeeld, weeg 6.65 g BSA, voeg toe 30 mL 1 x PBS te ontbinden, voegt u meer PBS tot 50 mL, schalen componenten zodat 2 mM BSA in 1 x PBS.</li>
	<li>Voorbereiden 5 mM individuele natriumzout van vetzuren in 2 mM BSA. Verhit tot 37 ° C of hoger, indien nodig, en bewerk ultrasone trillingen ten het mengsel van 2 mM BSA en natriumzout van vetzuren tot een duidelijke oplossing wordt verkregen. 
	Opmerking: Vergeleken met onverzadigde vetzuren, verzadigde vetzuren en nodig hebben een hogere temperatuur meer ultrasoonapparaat tijd voor ontbinding.</li>
	<li>Filter de vetzuren-zuur-BSA oplossing door een 0,22 μm filter, aliquot in 1,5 mL steriele microcentrifuge buizen, en deze opslaan bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of bij-20 ° C voor lange termijn opslag. Geen neerslag na opslag bij 4 ° C in de koelkast moet worden nageleefd.</li>
</ol> 3. Verzadigde vetzuren veroorzaken cel dood van muis beenmerg afgeleid macrofagen <ol><li>plaat van de BMDMs in een 24-well weefselkweek plaat met 0,4 x 10 6 /mL in macrofaag media differentiëren.</li>
	<li>De cellen met de 0,4 mM palmitinezuur en stearinezuur voor 16 tot 24 h bij een incubator 37 ° C met 5% CO 2 behandelen. BSA gebruiken als de negatieve controle.</li>
	<li>Oogsten van de cellen met een cel lifter na behandeling en spin down de cellen bij 4 ° C gedurende 5 min. 500 x g</li>
	<li>Vlek van de cellen met de Annexine V-Alexa 488 en 7-aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μl Annexine V bindende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdunnen van het monster met 200 µL van Annexine-bindende buffer, meng voorzichtig, dan blijven de monsters op ijs na de incubatieperiode.</li>
	<li>Analyseren de gekleurde cellen zo spoedig mogelijk door stroom cytometry 5. Annexine V-Alexa 488 wordt gedetecteerd in de FITC-kanaal en 7-AAD in PerCP/PerCP-Cy5.5-kanaal is gedetecteerd.</li>
</ol> 4. Intracellulaire Ceramide kleuring <ol><li>na de behandeling van het vetzuur, oogst de cellen zoals in stap 3.3. Dan fix cellen in 4% paraformaldehyde voor 30 min.</li>
	<li>Wassen van het monster met 1 mL 1 x PBS, spin down als stap in 3.3 en giet het supernatant.</li>
	<li>De cellen met anti-ceramide primair antilichaam (1:200 verdunning) in 1 x 100 μl permeabilization een buffer voor 30 min. Stain</li>
	<li>Wassen en spin down de cellen opnieuw zoals in stap 4.2.</li>
	<li>De cellen met anti-muis IgM secundair antilichaam (1:500 verdunning) in 1 x 100 μl permeabilization een buffer voor 30 min. Stain</li>
	<li>Wassen en spin down de cellen opnieuw zoals in stap 4.2. Voeg 250 μL 1 x PBS en analyseren van de gekleurde cellen door stroom cytometry 5. 
	Opmerking: Zie de lijst van de gedetailleerde reagens in de tabel van apparatuur en reagentia.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen financiële belangenconflicten.

De juiste voorbereiding van vetzuur oplossing is van essentieel belang zijn voor het bestuderen van de biologische functie van vetzuren. De neutralisatie van vetzuur verhoogt de oplosbaarheid in waterige oplossing. Natrium zouten van vetzuren, vooral verzadigde vetzuren, zijn echter nog steeds van lage oplosbaarheid in water of PBS zoals we waargenomen. Een methode is het gebruik van 95-100% ethanol te ontbinden vetzuur1. Met behulp van deze methode, kan hogere toxiciteit voor cellen zelfs bij lag...

Vetzuren spelen een cruciale rol in energiemetabolisme en de synthese van membraan fosfolipiden in verschillende soorten cellen. Vetzuren hebben een lage oplosbaarheid in water. Passende voorbereiding van vetzuur is van cruciaal belang voor het bestuderen van de biologische functies van vetzuren in zoogdiercellen. Wanneer vetzuren worden bereid met ethanol, kan veel vetzuren laten zien van hun giftige zeep (detergenten) effect op de celmembraan, zelfs op relatief lage concentraties1. Als een natuurlijke, grote vervoerder voor vrije vetzuren in het serum, serumalbumine wordt beschouwd als een goede drager voor vetzuur levering in vitro vetzuur functie testen2,3,4. De details van de voorbereiding van vetzuur en serumalbumine conjugaat zijn echter meestal niet beschikbaar alhoewel veel werkstukken met behulp van vetzuren zijn gepubliceerd.
Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindende eiwit5,6,7,8. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren die hun immuun functies kunnen reguleren. Om te bestuderen van de impact van vetzuren op de macrofagen en andere cellen, werden verschillende methoden van vetzuur voorbereiding toegepaste1,7,9. Het gebruik van op de juiste manier bereid vetzuur/serum albumine geconjugeerde te onderzoeken van het effect van vetzuren op macrophage functie is van cruciaal belang bij het verkrijgen van biologisch relevante gegevens. Studies over de invloed van vetzuren macrofaag-functie kunnen gebruikers basiskennis en potentiële therapeutische streefniveaus met betrekking tot de vetzuurstofwisseling in macrofaag-betrokken ziekten.

<table><tbody><tr><td>CPX Ultrasonic Bath </td><td>Bransonic</td><td>Model 2800</td><td></td></tr><tr><td>Sodium palmitate (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Sodium stearate (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) </td><td>Cell Signaling Technology,  Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone: MID 15B4</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer </td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Lifter </td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Opmerking: M.W. staat voor molecuulgewicht.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verzadigde vetzuren induceren ceramide-geassocieerde macrophage celdood

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindend-proteïne. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren, die een cruciale rol spelen kan bij het reguleren van hun immuun functies. Talrijke studies hebben aangetoond dat verschillende vetzuren, verzadigde of onverzadigde, mei bezitten verschillende gevolgen voor celgroei en functie. Echter, de benaderingen die zijn gebruikt voor de voorbereiding van het vetzuur verschillen, die kan leiden tot niet-fysiologische resultaten. Serumalbumine, een natuurlijke drager voor vetzuren in perifeer bloed van zoogdieren, wordt aanbevolen voor het vormen van een conjugaat complex met het natriumzout van vetzuren te bestuderen van de functie van de vetzuren in de cellen van de zoogdieren, dus het minimaliseren van de toxiciteit van vetzuur zeep. Dus, is een eenvoudige, relatief snelle verwarming en sonicating methode ontwikkeld en gepresenteerd hier voor BSA-fatty acid geconjugeerde vorming. We beschrijven de verzadigde vetzuren, vooral stearic zuur veroorzaken ernstige celdood in muis beenmerg-afgeleide macrofagen die gebruikmaakt van een protocol. We zijn het er verder laten zien dat verzadigde vetzuren-veroorzaakte celdood positief geassocieerd met de geaccumuleerde cellulaire ceramide niveaus wordt. Deze methode kan worden uitgebreid voor studies van de gevolgen van vetzuur op andere cellen van zoogdieren.

Obesitas verhoogt vrije vetzuren concentraties in serum. Als professionele fagocyten duren macrofagen actief vetzuren host homeostase te handhaven. Tijdens deze processen veroorzaken overbelaste lipiden macrofaag celdood. Te dien einde gekweekte we BMDMs in vitro met obesitas niveaus van dieet vetzuren en gemeten macrofaag celdood met behulp van stroom cytometrische kleuring. In vergelijking met de controle van de BSA, verzadigde vetzuren, veroorzaakte in het bijzonder stearic zu...

We illustreren een straight-forward methode om te ontlenen lymfkliertest primaire macrofagen van beenmergcellen en een eenvoudige methode om te bereiden BSA-vetzuur conjugaten. Dan tonen we dat verzadigde vetzuren leiden de dood van de cel van de macrofaag tot kan, en dergelijke celdood positief geassocieerd met cellulaire accumulatie van ceramide niveaus wordt.

Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Het algemene doel van dit experiment, waarbij macrofagen worden behandeld met verzadigde vetzuren, is om aan te tonen dat door verzadigde vetzuren geïnduceerde celdood van macrofagen geassocieerd is met verhoogde cellulaire niveaus van Ceramiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van metabole ontsteking. Zoals:dood en ontsteking geïnduceerd door verzadigde vetzuren.Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige maar gedetailleerde benadering biedt om BSA-vetzuurconjugaten te bepalen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het uitdagend is om een nauwkeurige stabiele BSA-vetzuurconjugaat-oplossing te bereiden met consistente resultaten. Begin deze procedure met het verwijderen van de tibia en femurbotten uit een geëuthaniseerde gezonde wild-type muis van zes tot acht weken oud, zoals beschreven in het tekstprotocol.Snijd beide uiteinden van de tibia en femurbotten open met een schaar en een steriele weefselkweekkap. Spoel de botten met een naald van 25 gauge met PBS plus twee procent foetaal bovien serum in een buisje van 15 milliliter. Centrifugeer de beenmergcellen bij 500 g, vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Breng vervolgens de celpellet in één milliliter rode bloedcellysebuffer om rode bloedcellen minder dan een minuut te lyseren. Verdun de cellen onmiddellijk met negen milliliter 1x PBS. Centrifugeer opnieuw, zoals eerder, en decanteer de supernatant.Breng de celpellet opnieuw in suspensie in 10 milliliter 1x PBS. Filter vervolgens de celsuspensie door steriele 40 micron nylon mesh in een andere buis van 15 milliliter om celdeeltjes en klonters te verwijderen. Na centrifugatie zoals eerder, breng de celpellet in suspensie in 15 milliliter Roswell Park Memorial Institute medium 1640 met vijf procent FBS en 10 microgram per milliliter Gentamicin.Plaats vervolgens de cellen in een 100 millimeter weefselkweekschaal en zet deze in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 60 minuten. Draai voorzichtig de schaal, verwijder de drijvende cellen en tel ze. Plaats vervolgens 6.000.000 cellen in een 100 millimeter schaal met 12 milliliter Macrofaag Differentiëringsmedium en 10 nanogram per milliliter recombinante Muis Macrofaag Kolonie Stimulerende Factor, of MCSF, gedurende twee dagen.Na cultivering gedurende twee dagen in een incubator van 37 graden Celsius met vijf procent CO2, geef elke schaal zes milliliter vers Macrofaag Differentiëringsmedium met 10 nanogram per milliliter MCSF. Op dag vijf, verwijder acht milliliter van het oude medium zonder de cellen te verstoren en voeg 10 milliliter vers Macrofaag Differentiëringsmedium met 10 nanogram per milliliter MCSF toe. Op dag zeven, oogst de beenmerg-afgeleide macrofagen, of BMDM's, met behulp van een cellifter.Bevestig het fenotype van de BMDM's door middel van flowcytometrie, zoals vermeld in het tekstprotocol. Om de BSA-vetzuurconjugaat te bereiden, bereid vijf millimeter individuele natriumzout van vetzuren in twee millimeter BSA voor. Verwarm het mengsel tot 37 graden Celsius of hoger indien nodig.Vervolgens, sonischeer het mengsel van twee millimeter BSA en natriumzout van vetzuren tot een heldere oplossing wordt verkregen. Na sonicatie, filter de vetzuur BSA oplossing, door een 0,22 micron filter. Verdeel vervolgens de gefilterde oplossing in 1,5 milliliter steriele microcentrifugebuisjes.Bewaar de buisjes bij vier graden Celsius voor kortdurend gebruik, of bij min 20 graden Celsius voor langdurige opslag. Er mag geen precipitatie worden waargenomen na opslag bij vier graden Celsius in de koelkast. Plaats de BMDM's in een 24-well weefselkweekplaat met 0,4 miljoen cellen per milliliter in macrofaag differentiëringsmedium.Behandel de cellen met 0,4 millimeter Palmitinezuur en Stearinezuur gedurende 16 tot 24 uur in een incubator van 37 graden Celsius met vijf procent CO2. Gebruik BSA als negatieve controle. Oogst de cellen met een cellifter na de behandeling.Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 g, vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Kleur de cellen met Annexin V-Alexa 488 en 7-AAD in 100 microliter Annexin-V binding buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun het monster met 200 microliter Annexin binding buffer en meng voorzichtig.Bewaar de monsters na de incubatieperiode op ijs. Analyseer de gekleurde cellen zo snel mogelijk door middel van flowcytometrie. Annexin V-Alexa 488 wordt gedetecteerd in het FITC-kanaal en 7-ADD wordt gedetecteerd in het PerCP PerCP-Cy5.5-kanaal.Na behandeling met vetzuren, oogst de cellen zoals eerder. Fixeer vervolgens de cellen in vier procent Paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Was het monster met één milliliter 1x PBS voordat het monster wordt gecentrifugeerd zoals eerder.Na het decanteren van het supernatant, kleurt u de cellen met Anti-Ceramide Primair Antilichaam in 100 microliter 1x Permeabilisatie Buffer gedurende 30 minuten. Na het wassen en centrifugeren van de cellen zoals eerder, kleurt u de cellen met Anti-Muis IgM Secundair Antilichaam in 100 microliter 1x Permeabilisatie Buffer gedurende 30 minuten. Was en centrifugeer de cellen opnieuw zoals eerder.Voeg vervolgens 250 microliter 1x PBS toe en analyseer de gekleurde cellen door middel van flowcytometrie. BMDM's werden in-vitro gekweekt met obese niveaus van voedingsvetzuren en macrofaagceldood werd gemeten met behulp van flowcytometrisch kleuring. In vergelijking met de BSA-controle, induceerden verzadigde vetzuren, met name stearinezuren, significante celdood van BMDM's.Dode cellen werden getoond als dubbel positieve populatie gekleurd door Annexin V en 7-AAD. Bovendien is celdood geïnduceerd door verzadigde vetzuren positief geassocieerd met verhoogde cellulaire Ceramideniveaus in macrofagen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u BSA-vetzuurconjugaten kunt bereiden en macrofagen kunt behandelen met BSA-vetzuurconjuga

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

This video demonstrates the assessment of multiple caspase activations in bone marrow-derived macrophages through stimulation with the influenza virus. Following macrophage lysis, heat-inactivation of lysate, and centrifugation, intracellular caspases are collected for subsequent immunological analysis.

Assessment of the Activation of Multiple Caspases in Macrophages

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen. We gebruiken flowcytometrie om Annexine V en 7-AAD dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren, waarbij we de hele cel gebruiken en scanning-elektronenmicroscopie gebruiken om de morfologie van het celmembraan te observeren.

LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Leer hoe verzadigde vetzuren macrofaagceldood induceren via ceramide-accumulatie in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar metabole ontsteking en obesitas.

Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood

Meer video's verkennen