Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures
28 maart 2018
Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.
Het algemene doel van deze methode is om dynamische morfologische veranderingen in axonvertakking en synapsvorming in de thalamocorticale projectie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals de vorming van nieuwe neurale circuits. Het grootste voordeel van deze techniek is de gelijktijdige observatie van axongroei en synapsvorming in individuele levende cellen.
Deze methode kan inzicht geven in de relatie tussen axonvertakking en synapsvorming in de thalamocorticale projecties. Het kan ook worden toegepast op andere neurale circuits, zoals intrinsieke verbindingen in de hersenschors. Om met deze procedure te beginnen, steriliseer alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.
Vervolgens, dissecteren we snel de hele hersenen van een rat op postnataal dag twee onder ijskoude anesthesie. Plaats vervolgens de hersenen in een 100-millimeter petrischaaltje met 40 milliliter koude Hank's Balanced Salt Solution. Onder een binoculaire microscoop verwijder je voorzichtig het pia mater met fijne pincetten en snijd je de primaire visuele en somatosensorische cortex in plakken van 300 tot 400 micrometer dik met microchirurgische schaar.
Na dit, breng je de corticale plakken over op het membraanfilter van de kweekinzet met behulp van een wegwerp kunststof pipette. Pas de posities van de plakken aan de buitenkant van de kweekinzet aan met de wegwerp kunststof pipette en verwijder overtollig medium uit de inzet. Houd de plakken in het serumbevattende kweekmedium op 37 graden Celsius en kweek ze één dag alleen voordat je een thalamische blok van een E15 embryo ernaast plaatst.
Pas het niveau van het medium iets onder het oppervlak van de plak aan, zodat de plakken voldoende voorziening van zowel gas als medium kunnen ontvangen. Dit is cruciaal voor de levensvatbaarheid van de plakken. In deze stap, maak je de glas capillairen met een elektrodetrekker.
Breek vervolgens de uiteinden van de glas capillairen voor plasmide-injectie. Voor de elektrodepipetten, slijp en polijst je de uiteinden van de glas capillairen met schuurpapier. En polijst ze vervolgens tot ze een binnendiameter van 50 tot 200 micrometer bereiken.
Verbind vervolgens de elektrodepipet en de ejectiepipet met de manipulatoren. Breng vijf microliter plasmide-oplossing over naar een petrischaaltje. Trek vervolgens de oplossing met capillaire actie in de elektrodepipet.
Plaats de 0,2 millimeter diameter elektrode in de elektrodepipet. Nadat de ejectiepipet is verbonden met een een-milliliter spuit met een plastic buis, breng je weer vijf microliter plasmide-oplossing over naar een petrischaaltje. Trek vervolgens langzaam de oplossing in de ejectiepipet met behulp van de spuit.
Vervolgens, breng je de cocultuur over op de elektroporeringsfase en plaats je de een millimeter diameter elektrode in het kweekmedium. Plaats vervolgens de ejectiepipet op de gekweekte thalamische blok. Duw de spuit handmatig nadat de punt het oppervlak van de thalamische blok raakt.
Plaats de elektrodepipet onmiddellijk na het terugtrekken van de ejectiepipet op de thalamische blok. Lever nu de elektrische pulsen. Bewaak de amplitude en het aantal treinen op de oscilloscoop.
Trek daarna de elektrodepipet terug en plaats de schaal terug in de incubator. Om het monster te observeren, plaats je de kweekschaal op het platform van een opgerichte confocale microscoop die is uitgerust met twee filtersets voor EGFP en DsRed. Neem vervolgens beelden van 10 tot 25 optische secties, met een stapgrootte van één tot zeven micrometer, met een 20x objectieflens met lange werkafstand.
Selecteer individueel onderscheidbare gelabelde axonen, die zowel DsRed als Syp-EGFP tot expressie brengen. Hier is een organotypische cocultuur van thalamische en corticale plakken na 12 DIV te zien. Hier is een vergrote afbeelding van het omlijnde gebied.
En hier is een DsRed-gelabelde thalamische cel die een axon uitstrekt in de corticale plak en vertakkingen vormt in de bovenste lagen. Deze afbeeldingen tonen het DsRed-gelabelde thalamocorticole axon en Syp-EGFP puncta. Discreet accumulatie van Syp-EGFP werd waargenomen langs een enkele thalamocorticale axon.
DsRed plus Syp-EGFP plasmiden werden geïntroduceerd in gekweekte thalamische cellen op een DIV met behulp van elektroporering. Deze axon werd dagelijks gedurende vier dagen geïmagerd. Axonvertakking en synapsvorming waren dynamisch, met toevoeging en eliminatie.
Volgend deze procedures, kan elektroporering met interessante genen samen met Syp-EGFP en DsRed worden uitgevoerd om de rol van het gen in axonvertakking en synapsvorming te onderzoeken. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van neurobiologie om de mechanismen van dynamische veranderingen van neurale circuits te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocorticale axonvertakking en synapsevorming in organotypische coculturen van de thalamus en de cerebrale cortex. De focus ligt op dynamische morfologische veranderingen in de thalamocorticale projectie, wat inzicht biedt in de vorming van nieuwe neurale circuits en de relatie tussen axongroei en synapseontwikkeling.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurobiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Thalamocorticale projecties spelen een cruciale rol bij de sensorische verwerking.
- Inzicht in axonvertakking en synapsevorming is essentieel voor het begrijpen van de vorming van neurale circuits.
- Huidige methoden hebben beperkingen bij het gelijktijdig observeren van deze veranderingen op cellulair niveau.
- De studie ontwikkelt technieken voor beeldvorming in levende celcontexten.
Doel van de studie
- Om dynamische morfologische veranderingen tijdens axonale vertakking en synapsevorming te onderzoeken.
- Om een methode te bieden waarmee individuele levende cellen in cocultuur kunnen worden waargenomen.
- Om de relatie tussen axonale groei en synaptische ontwikkeling in thalamocorticale neuronen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Er werd gebruikgemaakt van organotypische cocultures van thalamische en corticale coupes.
- Voor het creëren van het biologische model werd weefsel van ratten op postnatale dag twee gebruikt.
- Er werd electroporatie uitgevoerd om fluorescente markers voor beeldvorming te introduceren.
- De cultures werden onderhouden bij 37 °C en waargenomen op specifieke ontwikkelingsmomenten.
- De beeldvorming werd uitgevoerd met een confocale microscoop om axonale dynamiek vast te leggen.
Belangrijkste Resultaten
- Dynamische veranderingen in axonvertakking en synapsevorming werden waargenomen, wat de plasticiteit in thalamocorticale projecties benadrukt.
- Er werd een discrete accumulatie van synaptische markers langs axonen opgemerkt, wat wijst op een voortdurende synaptische ontwikkeling.
- De techniek maakte real-time observatie van morfologische veranderingen in individuele cellen mogelijk.
- De bevindingen benadrukken het potentieel voor het onderzoeken van genrollen in de dynamiek van axonen en synapsen.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een nieuwe methode voor het onderzoeken van de dynamiek en plasticiteit van neurale circuits.
- Het biedt inzicht in de koppeling tussen axonale groei en synapsevorming.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrip van de mechanismen van neurale connectiviteit en plasticiteit bij gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt gelijktijdige visualisatie van axonvertakking en synapsevorming in levende neurale circuits mogelijk, waarmee een belangrijk mechanistisch hiaat in de validatie van neuro-ontwikkelingstargets wordt opgevuld. Door dynamische data met resolutie op single-cell niveau te leveren over structurele plasticiteit, ondersteunt het de voorspellende betrouwbaarheid in vroege ontdekkingsfasen waarin het mechanistisch minimaliseren van risico's bij synaptische targets cruciaal is. De aanpak biedt translationele continuïteit van mechanistisch inzicht naar preklinische beoordeling van fenotypen op circuitniveau in neuropsychiatrische ziektemodellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken die axonmorfologie koppelen aan synaptische connectiviteit in thalamocorticale banen.
- Operationele waarde: Behoudt de laminaire architectuur en neuronale levensvatbaarheid voor longitudinale observatie van dynamische structurele veranderingen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door causale relaties tussen structurele groei en functionele synaptogenese te verduidelijken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, gemultiplexte readouts van axonale vertakking en presynaptische markeraccumulatie voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream compound-screening in neurodevelopmentele pathways.
- Operationele waarde: Faciliteert schaalbare, reproduceerbare imaging-workflows die compatibel zijn met gemultiplexte fluorescentie-readouts.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Stemt overeen met ziekterelevante systemen waarbij thalamocorticale dysconnectiviteit bijdraagt aan sensorische en cognitieve fenotypes.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van mechanistische screening in de ontdekkingsfase tot preklinische validatie van herstel op circuitniveau.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door structurele dynamiek te koppelen aan functionele synaptische resultaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door directe observatie mogelijk te maken van structurele plasticiteit voorafgaand aan de resultaten van functionele assays in neurale circuitmodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen van genen die de dynamiek van axonvertakkingen en de vorming van synaptische plaatsen in levende circuits reguleren.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve morfologische gegevens en gegevens van fluorescente puncta voor het profileren van compound-effecten.
- Analytica: Maakt statistische vergelijking van vertakkingsfrequentie en synapsdichtheid over verschillende experimentele condities in de tijd mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met preklinische modellen van neuro-ontwikkelingsstoornissen met thalamocorticale baanalteraties.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor multiparametrische beoordeling van neuritogenese en synaptogenese in diverse neurale modellen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door ambiguïteit in structuur-functie-relaties tijdens de assemblage van neurale circuits te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert dual-channel imaging-workflows voor consistente, longitudinale tracking van axonale en synaptische dynamiek.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistisch bewijs te leveren over de interactie van targets met structurele plasticiteitspaden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde effecten op de axon-synapskoppeling in circuits die relevant zijn voor de mens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het onderhoud van organotypische coculturen, elektroporatie en confocale microscopie.
- Afhankelijk van steriele chirurgische instrumenten, de preparatie van micropipetten en de kwaliteit van het plasmide-DNA voor een efficiënte transfectie.
- Vereist omgevingscontrole bij 37°C en serumhoudend medium om de levensvatbaarheid van de coupes gedurende meerdere dagen te behouden.
- Aanpassing aan alternatieve neurale circuits vereist validatie van de weefselcompatibiliteit en de elektroporatie-efficiëntie.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in transfectie-efficiëntie en de noodzaak van post-hoc beeldanalyse om vertakkingen en puncta-dynamiek te kwantificeren.
