Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek
23 februari 2018
Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.
Het algemene doel van deze methodologie is om de dynamica van een grote populatie adherieve cellen te verwerven en te analyseren door middel van lensvrije videomicroscopie. Daarom denken we dat deze techniek interessant is in vele biologische velden en voor het bestuderen van celproliferatie of celcystitis of medicijnscreening, of verschillende bioprocesbewaking. Dus deze techniek is labelvrij en het is heel eenvoudig.
Maar het is erg effectief in het bestuderen van grote celpopulaties. Welke idee voor deze methode, toen we verschoven van het gebied van het detecteren van bacteriën naar het gebied van het beeldvormen van zoogdiercellen. Toen was het handig dat de bioloog tijds-lapse-acquisitie van de circuituur rechtstreeks in de incubator nodig zou hebben.
Daarna bouwden we een aangepaste lensvrije videomicroscoop die compatibel is met de incubator en we ontwikkelden een holografisch reconstructie-algoritme om de afbeelding van duizenden cellen te krijgen die aanwezig zijn in het zeer grote gezichtsveld. Begin deze procedure door een 6-well glasbodemplaat te coaten met fibronectine bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder na 1 uur overtollig fibronectine en spoel de 6-well glasbodemplaat uit met PBS.
Hela-cellen, gekweekt in DMEM, plus glutamine medium, aangevuld met 10% warmte in geactiveerd foetaal runderserum, en 1% penicilline en streptomycine worden gebruikt in deze demonstratie. Zaai twintigduizend cellen per kweekplaat. Het is belangrijk om een container met een glazen bodem te gebruiken.
Voor de kwaliteit van de lensvrije acquisitie. Plaats de kweekplaat in de incubator bovenop de lensvrije videomicroscoop. De lensvrije videomicroscoop die voor deze tijds-lapse-acquisitie wordt gebruikt, is commercieel verkrijgbaar.
Het heeft een metaaloxide halfgeleider beeldsensor met een beeldgebied van 29,4 vierkante millimeter en een pixelpitch van 1,67 micrometer. Meerdere golflengte verlichting wordt geleverd door een multi-chip lichtemitterende diode-apparaat dat zich boven een 150 micrometer pinhole op een afstand van ongeveer 5 centimeter van de cellen bevindt. Voordat u begint met de tijds-lapse-acquisitie, is het belangrijk om te controleren of er geen condensatie op de dekplaat is.
Omdat condensatie de beeldakwaliteit van de acquisitie zal degraderen. Als er condensatie is opgetreden op het deksel van de kweekplaat, maak het deksel schoon. Controleer de lensvrije videomicroscoop met een commercieel verkrijgbare acquisitiesoftware.
Die zowel de tijds-lapse-acquisitie als de holografische reconstructie uitvoert. Voer de vereiste invoerparameters in in de software-interface. Stel de framesnelheid in op 1 acquisitie elke 10 minuten, de celkweektype op adherief en de duur van het experiment op 3 dagen.
Start de tijds-lapse-acquisitie. Dit beeld toont een voorbeeld van het volledige gezichtsveld van een ruwe acquisitie in het blauwe kanaal op een gebied van 29,4 vierkante millimeter in één frame. Paneel B is het detail van paneel A en paneel C is het detail van paneel B. Het holografisch reconstructie-algoritme zal de lensvrije acquisitie automatisch verwerken om de fasebeeld van de celkweek te verkrijgen.
Een voorbeeldbeeld van cellen vóór fase-unwrapping wordt getoond, gevolgd door een beeld na fase-unwrapping. Celtracking wordt uitgevoerd met behulp van het TrackMate-algoritme, Een open source Fiji plug-in voor de geautomatiseerde tracking van enkele deeltjes. Na het laden van de volledige tijds-lapse-acquisitie in Fiji en het configureren van de algoritmen zoals beschreven in het tekstprotocol, stel de invoerparameters in.
Stel de geschatte blobdiameter in op 15 pixels, de detectordrempel op 0,25, de maximale koppelafstand op 15 pixels, de maximale afsluitingsmaxafstand op 15 pixels en het aantal spots in track op 3,5. De eerste stap in het celtracking-algoritme is de detectie van cellen in de lensvrije acquisitie. Resultaten van het celtracking-algoritme worden getoond, met alle celtracks getoond over vijftig frames, of ongeveer 8 uur.
Met een kleurencode die overeenkomt met de mediane snelheid. Het onderste paneel is een gedetailleerd beeld van de gele rechthoek van het bovenste paneel. Een representatief videoclip van celtracking wordt hier getoond.
Aan het einde van het celtrackingproces, selecteer de analyseknop om de resultaten te genereren in de vorm van 3 tekstbestanden. Op basis van deze gegevens, voer celsegmentatie uit en detecteer celdeling met behulp van speciale algoritmen, zoals beschreven in het tekstprotocol en aanvullende codebestanden. Het compileren van alle enkele celmetingen over de volledige tijds-lapse-acquisitie, produceert spreidingsplots van verschillende metrics als functie van de tijd.
Het totale aantal cellen in het volledige gezichtsveld, neemt toe van tweeduizend tot vijftienduizend in 2,7 dagen. Vermenigvuldigd met het aantal tijdstippen, leidt dit tot een grote dataset van gedetecteerde cellen. Elk gekenmerkt door zijn coördinaten en morfologische kenmerken, zoals droge massa, oppervlakte, gemiddelde dikte, belangrijkste toegangslengte en aspectverhouding.
De combinatie van celtracking en celsegmentatie algoritmen, maakt kinetische metingen op het niveau van een enkele cel mogelijk. Dit voorbeeld toont de analyse van de celtrack die ongeveer zestig-zes uur duurt, en 4 celdelingen vertoont op de tijdstippen omcirkeld in geel. Verschillende metrics werden berekend als functie van de tijd: celoppervlakte, droge massa, gemiddelde dikte en celmobiliteit.
De verdeling van de duur van de celcyclus voor 2,7 dagen observatie was dicht bij agouzian. Met een gemiddelde van 16,5 uur. Celcycluslengten, automatisch gemeten, zijn goed gecorreleerd met de handmatig gemeten.
Ook andere parameters werden onderzocht, zoals de initiële droge massa van de cel, de uiteindelijke droge massa en de gemiddelde groeisnelheid tijdens de celcyclus. Eenmaal onder de knie, kan de complete gegevensanalyse van de tijds-lapse-acquisitie in enkele uren worden gedaan, afhankelijk van de CPU-configuratie en de hardwareprestaties. Bij het uitvoeren van deze procedure is het erg belangrijk om de aanvankelijke celconcentra
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
In dit artikel wordt een methodologie besproken waarbij lensvrije videomicroscopie wordt gebruikt om celculturen direct in een incubator te monitoren. Het protocol maakt de acquisitie en analyse mogelijk van uitgebreide datasets over celmorfologie en celcyclusdynamiek.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
- Studies naar celproliferatie
Achtergrond
- Lensvrije videomicroscopie is een labelvrije beeldvormingstechniek.
- Het maakt time-lapse acquisitie van celculturen mogelijk.
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van grote populaties adherente cellen.
- Het vindt toepassingen in diverse biologische vakgebieden, waaronder drugscreening.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van grote populaties adherente cellen te verkrijgen en te analyseren.
- Om een eenvoudige maar effectieve methode te bieden voor het monitoren van celgedrag.
- Om onderzoek naar celproliferatie en andere biologische processen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Lensvrije videomicroscopie voor beeldvorming.
- Time-lapse acquisitie van gecultiveerde HeLa-cellen.
- Analyse van de morfologie van individuele cellen.
- Tracking van celcyclusdynamiek over 2,7 dagen.
Belangrijkste resultaten
- Verwerving van een dataset met 2,2 x 106 metingen.
- Tracking van 10.584 celcyclus-tracks.
- Demonstratie van de effectiviteit van lensvrije microscopie bij celstudies.
- Inzichten in celproliferatie en gedrag in een gecontroleerde omgeving.
Conclusies
- Lensvrije videomicroscopie is een waardevolle tool voor onderzoek in de celbiologie.
- De methodologie maakt uitgebreide gegevensverzameling over celdynamiek mogelijk.
- Deze techniek kan studies in diverse biologische toepassingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Lensvrije videomicroscopie maakt hoogdoorvoerende, kwantitatieve monitoring van adherente celculturen direct in incubatoren mogelijk, wat dynamische analyse van celproliferatie en morfologie op enkelcelresolutie ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij vroege ontdekking en assayontwikkeling door grootschalige, tijdopgeloste datasets te genereren. De benadering is strategisch gepositioneerd om de besluitvorming op cruciale knelpunten in biofarmaceutische R&D-pipelines te verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kinetische analyse van duizenden individuele cellen mogelijk om proliferatie en celcyclusdynamiek te onderzoeken.
- Ondersteunt de functionele validatie van biologische hypothesen via kwantitatieve, longitudinale single-cell tracking.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door heterogeniteit in celgedrag en delingspatronen bloot te leggen.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, labelvrije imaging voor reproduceerbare monitoring van celculturen in screening-workflows.
- Genereert kwantitatieve morfologische en kinetische outputs die geschikt zijn voor assay-optimalisatie en -validatie.
- Maakt schaalbare, geautomatiseerde data-acquisitie mogelijk voor high-content screening-applicaties.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Levert tijdopgeloste datasets die kunnen bijdragen aan de ontdekking van translationele biomarkers wanneer ze worden afgestemd op ziekterelatede modellen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door robuuste, kwantitatieve analyse van celgedrag mogelijk te maken.
- Vermindert biologische onzekerheid bij de selectie van preklinische modellen door middel van gedetailleerde metrieken voor cellijnage en proliferatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door directe, kwantitatieve observatie van celculturen mogelijk te maken, wat zowel hypothesetoetsing als de gereedheid van assays ondersteunt.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar celproliferatie en delingskinetiek.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert grootschalige time-lapse datasets voor statistische vergelijking van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Biedt mogelijkheden voor afstemming van biomarkers bij toepassing op ziekte-relevante systemen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een schaalbaar, labelvrij beeldvormingsplatform dat aanpasbaar is voor meerdere R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in celgebaseerde studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor celmonitoring.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste kwantitatieve gegevens.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van discovery- en preklinische assets mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, time-lapse imaging en computationele analyse.
- Is afhankelijk van toegang tot lensvrije videomicroscopie-hardware en compatibele analysesoftware.
- Vereist cross-team standaardisatie van acquisitieparameters en dataverwerkingsworkflows.
- Aanpasbaar aan diverse adherente celtypen, maar gevoelig voor de initiële celconcentratie en kweekcondities.
- De doorvoer van de data-analyse wordt beïnvloed door de computationele infrastructuur en hardwareprestaties.
