Gelijktijdige Mapping en kwantificatie van Ribonucleotides in menselijke mitochondriaal DNA

Het algemene doel van dit experiment is om de locatie van geïntegreerde ribonucleotiden op single nucleotideresolutieniveau in kaart te brengen en om het aantal ribonucleotiden dat in menselijk mitochondriaal DNA aanwezig is te kwantificeren. Deze methode kan helpen om sleutelvragen te beantwoorden over DNA-integriteit, DNA-replicatiemechanismen, DNA-reparatiemechanismen en hoe defecten in een van deze mechanismen ziekte kunnen veroorzaken. Het grote voordeel van deze methode is dat zowel de locatie als het aantal geïntegreerde ribonucleotiden in mitochondriaal DNA in één experiment kan worden bepaald.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in het ribonucleotidegehalte in menselijk mitochondriaal DNA, kan het ook worden toegepast om nucleair DNA en ribonucleotidegehalte in de sequentiegenomen van andere modelorganismen te bestuderen. Genomisch DNA dat eerder werd geïsoleerd uit HeLa-cellen en beschreven in secties twee en drie van het tekstprotocol, wordt gebruikt in dit experiment. Om het DNA te verteren, meng voorzichtig het volgende in een microfugebuis.

Een microgram DNA, vijf microliter 10X buffer 3.1, een microliter HincII en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 50 microliter. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer het verteren is voltooid, voeg 1,8 volumes paramagnetische kralen toe aan elk monster, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Plaats de buizen gedurende vijf minuten op een magnetische rek om de kralen te bezinken en verwijder en gooi het supernatant weg. Was de bezinking met 150 microliter 70%ethanol gedurende ongeveer 30 seconden, verwijder en gooi het supernatant weg. Herhaal de wassing met 200 microliter 70%ethanol gedurende nog eens 30 seconden.

Laat de monsters bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 15 tot 20 minuten drogen. Verwijder vervolgens de buizen van de magnetische rek. Eluteer elke bezinking in 45 microliter elutiebuffer, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten.

Bezink de kralen op de magnetische rek en breng 45 microliter van elk DNA-monster over naar een nieuwe buis. Voeg aan elk van de 45 microliter geïsoleerd of gezuiverd DNA vijf microliter drie molair kaliumhydroxide of vijf microliter drie molair kaliumchloride toe, waardoor een totaalvolume van 50 microliter ontstaat. De acht reacties worden samengevat in deze tabel.

Incubeer in een hybridisatieoven bij 55 graden Celsius gedurende twee uur, en incubeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op ijs. Bezinken de DNA door 10 microliter drie molair natriumacetaat bij pH 5,2 en 125 microliter koude 100%ethanol toe te voegen en gedurende vijf minuten op ijs in te cuberen. Bezinken de DNA door centrifugeren bij 21.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gooi het supernatant weg en was elke DNA-bezinking met 250 microliter koude 70%ethanol, centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg. Laat de bezinking in de open buis gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten drogen, totdat al het zichtbare vocht is verdampt. Voeg als laatste 20 microliter elutiebuffer toe en laat het DNA-bezinking oplossen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Begin met deze procedure door de reactiemix voor elk monster als mastermix voor te bereiden. Voeg voor elk monster 2,5 microliter 10x T4 polynucleotidekinasereactiebuffer, 2,5 microliter ATP en een microliter drie prime fosfatase-min T4 polynucleotidekinase toe. Breng 19 microliter van elk DNA-monster over in een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler.

Koel vervolgens de DNA-monsters op ijs en voeg zes microliter van de bereide reactiemix toe aan elk monster. Incubeer de reactiemixen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende 20 minuten om de reactie te stoppen. Zuiver het DNA met behulp van paramagnetische kralen, zoals eerder aangetoond, maar eluteer met 14 microliter elutiebuffer.

Bereid de reactiemix vooraf als mastermix, bestaande uit het volgende voor elk monster. Vijf microliter 10x T4 RNA ligase reactiebuffer, vijf microliter hexamminekobalt(III)chloride, 0,5 microliter ARC140 oligonucleotide, 0,5 microliter ATP en 25 microliter 50%PEG 8000. Meng goed door pipetteren.

Breng 13 microliter van elk gezuiverd DNA over naar een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler. Koel het DNA op ijs en voeg vervolgens 36 microliter reactiemix toe aan elk monster, meng door pipetteren en centrifugeer kort. Voeg een microliter T4 RNA ligase toe aan elke reactie, meng door pipetteren en centrifugeer kort.

Incubeer de monsters gedurende de nacht op kamertemperatuur in het donker. Wanneer de enkelstrengs DNA-ligatie voltooid is, zuiver het DNA zoals eerder aangetoond, maar gebruik 0,8 volumes paramagnetische kralen en bezink de kralen gedurende 10 minuten. Eluteer in 20 microliter elutiebuffer en breng 20 microliter van elk DNA-monster over naar een nieuwe buis van 200 microliter.

Herhaal de zuivering met 0,8 volumes paramagnetische kralen en eluteer in 14 microliter elutiebuffer. Bereid voor elk monster de reactiemix voor als mastermix bestaande uit twee microliter 10x T7 DNA polymerase reactiebuffer, twee microliter ARC76/77, twee microliter dNTP's en 0,8 microliter BSA. Breng 12,8 microliter gezuiverd DNA over naar een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler.

Koel het DNA op ijs en voeg vervolgens 6,8 microliter reactiemix toe aan elk monster, meng door pipetteren, centrifugeer kort en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 0,4 microliter T7 DNA polymerase toe aan elke reactie en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na het zuiveren van het DNA met behulp van paramagnetische kralen, eluteer in 11 microliter elutiebuffer.

Om de PCR-amplificatie te starten, bereid de reactiemix afz