Gelijktijdige Mapping en kwantificatie van Ribonucleotides in menselijke mitochondriaal DNA
November 14th, 2017
Hier beschrijven we een methode die zich lenen voor het gelijktijdig kwantificeren en genoom-brede kaart ribonucleotides in zeer intact DNA op single-nucleotide de resolutie, enzymatische splitsing van genomic DNA te combineren met de alkalische hydrolyse en de daaropvolgende 5´-end sequencing.
Het algemene doel van dit experiment is om de locatie van geïntegreerde ribonucleotiden op single nucleotideresolutieniveau in kaart te brengen en om het aantal ribonucleotiden dat in menselijk mitochondriaal DNA aanwezig is te kwantificeren. Deze methode kan helpen om sleutelvragen te beantwoorden over DNA-integriteit, DNA-replicatiemechanismen, DNA-reparatiemechanismen en hoe defecten in een van deze mechanismen ziekte kunnen veroorzaken. Het grote voordeel van deze methode is dat zowel de locatie als het aantal geïntegreerde ribonucleotiden in mitochondriaal DNA in één experiment kan worden bepaald.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in het ribonucleotidegehalte in menselijk mitochondriaal DNA, kan het ook worden toegepast om nucleair DNA en ribonucleotidegehalte in de sequentiegenomen van andere modelorganismen te bestuderen. Genomisch DNA dat eerder werd geïsoleerd uit HeLa-cellen en beschreven in secties twee en drie van het tekstprotocol, wordt gebruikt in dit experiment. Om het DNA te verteren, meng voorzichtig het volgende in een microfugebuis.
Een microgram DNA, vijf microliter 10X buffer 3.1, een microliter HincII en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 50 microliter. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer het verteren is voltooid, voeg 1,8 volumes paramagnetische kralen toe aan elk monster, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Plaats de buizen gedurende vijf minuten op een magnetische rek om de kralen te bezinken en verwijder en gooi het supernatant weg. Was de bezinking met 150 microliter 70%ethanol gedurende ongeveer 30 seconden, verwijder en gooi het supernatant weg. Herhaal de wassing met 200 microliter 70%ethanol gedurende nog eens 30 seconden.
Laat de monsters bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 15 tot 20 minuten drogen. Verwijder vervolgens de buizen van de magnetische rek. Eluteer elke bezinking in 45 microliter elutiebuffer, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten.
Bezink de kralen op de magnetische rek en breng 45 microliter van elk DNA-monster over naar een nieuwe buis. Voeg aan elk van de 45 microliter geïsoleerd of gezuiverd DNA vijf microliter drie molair kaliumhydroxide of vijf microliter drie molair kaliumchloride toe, waardoor een totaalvolume van 50 microliter ontstaat. De acht reacties worden samengevat in deze tabel.
Incubeer in een hybridisatieoven bij 55 graden Celsius gedurende twee uur, en incubeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op ijs. Bezinken de DNA door 10 microliter drie molair natriumacetaat bij pH 5,2 en 125 microliter koude 100%ethanol toe te voegen en gedurende vijf minuten op ijs in te cuberen. Bezinken de DNA door centrifugeren bij 21.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Gooi het supernatant weg en was elke DNA-bezinking met 250 microliter koude 70%ethanol, centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg. Laat de bezinking in de open buis gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten drogen, totdat al het zichtbare vocht is verdampt. Voeg als laatste 20 microliter elutiebuffer toe en laat het DNA-bezinking oplossen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Begin met deze procedure door de reactiemix voor elk monster als mastermix voor te bereiden. Voeg voor elk monster 2,5 microliter 10x T4 polynucleotidekinasereactiebuffer, 2,5 microliter ATP en een microliter drie prime fosfatase-min T4 polynucleotidekinase toe. Breng 19 microliter van elk DNA-monster over in een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler.
Koel vervolgens de DNA-monsters op ijs en voeg zes microliter van de bereide reactiemix toe aan elk monster. Incubeer de reactiemixen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende 20 minuten om de reactie te stoppen. Zuiver het DNA met behulp van paramagnetische kralen, zoals eerder aangetoond, maar eluteer met 14 microliter elutiebuffer.
Bereid de reactiemix vooraf als mastermix, bestaande uit het volgende voor elk monster. Vijf microliter 10x T4 RNA ligase reactiebuffer, vijf microliter hexamminekobalt(III)chloride, 0,5 microliter ARC140 oligonucleotide, 0,5 microliter ATP en 25 microliter 50%PEG 8000. Meng goed door pipetteren.
Breng 13 microliter van elk gezuiverd DNA over naar een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler. Koel het DNA op ijs en voeg vervolgens 36 microliter reactiemix toe aan elk monster, meng door pipetteren en centrifugeer kort. Voeg een microliter T4 RNA ligase toe aan elke reactie, meng door pipetteren en centrifugeer kort.
Incubeer de monsters gedurende de nacht op kamertemperatuur in het donker. Wanneer de enkelstrengs DNA-ligatie voltooid is, zuiver het DNA zoals eerder aangetoond, maar gebruik 0,8 volumes paramagnetische kralen en bezink de kralen gedurende 10 minuten. Eluteer in 20 microliter elutiebuffer en breng 20 microliter van elk DNA-monster over naar een nieuwe buis van 200 microliter.
Herhaal de zuivering met 0,8 volumes paramagnetische kralen en eluteer in 14 microliter elutiebuffer. Bereid voor elk monster de reactiemix voor als mastermix bestaande uit twee microliter 10x T7 DNA polymerase reactiebuffer, twee microliter ARC76/77, twee microliter dNTP's en 0,8 microliter BSA. Breng 12,8 microliter gezuiverd DNA over naar een nieuwe buis van 200 microliter en denatureer gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius in een thermocycler.
Koel het DNA op ijs en voeg vervolgens 6,8 microliter reactiemix toe aan elk monster, meng door pipetteren, centrifugeer kort en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 0,4 microliter T7 DNA polymerase toe aan elke reactie en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na het zuiveren van het DNA met behulp van paramagnetische kralen, eluteer in 11 microliter elutiebuffer.
Om de PCR-amplificatie te starten, bereid de reactiemix afz
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om ribonucleotiden in zeer intact DNA tegelijkertijd te kwantificeren en genome-wide in kaart te brengen met een resolutie van één nucleotide. De techniek combineert enzymatische splitsing van genomisch DNA met alkalische hydrolyse en daaropvolgende 5´-eind sequencing.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Molecuulbiologie
- DNA-reparatiemechanismen
Achtergrond
- Het begrijpen van de incorporatie van ribonucleotiden in DNA is cruciaal voor het bestuderen van DNA-integriteit.
- Ribonucleotiden kunnen de DNA-replicatie en reparatiemechanismen beïnvloeden.
- Deficiënties in deze processen zijn gekoppeld aan verschillende ziekten.
- Deze methode kan worden toegepast op zowel mitochondriaal als nucleair DNA.
Doel van het onderzoek
- De locatie van geïncorporeerde ribonucleotiden in menselijk mitochondriaal DNA in kaart brengen.
- Het aantal ribonucleotiden in het DNA kwantificeren.
- Inzichten bieden in DNA-integriteit en de implicaties ervan voor ziekten.
Gebruikte methoden
- Enzymatische vertering van genomisch DNA met behulp van HincII.
- Zuivering van DNA met behulp van paramagnetische kralen.
- Hybridisatie- en ligatiereacties voor DNA-voorbereiding.
- PCR-amplificatie om voldoende DNA voor sequencing te genereren.
Belangrijkste resultaten
- De methode identificeert met succes de locatie van ribonucleotiden met een resolutie van één nucleotide.
- Kwantitatieve analyse onthult het aantal ribonucleotiden in mitochondriaal DNA.
- De verkregen inzichten kunnen informatie verschaffen over DNA-replicatie en reparatiemechanismen.
- De techniek is aanpasbaar voor gebruik in andere modelorganismen.
Conclusies
- Deze methode vergroot het begrip van de incorporatie van ribonucleotiden in DNA.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van DNA-integriteit en bijbehorende ziekten.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot verschillende genomische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial DNA, addressing a critical gap in DNA integrity assessment. By providing single-nucleotide resolution and absolute quantification, it supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. The approach enhances predictive confidence in studying replication and repair mechanisms linked to mitochondrial dysfunction and disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ribonucleotide incorporation patterns to clarify mechanisms of DNA replication and repair.
- Operational Value: Provides quantitative readouts that support functional target validation and biological de-risking of nucleic acid metabolism pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized read counts that serve as quantitative endpoints for assessing ribonucleotide levels across experimental conditions.
- Operational Value: Utilizes standardized enzymatic digestion and ligation workflows compatible with next-generation sequencing platforms for reproducible assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links ribonucleotide distribution to mitochondrial genome integrity, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of DNA lesion accumulation as a biomarker for preclinical safety and efficacy evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical development by providing quantitative DNA integrity data that informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on ribonucleotide-induced replication stress and repair pathway activation.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized quantitative outputs for compound effect assessment on DNA incorporation rates.
- Analytics: Produces strand-specific, genome-normalized ribonucleotide frequencies enabling cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects mitochondrial DNA ribonucleotide load to functional outcomes in preclinical models of metabolic and neurodegenerative disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sequencing-based platform for mapping various DNA lesions convertible to 5´-OH or 5´-phosphate ends.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in DNA integrity studies by providing direct, quantifiable measures of ribonucleotide incorporation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized enzymatic cleavage, alkaline hydrolysis, and adapter ligation steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of genotoxic liabilities in lead optimization.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying mitochondrial DNA damage burden linked to therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, enzymatic DNA manipulation, and next-generation sequencing library preparation.
- Dependent on access to restriction enzymes (e.g., HincII), paramagnetic bead purification systems, and thermal cyclers.
- Necessitates cross-team standardization of DNA quality controls and normalization protocols to mitigate strand bias.
- Adaptation to nuclear DNA or other organisms requires validation of reference genome availability and adjustment of input DNA quantities.
- Practical limitations include the need for highly intact DNA to prevent confounding double-strand breaks during library preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
HincII Treatment and Alkaline Hydrolysis
4:11
5'-End Phosphorylation
5:21
Single Strand DNA Ligation
6:35
Second Strand Synthesis
8:23
PCR Amplification, Library Analysis and Pooling
10:10
Results: Simultaneous Quantitation and Genome-wide Mapping of Ribonucleotides
11:39
Conclusion
