Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down
11 december 2017
Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.
Het algemene doel van deze preklinische platform is om een standaardprocedure te bieden om de mechanismen die verworven resistentie tegen gerichte therapieën aansturen te identificeren en te karakteriseren. Deze methode kan helpen om genome drive in de oncologie te implementeren, in het bijzonder om belangrijke vragen over tumorheterogeniteit en de meerdere mechanismen die verantwoordelijk zijn voor verworven resistentie tegen gerichte therapieën aan te pakken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de tijd- en kosteneffectieve aanpak die de in-vitro onderzoek van resistentiemechanismen tegen gerichte therapie toestaat.
De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot kankertherapie, aangezien longresistentie nog steeds een uitdaging vormt voor opkomende gerichte therapieën. Deze methode kan inzicht bieden in het mechanisme dat betrokken is bij resistentie tegen gerichte therapie, maar kan ook worden gebruikt om de werkzaamheid van conventionele chemotherapeutische middelen te bestuderen. Over het algemeen zullen operators die deze methode gebruiken moeite hebben met een generatie van geneesmiddelresistente subklonen, de stap die het moeilijkst te standaardiseren is.
We bedachten het idee voor deze methode voor het eerst toen we het verworven resistente mechanisme voor trastuzumab in HER-positieve gastrische kankercellijnen karakteriseerden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien verschillende technieken nodig zijn voor het genereren en valideren van in-vitro modellen met resistentie tegen geneesmiddelen, inclusief het herstellen van gevoeligheid door gen knock-down. Om deze procedure te beginnen, zaai NCI N87 cellen in 25 vierkante centimeter kweekkolven.
Voeg 10 microgram per milliliter trastuzumab toe aan het kweekmedium in elke kolom. Stel de cellen bloot aan deze startdosis totdat ze weer beginnen te groeien. Nadat de celgroei in ongeveer twee weken weer is hervat, stel de cellen bloot aan een concentratiedosis van honderd microgram per milliliter trastuzumab.
Ga door met het geleidelijk verhogen van de trastuzumabconcentratie en wacht tot de cellen weer beginnen te groeien voor elke blootstelling, totdat een concentratie van 400 microgram per milliliter is bereikt. Een cellijn kan een andere gevoeligheid vertonen voor verschillende geneesmiddelen. Een oplossing voor dit probleem is om cellen bloot te stellen aan geleidelijk toenemende dosis geneesmiddelen, beginnend vanaf een dosis ongeveer tien keer de piekconcentratie in het plasma, totdat de cellen blijven groeien.
Zaai vervolgens cellen in 24 multi-well kweekplaten. Stel de gezaaide cellen bloot aan toenemende concentraties doelgerichte therapie-remmer van 100 microgram per milliliter tot 400 microgram per milliliter. Incubeer in een CO2-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 15 dagen.
Verwijder daarna het medium en spoel de cellen af met 10 milliliter PBS-1X. Verwijder de PBS-1X en voeg tussen twee en drie milliliter fixeeroplossing toe. Verwijder na 20 minuten de fixeeroplossing en voeg twee milliliter 0,5% kristallen violet-oplossing toe aan elke put.
Incubeer gedurende twee uur op kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een pipet om de kristallen violet-oplossing voorzichtig te aspireren. Dompel de platen in kraanwater om eventuele restanten weg te spoelen.
Laat drogen op kamertemperatuur gedurende maximaal twee dagen. Gebruik vervolgens een omgekeerd microscoop met 4X vergroting om kolonies met meer dan 50 cellen te tellen. Bereken de relatieve weerstands IC50-verhouding zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om te beginnen, bereid een enkele celsuspensie voor door trypsinisatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan Blue-kleuring. Zaai vervolgens 2,5 keer 10 tot de vijfde cel op een T-25 kolom voor elke conditie.
Verdun vervolgens 12,5 microliter van elk gen-targeting siRNA-oligonucleotide of negatief controle-siRNA-oligonucleotide in minimaal essentieel transfectiemedium. Voeg een cationisch liposoom transfectiereagens toe met een verhouding van 1:1 met de oligonucleotiden. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
Voeg vervolgens 700 microliter van de transfectiemix toe aan elke T-25 kolom. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één tot drie dagen. Gebruik RT-PCR en Western Blot-analyse om gen knock-down te verifiëren.
Zaai vervolgens cellen in 24 multi-well kweekplaten. Stel de cellen bloot aan toenemende concentraties doelgerichte therapie-remmer van 100 microgram per milliliter tot 400 microgram per milliliter. Voor de werkzaamheid van gen knock-down, moeten siRNA-oligonucleotiden specifiek zijn voor het verminderen van doelexpressie.
Ontworpen gereedschappen en de maat van siRNA waren hetzelfde doelgen zijn nuttig voor dit doel. Incubeer in een CO2-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 15 dagen. Verwijder het medium en spoel de cellen af met 10 milliliter PBS-1X.
Na het verwijderen van de PBS, voegt u twee tot drie milliliter fixeeroplossing toe. Verwijder vervolgens de fixeeroplossing en voeg 0,5% kristallen violet-oplossing toe. Incubeer gedurende twee uur op kamertemperatuur.
Gebruik een pipet om de kristallen violet-oplossing voorzichtig te aspireren. Dompel de platen vervolgens in kraanwater. Laat drogen op kamertemperatuur gedurende maximaal twee dagen.
Gebruik vervolgens een omgekeerd microscoop met 4X vergroting om de kolonies met meer dan 50 cellen te tellen. In deze studie worden drie gastrische kankercellijnen die een hoog niveau van HER2 uitdrukken en gevoelig zijn voor trastuzumab gekweekt in een kweekmedium dat de gerichte therapeutische middelen bevat. Hieruit worden drie subklonen verkregen die worden gekenmerkt door een stabiel resistent fenotype.
Van de subklonen is HR NCI N87 het meest resistent te zien, met een relatieve weerstands IC50 van 28,57. Analyse van eiwit- en genexpressie ondersteunt de hypothese dat het gen IQGAP1 een sleutelrol speelt in het resistente fenotype van de HR NCI N87-sublijn. Zoals hier getoond, is het IQGAP1-eiwitniveau vijf keer hoger in de resistente sub
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit in vitro-protocol onderzoekt de mechanismen van verworven resistentie tegen gerichte therapeutische middelen bij de behandeling van kanker. Het biedt een standaardprocedure om deze mechanismen te identificeren en te karakteriseren, waarbij rekening wordt gehouden met de uitdagingen van tumorheterogeniteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Kankeronderzoek
- Therapeutische resistentie
- Oncologie
Achtergrond
- Verworven resistentie tegen doelgerichte therapieën vormt een aanzienlijke uitdaging bij de behandeling van kanker.
- Inzicht in tumorheterogeniteit is essentieel voor een effectieve therapie.
- Huidige methoden voor het bestuderen van resistentiemechanismen zijn vaak tijdrovend en kostbaar.
- Dit protocol heeft tot doel het onderzoek naar deze mechanismen te stroomlijnen.
Doel van de studie
- Om een gestandaardiseerde methode te bieden voor het bestuderen van verworven resistentie tegen doelgerichte therapieën.
- Om het begrip van de mechanismen die resistentie bij kanker aansturen te verbeteren.
- Om onderzoek naar de effectiviteit van zowel doelgerichte als conventionele chemotherapeutische middelen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- In vitro experimenten om drug-resistente subclonen te genereren.
- Karakterisering van de mechanismen die ten grondslag liggen aan resistentie.
- Toepassing van de methode op diverse therapeutische agentia.
- Gestandaardiseerde procedures om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van belangrijke mechanismen die bijdragen aan resistentie.
- Inzichten in tumorheterogeniteit en de impact daarvan op de therapie.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het bestuderen van resistentie.
- Potentiële toepassingen voor het verbeteren van kankerbehandelingsstrategieën.
Conclusies
- Dit protocol biedt een tijds- en kosteneffectieve benadering voor het bestuderen van resistentiemechanismen.
- Het heeft significante implicaties voor het verbeteren van kankertherapie.
- Verder onderzoek met behulp van deze methode zou kunnen leiden tot betere therapeutische resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Verworven resistentie tegen doelgerichte therapieën blijft een kritiek knelpunt in de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen, wat de duurzaamheid van klinische responsen ondermijnt en de verdere ontwikkeling van portfolio's bemoeilijkt. Deze gestandaardiseerde in vitro workflow maakt systematische identificatie en mechanistische risicoreductie van resistentieroutes mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende zekerheid bij de selectie van targets en therapeutische strategieën. Door het herstellen van de geneesmiddelsensitiviteit via gene knock-down, biedt deze aanpak een basis voor rationeel combinatiesontwerp en risico-gecorrigeerde beslissingen over de voortgang van het onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om resistentie-drijvende routes en functionele target-afhankelijkheden in tumormodellen te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de mechanistische basis van verworven resistentie-fenotypes te verduidelijken.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de prioritering van targets en de triage van kandidaat-therapeutica.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde drug-resistente subclonen voor robuuste downstream screening van nieuwe inhibitoren of combinaties.
- Standaardiseert resistentiemodellering, wat de reproduceerbaarheid en kwantitatieve beoordeling van verschuivingen in de drugrespons verbetert.
- Maakt schaalbare, reproduceerbare generatie van resistente modellen mogelijk voor inzet in assays over verschillende programma's heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro resistentiemechanismen met klinisch waargenomen resistentie, wat de ontdekking van translationele biomarkers ondersteunt.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door de evolutie en omkeer van resistentie te modelleren.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door zwakke punten in de mechanismen van kandidaat-geneesmiddelen te onthullen.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinische validatie, en slaat een brug tussen targetvalidatie, het ontrafelen van resistentiemechanismen en lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Test systematisch hypothesen over resistentiedrivers en pathway-herprogrammering als reactie op doelgerichte therapie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve IC50- en kolonievormingsresultaten voor vergelijkende evaluatie van geneesmiddelen.
- Analytics: Verschaft gen- en eiwitexpressiegegevens ter ondersteuning van mechanistische analyse en statistische vergelijking tussen resistente en ouderlijnen.
- Translationeel onderzoek: Modelleert klinisch relevante resistentie-fenotypes, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van biomarkers en combinatiestrategieën.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulaire, aanpasbare workflow voor resistentiemodellering voor diverse targets en tumortypes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets en pathways door resistentiemechanismen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de generatie van resistentiemodellen, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over programma's heen verbetert.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en rationeel combinontwerp mogelijk, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van assets met verbeterde resistentieprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, gene knock-down en kwantitatieve assay-analyse.
- Toegang tot moleculair-biologische instrumentatie voor RT-PCR, Western blot en kolonietelling is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie tussen teams is vereist om de reproduceerbaarheid van de generatie van resistente subclonen te waarborgen.
- Aanpasbaar aan diverse tumorhistotypes en gerichte agentia, hoewel de generatie van subclonen variabel en uitdagend kan zijn.
- Het potentiële risico op het niet verkrijgen van stabiele resistente subclonen moet bij de projectplanning worden meegewogen.
