Name: Gebruik van Synaptic zink histochemie onthullen verschillende regios en Laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer een histochemische methode om synaptische zinkpatronen te visualiseren in ferret hersensnedes. Deze techniek onderscheidt lagen en regio's in ontwikkelende en volwassen hersenen betrouwbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Center for onderzoeksmiddelen (2G12RR03060-26A1); Het National Institute on minderheid gezondheid en gezondheid verschillen (8G12MD007603-27) van de National Institutes of Health; Professioneel personeel Congres-City University of New York (PSC-CUNY); en faculteit Research Grant (FRG II) Amerikaanse Universiteit van Sharjah. Wij danken Vidyasagar Sriramoju voor het introduceren van ons aan deze methoden.

<ol><li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026685">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li>
<li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li>
<li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li>
<li>Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-positive+boutons+in+the+cerebral+cortex+of+lizards+show+glutamate+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity.</a> J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).</li>
<li>Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+localization+of+synaptic+zinc+in+the+developing+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex.</a> J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).</li>
<li>Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse.</a> Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).</li>
<li>Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+%28Macropus+parma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li>
<li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase%2C+zinc%2C+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li>
<li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00543951">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li>
<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li>
<li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li>
<li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17%2C+18%2C+19+and+21+in+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li>
<li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li>
<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
<li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+%28Sciurus+carolinensis.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li>
<li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li>
<li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li>
<li>Timm, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00665092">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie maakt gebruik van een histochemische techniek gebaseerd op een gewijzigde versie van de Danscher (1982) methode10, waarbij de lokalisatie van de synaptische zink kan worden gedetecteerd en gevisualiseerd in de hersenen. Deze methode werkt in wezen door het injecteren van het dier met de zink complexvormer Natriumseleniet (nb2van SeO3) (15 mg/kg). Na injectie, de seleniet reist naar de hersenen en bindt aan gratis zink die is gelokaliseerd aan de presynaptisc...

Histologische vlekken hebben van oudsher gebruikt om te helpen bij de identificatie van de corticale gebieden in verschillende soorten door te onthullen van de verschillen in architectonische kenmerken. Het gecombineerd gebruik van histochemische technieken zoals voor Nissl-substantie, cytochrome oxidase (CO) reactiviteit of myeline kan afwerpen als ze soortgelijke areal grenzen in het volwassen brein onthullen. Echter, deze histochemische vlekken niet altijd adequaat onthullen duidelijke grenzen tussen corticale gebieden en lagen in de onvolgroeide hersenen.
In het centrale zenuwstelsel heeft zink verscheidene kritieke functies waarin het stabiliseren van de DNA-structuur, die fungeert als een enzym cofactor, deelnemen aan diverse regelgevende functie, en fungeert als een neuromodulator door haar aanwezigheid in synaptische vesikels 1. synaptic zink is uniek, omdat het kan worden gevisualiseerd met behulp van de methoden van het histologische, overwegende dat eiwit-gebonden zink niet gevisualiseerde2. Deze functie heeft benut om te onthullen het patroon van de synaptische zink in verschillende corticale gebieden, en synaptische zink histochemie is gebruikt in een aantal studies. Een subset van glutamaterge neuronen in de cortex cerebri bevatten zink in de presynaptische blaasjes binnen hun axon terminals3,4. Histochemische studies is gebleken een heterogene verdeling van synaptic zink in de hersenschors5,6,7. Er lijkt te zijn van een verschillende areal en laminaire verdeling van histochemically reactieve zink in verschillende corticale gebieden (bijvoorbeeldvisuele versus Somatosensorische cortex) of lagen (b.v.zink niveau in de supragranular en infragranular lagen van primaire visuele cortex zijn aanzienlijk hoger dan in thalamocortical invoerlaag IV met relatief lage synaptic zink niveaus)5,8,9. De heterogeniteit in synaptic zink kleuring waargenomen in de cortex is vooral voordelig als het vergemakkelijkt areal en laminaire identificatie.
Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een synaptic zink histochemische procedure, die een gewijzigde versie van Danscher van 1982 methode10 is. Deze methode maakt gebruik van seleniet geïnjecteerd intraperitoneally (IP) in dieren als een chelaatvormer. De seleniet reist naar de hersenen om te reageren met zwembaden gratis zink in de blaasjes van een subset van glutamaterge synapsen in de hersenen gevonden. Deze reactie resulteert in een neerslag die vervolgens kan worden verbeterd door zilveren ontwikkeling2,10,11.
Deze procedure blijkt laminaire en areal patronen van synaptische zink kleuring; densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van deze patronen zowel kwalitatief en kwantitatief in de volwassen en onvolgroeide hersenen effecten van andere ingrepen, zoals zintuiglijke, milieu, farmacologische of genetische manipulaties te bestuderen. Bovendien kan een ook willen beoordelen van mogelijke ontwikkelings veranderingen in de distributie van synaptic zink in andere corticale en subcorticale structuren in andere modelsystemen. De kwantitatieve gegevens die densitometric analyse in deze methode verschaft kan nuttig zijn voor de volgende ontwikkeling van de hersenen na verloop van tijd. Dit protocol biedt een metgezel te andere immuno - histochemische markeringen te onthullen van laminaire en areal grenzen.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (Euthanasie-oplossing)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml injectieflacons</td></tr><tr><td>Xylazin (Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml injectieflacons</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Verdund tot 4%</td></tr><tr><td>Gom arabicum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Zilverlactaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Visgelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td>(Type III, uit paardenhart)</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Gebruikt voor dehydratie voorafgaand aan het ophangen van de dia</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Mat glazen dia's</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Voor het samenstellen van afbeeldingen</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Gratis software kan worden gedownload op http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td><td>Voor densometrische metingen</td></tr><tr><td>Kunststof lade</td><td>Elke standaard kunststof lade kan worden gebruikt</td><td></td><td>om dia's in ontwikkelingsoplossing te onderdompelen</td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>Elke standaard verwarmingsplaat kan worden gebruikt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van synaptic zink histochemie onthullen verschillende regio's en laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Karakterisering van de hersenen van de anatomische en functionele organisatie en ontwikkeling vereist nauwkeurige identificatie van afzonderlijke neurale circuits en regio's in de onvolwassen en volwassen brein. Hier beschrijven we een zink-histochemische kleuring-procedure die verschillen in kleuring patronen tussen verschillende lagen en hersengebieden onthult. Anderen hebben gebruikt deze procedure niet te onthullen van de verdeling van de zink-bevattende neuronen en circuits in de hersenen, maar ook om af te bakenen met succes areal en laminaire grenzen in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen in verschillende soorten. Hier we illustreren dit kleuring procedure met beelden uit ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen. We onthullen een zink-kleuring patroon dat als een anatomische markering van gebieden en lagen fungeert, en op betrouwbare wijze kan worden gebruikt om te onderscheiden van de visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen visuele cortex. Het hoofddoel van dit protocol is te presenteren een histochemische methode waarmee de nauwkeurige identificatie van lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen waar andere methoden niet in slaagt om dat te doen. Subsidiair, in combinatie met densitometric beeldanalyse, deze methode maakt het mogelijk om te beoordelen van de verdeling van de synaptische zink te onthullen van eventuele veranderingen in de gehele ontwikkeling. Dit protocol beschrijft in detail de reagentia, instrumenten en stappen die nodig zijn om achtereenvolgens vlek bevroren hersenen secties. Hoewel dit protocol wordt beschreven met behulp van ferret hersenweefsel, kan het gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in knaagdieren, katten en apen ook zoals in andere hersengebieden.

De grote stappen die betrokken zijn bij dit protocol om vlek hersenen secties voor synaptic zink worden gepresenteerd in een stroomdiagram in Figuur 1. Het protocol kan worden onderverdeeld in drie fasen: 1) perfusie en weefsel collectie 2) weefsel voorbereiding en kleuring en 3) zink histochemie. Kort, tijdens de eerste fase van het protocol, het dier wordt verdoofd en IP met de juiste dosis Natriumseleniet geïnjecteerd. Na een voldoende lange tijdsperiode (...

We beschrijven een histochemische procedure die onthult karakteristiek laminaire en areal zink kleuring patronen in verschillende hersengebieden. Het patroon van zink-kleuring kan worden gebruikt in combinatie met andere anatomische markeringen op betrouwbare wijze onderscheiden lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen brein.

Gebruik van Synaptic zink histochemie onthullen verschillende regio's en Laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Het algemene doel van deze methode is het uitvoeren van histochemische kleuring op bevroren hersensecties van fretten om de gebruikte synaptische zinkkleuringspatroon te illustreren bij het onderscheiden van verschillende regio's en lagen in de zich ontwikkelende en volwassen hersenen. Deze methode kan helpen om sleutelvragen te beantwoorden, zoals de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in het synaptische zinkkleuringspatroon tussen verschillende hersengebieden en lagen. Het grote voordeel is dat deze techniek eenvoudig en betrouwbaar is en het mogelijk maakt om verschillende regio's en lagen in de zich ontwikkelende en volwassen hersenen te identificeren op basis van unieke kleuringspatronen.Hoewel deze methode is gebruikt om inzicht te geven in het afbakenen van gebieden en lagen in de visuele cortex van de wilde fret, kan het ook worden gebruikt om lagen in verschillende hersengebieden van knaagdieren, katten of primaten te differentiëren. Om 200 milliliter van de ontwikkelaarsoplossing te bereiden, voeg je langzaam 40 gram gom arabicum toe aan 120 milliliter heet water en blijf roeren met een glazen staaf tot het volledig is opgelost. Laat het vervolgens een paar minuten afkoelen en filter het vervolgens door zes tot acht lagen gaasdoek in een trechter.Voeg vervolgens 5,04 gram citroenzuur en 4,7 gram natriumcitraat toe aan 20 milliliter gedistilleerd water en los op om de citraatbuffer te maken. Voeg vervolgens 1,7 gram hydrochinon toe aan 30 milliliter verwarmd gedistilleerd water. Voeg 0,22 gram zilverlactaat toe aan 30 milliliter water om de zilverlactaat-oplossing te maken.Meng in de volgende volgorde de gom arabicum, citraatbuffer, hydrochinon en tenslotte de zilverlactaat-oplossingen om de ontwikkelaarsoplossing te bereiden en bewaar deze in het donker. Om deze procedure te starten, injecteer je een dosis van 15 milligram per kilogram lichaamsgewicht natriumselenietoplossing, een zinkchelaat, intraperitoneaal in de geanesthetiseerde fret. Wacht vervolgens 60 tot 90 minuten tot de natriumselenietoplossing de hersenen bereikt.Injecteer vervolgens een overdosis van 100 milligram per kilogram fenobarbital intraperitoneaal om het dier te euthanaseren en wacht enkele minuten tot euthasol werkt. Voer transcardial perfusie uit op de geëuthanaseerd fret eerst met normale zoutoplossing gedurende één minuut, en vervolgens met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten. Gebruik vervolgens een fixeermiddel met sucrose om de totale fixatieprocedure in één uur te voltooien.Gebruik een scalpel om een middenlijnsnede te maken vanaf de neus tot de nek om de schedel bloot te leggen. Verwijder voorzichtig de hersenen en gebruik vervolgens een scalpelblad om de hersenhelften te scheiden. Snijd vervolgens het achterste deel af van de rest van de hersenen en post-fixeer gedurende twee tot vier uur.Laat de hersenen zinken door het weefsel in 30% sucrose-oplossing in 0,1 molaire fosfaatbuffer te plaatsen. Nadat de hersenen zijn gezonken, gebruik je een glijdende vriesmicrotoom om semi-tangentiale 40 micrometer dikke secties door de visuele cortex te maken. Gebruik een penseel om alle hersensecties te verzamelen en plaats ze in een tacklebox gevuld met fosfaat gebufferd zoutoplossing.Montageer vervolgens snel een of twee reeksen hersensecties op met eiwit gecoate slides. Bewaar de slides een nacht bij kamertemperatuur om te drogen. Nadat de slides zijn opgedroogd, dompel ze gedurende 15 minuten in absoluut alcohol.Wacht vervolgens een uur om de slides volledig te laten drogen bij kamertemperatuur. Dompel de secties snel in een 1% gelatine-oplossing gedurende 10 seconden en spoel ze vervolgens voorzichtig af. Bewaar de secties bij kamertemperatuur om 's nachts te drogen.Gebruik een plastic schaal om de slides naast elkaar te rangschikken. Giet vervolgens de ontwikkelingsoplossing erover en zorg ervoor dat de slides volledig ondergedompeld zijn. Vergeet niet om de secties elke 30 minuten te controleren op de ontwikkeling van de reactie.Als de slides goed zijn gekleurd, verwijder je de op de slide gemonteerde secties uit de schaal en plaats je de slides op een sliderek. Gebruik een groot glazen kleuringsvat om de slides in het sliderek onder warm stromend water gedurende 10 minuten te wassen om de gelatinelaag en de buitenste zilverafzetting te verwijderen. Na het drogen van de slides bij kamertemperatuur, dehydrateer ze gedurende vijf minuten in 100% ethanol en maak ze vijf minuten helder in xyleen.Plaats ten slotte een dekglas met montagemedium op de slide. Gebruik een helderveldmicroscoop om de secties te bekijken en foto's te maken van de gebieden van belang. Selecteer zinkgekleerde secties van fotomicrografen van gebieden van belang om willekeurig corticale kolommen van ongeveer 450 micrometer breedte te kiezen.Kies in elk gebied van belang een geschikt aantal steekproefkolommen uit verschillende hersensecties. Breng vervolgens de koloombeelden over naar een beeldverwerkingssoftware. Gebruik in de software de rechthoekige sectietool om de volledige corticale kolom te omvatten.Gebruik vervolgens de invert-tool om het contrast van de afbeelding om te keren. Gebruik vervolgens de plotprofieltool om een tweedimentionaal grafiek van de pixelintensiteiten langs de lijn te maken om optische dichtheidsprofielen uit de beelden te produceren. Gebruik ten slotte de plotprofielopties om het plotprofielgrafiek om te zetten in een verticaal profiel.Klik vervolgens nogmaals op plotprofiel. Fotomicrografen van semi-tangentiale zinkgekleerde secties van de hersenen van een jonge fret tonen de karakterisering van overgeverfde en ondergeverfde weefsels. Overgeverfd weefsel ontwikkelt een zeer donkerbruine kleur met onvoldoende laminaire variatie en dicht geverfd witte stof.In tegenstelling daarmee ontwikkelt ondergeverfd weefsel een lichtbruine kleur met minimaal geverfd witte stof. Fotomicrografen van semi-tangentiale secties tonen synaptisch zink in cytochroomoxidasekleuring in visuele corticale gebieden van een vol

use-synaptic-zinc-histochemistry-to-reveal-different-regions-laminae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.

Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Het protocol hier geschetste beschrijft de immunofluorescentie analyse, biocytin herstel en kwalitatief hoogwaardige reconstructies van hippocampal CA2 interneuronen na de intracellulaire elektrofysiologische opnames in vitro waardoor neuronale karakterisering en uiteindelijk prima neuronale anatomie worden bestudeerd.

Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen

De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.

Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

Cryo-sectie-dissectie maakt verse, bevroren bereiding van de grootste neurogene niche in de muizenhersenen mogelijk voor diepe kwantitatieve proteoomanalyse. De methode is nauwkeurig, efficiënt en veroorzaakt minimale weefselverstoring. Daarom is het bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de moleculaire micro-omgeving van deze niche, evenals andere organen, regio's en soorten.

Cryo-sectie dissectie van de volwassen subependymale zone voor nauwkeurige en diepe kwantitatieve proteoomanalyse

Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om circadiane veranderingen in de cortex van de muizentrommel te kwantificeren, voornamelijk gericht op het aantal synapsen en de morfologie van de dendritische wervelkolom.

Transmissie-elektronenmicroscopie als visualisatietechniek voor analyse van circadiane synaptische plasticiteit in de cortex van de muizenloop

Leer een histochemische methode om synaptische zinkpatronen te visualiseren in ferret hersensnedes. Deze techniek onderscheidt lagen en regio's in ontwikkelende en volwassen hersenen betrouwbaar.

Gebruik van Synaptic zink histochemie onthullen verschillende regio's en Laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein

Meer video's verkennen