Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol
12 maart 2018
Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.
Het algemene doel van deze invasie-assay is om de migratie- en invasieve capaciteiten van zeldzame en gevoelige cellen in een 3D-omgeving te kwantificeren zonder de cellen uit hun micro-omgeving te verplaatsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van kankeronderzoek over de invasiecapaciteit van gevoelige en of oray-gebeurtenissen, zoals een fusieproduct van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cellen worden geanalyseerd in hun oorspronkelijke micro-omgeving met behulp van een 3D-instelling.
De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van kanker omdat het kan worden gebruikt om farmacologische middelen te screenen die in staat zijn om de invasie en metastase van kankercellen te remmen. Visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal. Aspirate in de temperatuur en pH van het collageenmengsel beïnvloedt de polymerisatie en ruw handelen veroorzaakt dat het gel loslaat.
Begin door een 35 millimeter kweekschotel met een 10 millimeter glazen bodemput met één milliliter een molaire zoutzuur te behandelen om de hydrofobiciteit van het glas te verlagen. Na 15 minuten, was de plaat twee keer met één milliliter PBS per wassing, gevolgd door een wasbeurt met één milliliter 70% ethanol. Spoel vervolgens de plaat af met één milliliter kweekmedium specifiek voor de te gebruiken cellen van belang.
En zaai de plaat met de cellen van belang. Plaats vervolgens de plaat in een celkweekincubator. Wanneer de cellen 100%confluency bereiken, combineer 114,5 microliter vers bereid rattenstaartcollagene, 16,6 microliter 10 X DMEM medium en 33,1 microliter kweekmedium aangevuld met chemo-attractant van belang in een microcentrifugebuisje op ijs.
Neutraliseer het collageenmengsel met 14 microliter natriumbicarbonaat en bedek de cellen met 80 microliter gel. Laat het collageen polymeriseren in een bevochtigde 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide incubator gedurende 30 minuten. Laag vervolgens twee milliliter gereduceerd twee procent serum celkweekmedium over het gel en breng de cellen voorzichtig terug in de incubator voor de juiste experimentele tijdsperiode zonder het collageen los te maken.
Aan het einde van de incubatie, verwijder voorzichtig het medium en spoel het gel zorgvuldig met één milliliter PBS. Fixeer de cellen met één milliliter vier procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten gevolgd door twee wasbeurten met één milliliter PBS per wasbeurt. Label vervolgens de cellen met DAPI-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en beeld de in vitro driedimensionale collageeninvasie af met behulp van confocale microscopie.
Hier wordt de kwantificering van de invasie van het collageengel door een borstkankercellijn en borstkankercelfusieproducten in reactie op een chemo-attractant gedurende een 48-uur migratieperiode getoond. Opmerkelijk is dat ook de migratie van zeldzame borstkankercelfusieproducten in het collageengel in reactie op de chemo-attractant werd waargenomen. De cellen blijven gezond gedurende het hele collageengeldexperiment, zoals blijkt uit hun behoud van robuuste celnummers en hun morfologie 48 uur na gelpolymerisatie.
Deze verticale collageengeldtest maakt het ook mogelijk om de kinetica van celmigratie bij invasie te analyseren door de celmigratie in Z-series te beelden, evenals de morfologie van de migrerende cellen in situ te vangen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een kweekschotel moet worden gebruikt die compatibel is met uw microscoop. Na het volgen van deze procedure kunnen andere variabelen, zoals het wijzigen van de sterkte van collageen of het gebruik van verschillende chemo-attractanten, worden geïntroduceerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de effecten van ECM-betrokkenheid op celinvasie of de effecten van verschillende chemo-attractanten op celinvasie, respectievelijk.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van biologie en kanker om te screenen op farmacologische remmers van metastase, evenals om wondgenezing in alle ontstekingsreacties in vivo te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de migratie- en invasieve capaciteit van zeldzame en gevoelige cellen kunt beoordelen, in een 3D-omgeving, zonder de cellen te vervormen op het micro-niveau. Vergeet niet dat het werken met humane kankercellen, zoutzuur, paraformaldehyde en DAPI buitengewoon gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van een bioseptische kast van niveau twee en een damphouder, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-assay die de migratie- en invasiecapaciteiten van zeldzame en gevoelige cellen kwantificeert in een driedimensionale setting, terwijl de cellulaire micro-omgeving behouden blijft. Deze methode is bijzonder relevant in kankeronderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celmigratie
- Kankeronderzoek
- Invasie-assays
Achtergrond
- De assay maakt de analyse van cellen in hun oorspronkelijke micro-omgeving mogelijk.
- Deze is ontworpen voor zeldzame en gevoelige cellen.
- Inzicht in celinvasie is cruciaal voor de ontwikkeling van kankertherapieën.
- Een visuele demonstratie van de techniek is essentieel voor een juiste uitvoering.
Doel van de studie
- Om de migratie- en invasiecapaciteiten van cellen te kwantificeren.
- Om het invasievermogen van gevoelige cellen te onderzoeken.
- Om farmacologische middelen te screenen die invasie en metastase van kankercellen remmen.
Gebruikte methoden
- Omgekeerde verticale invasie-assay
- Driedimensionale celkweek
- Analyse van cellen in hun micro-omgeving
- Beoordeling van de effecten van temperatuur en pH op collageenpolymerisatie
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond vermogen om celgedrag in een 3D-omgeving te analyseren.
- Het belang van het behoud van de cellulaire micro-omgeving benadrukt.
- Inzichten verschaft in de invasieve vermogens van kankercellen.
- Potentieel aangetoond voor het screenen van therapeutische middelen.
Conclusies
- De assay is een waardevolle tool voor kankeronderzoek.
- Het behoudt de micro-omgeving van gevoelige cellen.
- Het kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën gericht op kankerinvasie en metastase.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze assay stelt biopharma R&D-teams in staat om het invasieve potentieel van zeldzame en gevoelige celmodellen te evalueren in een fysiologisch relevante 3D-micro-omgeving, zonder de natuurlijke cel-ECM-interacties te verstoren. Door de oorspronkelijke cellulaire niche te behouden, ondersteunt deze methode het mechanistische de-risking van metastase-gerelateerde targets en verbetert het het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie in een vroeg stadium. Het vult een kritisch gat in preklinische screening, waarbij traditionele assays de integriteit van de micro-omgeving compromitteren, waardoor de translationele continuïteit van discovery naar lead-optimalisatie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door invasie te beoordelen in zeldzame of uit fusies afgeleide celmodellen onder natuurlijke micro-omgevingscondities.
- Operationele waarde: Vermindert artefactuele variabiliteit veroorzaakt door celverplaatsing, wat de reproduceerbaarheid van invasiefenotypes over verschillende experimenten verbetert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij target-selectie door moleculaire perturbaties te koppelen aan functionele invasie-uitkomsten in een 3D-context.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve invasiemetrieken die compatibel zijn met high-content imaging en geautomatiseerde analyseworkflows.
- Reproduceerbaarheid: Minimaliseert variabiliteit tussen wells door mechanische verstoring van cellagen tijdens de opzet van de assay te elimineren.
- Schaalbaarheid: Compatibel met variërende collageenconcentraties en chemoattractanten, wat structuur-activiteitsrelatie-studies (SAR) voor metastase-remmers mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert menselijke kankerinvasie met behulp van fibroblast-epitheliale hybride cellen die stromaal-tumorinteracties in vivo weerspiegelen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische validatie door micro-omgevingssignalen te behouden die cruciaal zijn voor invasief gedrag.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Levert functionele invasiegegevens om targets of verbindingen te prioriteren met een verminderde kans op falen in een laat stadium als gevolg van gebrekkige modellering van de micro-omgeving.
Integratie van pipeline en workflow
De assay past binnen het discovery-continuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, en biedt een alternatief dat de micro-omgeving behoudt ten opzichte van Boyden Chamber- of transwell-systemen voor metastase-gerelateerde programma's.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesegestuurd testen van invasiepaden door real-time z-stack imaging van celmigratie binnen fysiologische collageengels mogelijk te maken.
- Screening: Levert invasie-eindpuntgegevens die geschikt zijn voor screening van compound-bibliotheken, in het bijzonder voor agentia die zich richten op ECM-remodellering of chemotactische signalering.
- Analytica: Maakt kwantificering van het aantal geïnvadeerde cellen en morfometrische analyse mogelijk, waardoor multiparametrische read-outs voor structuur-functiecorrelatie worden verkregen.
- Translationeel Onderzoek: Modelleert stromaal-gemedieerde invasie met behulp van MSC-kankerhybriden, ter ondersteuning van mechanistische studies gekoppeld aan biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Aanpasbaar voor verschillende kankertypen en stromale co-culturen, wat het hergebruik van het platform bevordert in programma's voor metastase en wondgenezing.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door het verminderen van fout-positieven als gevolg van verstoring van de micro-omgeving.
- Operationele waarde: Verbetert de robuustheid van de assay door gestandaardiseerde protocollen voor gelpolymerisatie en overlay.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door in een vroeg stadium van de pipeline fysiologisch relevante invasiegegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gestrategeerde voortgang van metastase-remmers mogelijk op basis van functionele 3D-invasieprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek en confocale microscopie voor een nauwkeurige kwantificering van de invasie.
- Is afhankelijk van een precieze temperatuur- en pH-controle tijdens de bereiding van het collageen om een consistente polymerisatie van de gel te waarborgen.
- Vereist een gestandaardiseerde dosering van het chemoattractant en serumarme mediumcondities voor reproduceerbare chemotactische responsen.
- Aanpassing aan alternatieve ECM-eiwitten (bijv. Matrigel, fibrine) kan optimalisatie van de gelatiekinetiek en concentratie vereisen.
- Beperkt tot adherente of semi-adherente cellen die in staat zijn om opwaarts door een gel-overlay te invaderen; niet-adherente suspensies kunnen aanpassingen vereisen.
