Name: Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Leer dynamische morfologische veranderingen van axonvertakking en synapsvorming bestuderen in thalamocorticale projecties met behulp van organotypische cocultures van rat. Deze methode maakt gelijktijdige observatie van axoongroei en synapsontwikkeling in individuele levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken ook Gabriel Hand voor de kritische lezing.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de commissies van het dierenwelzijn van Universiteit van Osaka en de neurowetenschappen Society van Japan.
1. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri
Opmerking: Voor de gedetailleerde procedure, verwijzen naar de oorspronkelijke publicaties7,8,13. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Sprague-Dawley (SD) ratten worden gebruikt voor neuronale culturen.
<ol><li>
Preparaten van reagentia Opmerking: Volumes van de volgende reagentia zijn voor een rat hersenen.<ol>
<li>
Voorbereiden 10 x gemodificeerde N2 Supplement 13: insuline (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrocortison (200 nM), Natriumseleniet (300 nM), transferrine (1 mg/mL), als putrescine (1 mM), glucose (60 mg/mL)</li>
		<li>
Serum-bevattende kweekmedium voorbereiden (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement, 5% foetale runderserum (FBS)</li>
		<li>
Serumvrij cultuurmedium voorbereiden (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement</li>
		<li>Bereid rat staart collageen oplossing (0,5 mL). Kortom, neem tedere vezels uit de staart van een rat onder steriele omstandigheden en na een nacht bebroeden in azijnzuur-oplossing. Na het centrifugeren, verzamelen het supernatant (een paar mg/mL) en opslaan in een koelkast-13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van gerechten van de cultuur
	<ol>
<li>Plaats een membraan invoegen in een 35 mm petrischaal.</li>
		<li>40-50 μl van rat staart collageen oplossing toevoegen aan het membraan, en verspreiden de collageen oplossing rond het centrum.</li>
		<li>Lucht drogen het membraan volledig in een schone bankje.</li>
		<li>Zet 1,5-2 mL serum-bevattende gestolde voedingsbodem in de schotel, zodat het membraan doorweekt met het medium is.</li>
		<li>Zet de schotel van cultuur in een incubator (37 ° C, bevochtigde lucht van 95% en 5% CO2) voordat plating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van corticale segmenten
	<ol>
<li>Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.</li>
		<li>Ontleden van de hele hersenen snel uit een postnatale dag (P) 2 rat onder ijskoud verdoving (ondergedompeld in ijs-chips voor een paar minuten).</li>
		<li>Plaats de hersenen in een 100 mm petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing.</li>
		<li>Verwijder de pia zaak van de hersenen met een fijne Tang, en corticale segmenten (300-400 μm dikte) uit de visuele en Somatosensorische cortex met microchirurgische schaar geknipt (voor detail, Zie Figuur 1). Opmerking: De dikte van de corticale segmenten is ruwweg geschat door de omvang van rasters onder een verrekijker Microscoop. Opmerking: Anderzijds kunnen de corticale segmenten worden gemaakt met een vibratome onder steriele omstandigheden.</li>
		<li>Breng een paar corticale segmenten op het membraan invoegen met een disposable plastic pipet.</li>
		<li>Aanpassen van de posities van de segmenten in de buurt van het centrum van het donormateriaal cultuur met een brand-gepolijst Pasteur Pipet (voor meer informatie, Zie8,13) en verwijder overtollige medium van het inzetstuk. Opmerking: Het niveau van het medium iets onder de oppervlakte van de segmenten aanpassen zodat de plakjes een toereikend aanbod van zowel de gas- en middellange kunnen ontvangen. Dit is essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen.</li>
		<li>Gedurende de segmenten in het kweekmedium serum-bevattende bij 37 ° C in een omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO2, en cultuur alleen al een dag voordat een thalamus blok is genomen en naast het geplaatst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de thalamus blokken
	<ol>
<li>Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.</li>
		<li>Anesthetize een zwangere rat (embryonale dag 15) door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg/kg) met verdoving.</li>
		<li>Ontleden van elk embryo uit de baarmoeder horens, en plaats de embryo's in een petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing van 100 mm.</li>
		<li>Onder een binoculaire loep, verwijderen de hersenen uit elk embryo en snijd thalamus blokken waarin vooral het ventrobasal complex en laterale geniculate nucleus (ongeveer 0.5 mm x 3)7 gebruik van microchirurgische schaar (Zie Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultuur en onderhouden van organotypic cocultures
	<ol>
<li>Met behulp van een pipet van Pasteur, plaats de thalamus blok naast de ventriculaire oppervlak van de corticale segment die in het membraanfilter heeft gebracht.</li>
		<li>Het handhaven van de cocultures in het serum-bevattende kweekmedium bij 37 ° C in een klimaat van bevochtigde lucht van 95% en 5% CO2.</li>
		<li>Wisselen van helft van het medium met de serumvrij cultuurmedium na twee dagen in cultuur. Daarna wisselen het medium elke 2-3 dagen. Opmerking: Het niveau van het medium moet worden gecontroleerd na de middellange exchange, want het is belangrijk voor de overleving van de cel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Electroporation
Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
Opmerking: Uitvoeren electroporation één dag na de voorbereiding van de thalamus blokken om te voorkomen dat de onthechting van de blokken.
<ol><li>
Plasmiden
	<ol>
<li>Maak een mengsel van plasmiden, als volgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/l; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL. Opmerking: Zuiveren van de beide plasmiden met behulp van een endotoxine-vrije Maxiprep kit en los op in Hanks evenwichtige zoutoplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation apparatuur installatie De elektrische instrumenten zoals een stimulator en een isolator moeten worden aangesloten, zoals weergegeven in Figuur 2.<ol>
<li>Sluit de stimulator aan de tweefase isolator.</li>
		<li>Verbind een elektrode (een zilveren 0.2 mm draaddiameter) met de negatieve aansluitklem van de isolator.</li>
		<li>Sluit een elektrode (een zilveren draad 1 mm doorsnede) in serie met een weerstand van 100 Ω en de positieve aansluitklem van de isolator.</li>
		<li>De versterker verbinden met de oscilloscoop om te controleren of de elektrische stromen worden doorgegeven via de weerstand door het meten van de spanning met de versterker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van glas pipetten NB: Twee soorten glas pipetten worden gebruikt voor het uitwerpen van de plasmide-oplossing en toepassing van elektrische pulsen.<ol>
<li>De pipetten van glas haarvaten met een trekker van de elektrode te maken.</li>
		<li>Breken de tip voor de pipet uitwerpen (de tip diameter moet 20-50 μm).</li>
		<li>Slijpen en polijsten van het uiteinde van de pipet elektrode met schuurpapier gevolgd door brand-polijsten (de binnendiameter moet 50-200 μm). Opmerking: De tip van de elektrode moet vlak en glad, als het rechtstreeks het weefsel raakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedure van electroporation
	<ol>
<li>De ejectie en elektrode pipetten verbinden met de manipulatoren.</li>
		<li>Steek een zilver draad (0.2 mm doorsnede) in de pipet elektrode.</li>
		<li>De ejectie pipet hechten aan een injectiespuit 1 mL met een plastic buis.</li>
		<li>Oppakken > 5 μL van plasmide oplossing in de pipet uitwerpen door spuit afzuigen.</li>
		<li>Zet de coculture op het podium electroporation, en de 1 mm diameter elektrode invoegen het kweekmedium.</li>
		<li>Plaats de pipet uitwerpen op de thalamus explant.</li>
		<li>Duw de spuit handmatig na de tip het oppervlak van de thalamus blok raakt. Opmerking: Over 0,5 μL van de plasmide wordt oplossing meestal gebruikt per één blok van de thalamus.</li>
		<li>Plaats de pipet elektrode op de thalamus blok onmiddellijk na intrekking van de pipet uitwerpen.</li>
		<li>Leveren elektrische pulsen (50-400 μA, 3 tot en met 5 treinen van 200 vierkante pulsen van 1 ms duur bij 200 Hz). Toezicht op de amplitude en het aantal treinen op de oscilloscoop. Opmerking: De amplitude van elektrische stromen, is afhankelijk van de binnendiameter van een elektrode Pipetteer13.</li>
		<li>Intrekken van de elektrode pipet en terugkeren van de schotel naar de incubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopische waarneming
	<ol>
<li>Zet de schotel cultuur op een microscopische fase van een rechtop confocal microscoop uitgerust met twee filter sets voor EGFP (excitatie, 488 nm, emissie, 515 nm) en DsRed (excitatie, 514 nm, emissie, 565 nm).</li>
		<li>Neem beelden van 10-25 optische secties op 1-7 µm-stap maten met een 20 X lang-werkende afstand objectief. Selecteer individueel te onderscheiden gelabelde axonen die zowel DsRed als SYP-EGFP uitdrukken. Opmerking: De geconstateerde oppervlakte bedraagt ongeveer 0.7 x 0,7 mm (1024 x 1024 pixels, oftewel correspondeert, 0.68 μm/pixel).</li>
		<li>Elke 24 uur per dag voor dagelijkse imaging beelden vastleggen. Vul binnen 10 minuten bij kamertemperatuur en de culturen terug te keren naar de incubator. Voor korte-interval tijd vervallen imaging, houden de cultuur in de kamer van een cultuur, die onderhoudt dat de omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO2 bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het huidige protocol is ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkelingsaspecten van groeiende axonen anders dan van de TC projectie11. Bijvoorbeeld, kunt een combinatie van corticale segment cultuur en de techniek electroporation visualiseren van individuele axonale morfologie van corticale neuronen en lange termijn waarneming9,18.
Met behulp van het huidige protocol, kunnen de rol van inter...

De projectie van de thalamocortical (TC) in de hersenen van zoogdieren is een geschikt systeem om axon begeleiding en gericht op mechanismen te onderzoeken. Tijdens de ontwikkeling groeien sensorische axonen van de TC in de corticale plaat, en de takken van de vorm en de synapsen bij voorkeur in laag IV van de primaire sensorische gebieden in de hersenschors1,2. Zelfs na de oprichting van fundamentele verbindingen, zijn axonale arbors en synaptische terminals verbouwd afhankelijk van milieuveranderingen3,4. Hoe de TC axon morfologie wordt dynamisch gewijzigd is echter slecht begrepen. Een van de belangrijkste redenen is het ontbreken van een adequate techniek te observeren van structurele veranderingen op het niveau van een enkele cel. Hoewel recente ontwikkelingen in microscopie, zoals twee-foton microscopie, hebben directe observatie van levende corticale neuronen in vivois toegestaan, zijn er nog steeds technische beperkingen voor het vastleggen van de algemene TC trajecten5, 6. Daarom, in vitro methoden voor live beeldvorming van TC axonen zou bieden krachtige hulpmiddelen voor structurele analyses van axon vertakking en de synapse formatie.
Onze fractie voor het eerst vastgesteld een statische segment cultuur methode met permeabel membraan7. Met deze methode een rat corticale segment was cocultured met een zintuiglijke thalamus blok en lamina-specifieke TC verbindingen werden gerecapituleerd in deze7,, organotypic cocultures8. Sparse labelen met een fluorescente proteïne verder konden we observeren TC axon groei en tak vorming9,10,11. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor gelijktijdige beeldvorming van vertakking en synapse formatie van individuele TC axonen in de organotypic cocultures12. Om te visualiseren TC axonen en presynaptische sites tegelijk, waren DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door electroporation van de organotypic coculture. De huidige methode morfologische analyse van TC axonen vergemakkelijkt en zorgt voor lange termijn waarneming, die kan worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&rsquo; balanced salt solution (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35 mm petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM insert</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petrischalen</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>petrischaal steriiel</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wegwerp plastic pipetten</td><td></td><td>202-IS</td><td>transfer pipetten sterieel</td></tr><tr><td>Glas capillair: OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp;G-1.2</td><td>binnendiameter, 1,2 mm</td></tr><tr><td>Zilverdraad: 0,2 en 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (diameter, 0,2 mm), AG-401485 (diameter, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Bifasische isolator&nbsp;</td><td>BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>Versterker&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Universele standaard&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>Lichtverlichtingssysteem&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodetrekker&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 objectief</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rat</td><td>Japan SLC and Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgie schaar</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon vertakking en de synapse formatie zijn cruciale processen voor de vaststelling van nauwkeurige neuronale circuits. Tijdens de ontwikkeling vormen de sensorische thalamocortical (TC) axonen takken en synapsen in bepaalde lagen van de hersenschors. Ondanks de voor de hand liggende ruimtelijke correlatie tussen axon vertakking en de synapse formatie, is de causale relatie tussen hen slecht begrepen. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelde we onlangs een methode om gelijktijdige beeldvorming van vertakking en de synapse formatie van individuele TC axonen in organotypic cocultures.
Dit protocol beschrijft een methode die uit een combinatie van een organotypic coculture en electroporation bestaat. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri vergemakkelijking van genetische manipulatie en waarneming van axonale processen, behoud van de karakteristieke structuren zoals laminaire configuratie. Twee verschillende plasmiden codering DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) waren samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door een electroporation techniek. Deze methode konden we visualiseren van individuele axonale morphologies van TC neuronen en hun presynaptische sites tegelijk. De methode ook ingeschakeld op lange termijn waarneming waaruit bleek het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

Het experiment beschreven hier is gericht op het onthullen van de relatie tussen TC axon vertakking en de synapse formatie. Om te visualiseren gelijktijdig axonale trajecten en locaties van exocytose sites, één of een paar thalamus cellen in organotypic cocultures transfected waren met twee plasmiden codering SYP-EGFP en DsRed met behulp van electroporation. Tijdens de tweede week in cultuur, zijn individueel te onderscheiden TC axonen duidelijk gemarkeerd door DsRed (<strong class="xfig"...

Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.

Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Het algemene doel van deze methode is om dynamische morfologische veranderingen in axonvertakking en synapsvorming in de thalamocorticale projectie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals de vorming van nieuwe neurale circuits. Het grootste voordeel van deze techniek is de gelijktijdige observatie van axongroei en synapsvorming in individuele levende cellen.Deze methode kan inzicht geven in de relatie tussen axonvertakking en synapsvorming in de thalamocorticale projecties. Het kan ook worden toegepast op andere neurale circuits, zoals intrinsieke verbindingen in de hersenschors. Om met deze procedure te beginnen, steriliseer alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.Vervolgens, dissecteren we snel de hele hersenen van een rat op postnataal dag twee onder ijskoude anesthesie. Plaats vervolgens de hersenen in een 100-millimeter petrischaaltje met 40 milliliter koude Hank's Balanced Salt Solution. Onder een binoculaire microscoop verwijder je voorzichtig het pia mater met fijne pincetten en snijd je de primaire visuele en somatosensorische cortex in plakken van 300 to

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a live-imaging technique using differential interference contrast (DIC) microscopy to observe real-time axonal branching in cortical neurons. Time-lapse videos capture the effects of netrin-1 treatment, a signaling molecule that induces localized exocytosis and cytoskeletal rearrangements in...

Real-Time In Vitro Imaging of Axonal Branching in Mouse Cortical Neurons

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen in vitro bestuderen.

Onderzoek van functionele Regeneratie in Organotypische Spinal Cord Co-culturen Grown on Multi-elektrode arrays

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties van zoogdieren afkomstig cortices en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden.

Visualisatie van corticale Modules in afgeplatte zoogdieren Cortices

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Primaire sensorische gebieden in de neocortex vertonen unieke spontane activiteiten tijdens de ontwikkeling. Dit artikel beschrijft hoe individuele neuronactiviteiten en primaire sensorische gebieden kunnen worden gevisualiseerd om gebiedsspecifieke synchrone activiteiten bij neonatale muizen in vivo te analyseren.

In vivo visualisatie van spontane activiteit in de sensorische cortex van neonatale muizen met een resolutie van één neuron

Leer dynamische morfologische veranderingen van axonvertakking en synapsvorming bestuderen in thalamocorticale projecties met behulp van organotypische cocultures van rat. Deze methode maakt gelijktijdige observatie van axoongroei en synapsontwikkeling in individuele levende cellen mogelijk.

Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Meer video's verkennen