Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

Het algemene doel van deze procedure is om voldoende cellen te verkrijgen uit dorsale wortelganglia en heupzenuwen van een individuele muis om flowcytometrieanalyse van de cellen uit te voeren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat perifeer neuronaal materiaal grote hoeveelheden puin genereert bij vertering. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat verschillende markers tegelijkertijd kunnen worden gebruikt om meerdere celtypen te identificeren.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van ontsteking en immunopathologie tijdens neuropathie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in muismodellen, kan deze ook met kleine aanpassingen worden toegepast op andere organismen, zoals menselijke en varkenszenuwen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in de methode het moeilijk vinden vanwege de grote hoeveelheden puin die worden gegenereerd door de vertering.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de dissectie- en celdissociatiestap moeilijk uit te voeren zijn omdat het neuronale materiaal per muis beperkt is. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we een protocol zagen dat zwanencellen uit de heupzenuw isoleerde vanuit het lab van Steve Lacroix. Om te beginnen, bereid de muis voor zoals beschreven in het begeleidende tekstprotocol en plaats deze met de buikzijde naar beneden terwijl de onderste ledematen worden uitgerekt.

Gebruik vervolgens een paar pincetten om de volledige heupzenuwen bilateraal te dissecteren. Begin met het scheiden van het spierweefsel van de bovenste dorsale dij en volg de zenuw omhoog langs de wervelkolom. Snijd de zenuw waar deze uit de wervelkolom komt en onmiddellijk boven het kniegewricht aan de andere kant.

Breng vervolgens de verwijderde zenuwen over naar een buisje van 1,5 milliliter met 1 milliliter ijskoud PBS. Bewaar de zenuwen op ijs. Isolateer vervolgens het dorsale wortelganglion.

Begin met het parallel snijden van de ribben met en dicht bij de wervelkolom aan beide kanten. Snijd vervolgens dwars door de wervelkolom ter hoogte van de dijbeenderen aan de achterkant en dicht bij de schedel aan de voorkant. Verwijder de wervelkolom en gebruik irisschaar om alle spieren, vet en ander zacht weefsel van de wervelkolom weg te snijden.

Plaats vervolgens de wervelkolom met de buikzijde naar boven en open deze vanaf het caudale uiteinde door een van de uiteinden van de schaar in het wervelkanaal op de 12 uur positie te schuiven en de botten door te knippen. Ga door totdat de hele wervelkolom is doorgesneden, herhaal deze procedure op de 6 uur positie totdat de wervelkolom is gehalveerd. Scheid de twee helften van de wervelkolom, plaats vervolgens het monster onder een dissectiemicroscoop.

Verwijder het ruggenmerg om de spinale zenuwen bloot te leggen, lokaliseer vervolgens en verwijder de lumbale dorsale wortelganglia door voorzichtig aan de dorsale wortel te trekken om deze in de wervelkanalen te trekken. Gebruik vervolgens irisschaar om de zenuwen en het bindweefsel rond het dorsale wortelganglion af te knippen. Gebruik vervolgens pincetten om de dorsale wortelganglia over te brengen naar een buisje van 1,5 milliliter en bewaar ze op ijs.

Om de dorsale wortelganglia te lokaliseren, ze te extraheren zonder ze te beschadigen en ze los te maken van de spinale zenuw, vereist oefening en vaardigheid. Bereid een verteringsmedium voor, supplementeer het met honderd microgram per milliliter deoxyribonuclease en bewaar het op ijs. Voeg vervolgens 500 microliters verteringsmedium toe aan elk van de buisjes met de heupzenuwen en de dorsale wortelganglia.

Voor de heupzenuwen, hak het materiaal 15 tot 20 keer met een paar springschaar en incubeer vervolgens de weefselsuspensies in een schuddende incubator bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten met zachte agitatie. Na incubatie, tritureer de celsuspensie herhaaldelijk door een pipettepunt van 1.000 microliter om mechanisch eventueel onvolledig verteerd weefsel te scheiden. Herhaal de trituratie door een pipettepunt van 1.000 microliter.

Breng vervolgens het monster nog 10 minuten aan bij 37 graden Celsius met zachte agitatie. Bereid de ijskoude FACS-buffer voor en gebruik deze om een roestvrijstalen zeef met een maaswijdte van 140 micron in een petrischaal van 60 millimeter op ijs te spoelen en te weken. Gebruik vervolgens stompe pincetten om de 140 micron zeeffilter boven de petrischaal te houden en voer de weefselsuspensies herhaaldelijk door het filter.

Verzamel de celsuspensie uit de petrischaal en breng deze over naar hetzelfde buisje van 1,5 milliliter dat op ijs is bewaard. Druk eventueel onvolledig verteerd weefsel dat op het filter achterblijft door herhaalde trituratie met een pipettepunt van 1.000 microliter door. Spoel vervolgens de zeeffilter twee keer met 500 microliters FACS-buffer en combineer deze met de celsuspensie in het buisje van 1,5 milliliter.

Als te veel van het monster onvolledig is verteerd en door het metalen gaas is gegaan, kan celverlies optreden en kan flowcytometrieanalyse onmogelijk zijn. Centrifugeer de celsuspensies en gooi het supernatant weg. Breng vervolgens het celpelletje opnieuw op in een milliliter FACS-buffer.

Herhaal deze wasstap één keer, breng het laatste celpelletje opnieuw op in 150 tot 350 microliters FACS-buffer. De cellen zijn nu klaar voor kleuring. Selecteer op de computer de juiste kanalen voor detectie van de geïnteresseerde fluoroforen, de juiste stroomsnelheid van de monsters en het totale aantal te verzamelen gebeurtenissen per monster.

Het minimum aantal gebeurtenissen zou een miljoen moeten zijn. Maak vervolgens scatterplots onder een globaal werkblad van de side scatter A versus de Forward Scatter A evenals voor elke geïnteresseerde fluorofoor versus de Forward Scatter A. Maak ook een statistische weergave die het aantal gebeurtenissen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor de geselecteerde fluoroforen weergeeft. Bepaal de ouderpoort, P1, op basis van de scatterplot van DAPI alleen kleuringscontroles.