Name: Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer hoe u resistente subklonen genereert en gevoeligheid herstelt door gen knock-down bij kankercellen. Deze gestandaardiseerde methode identificeert mechanismen van verworven resistentie tegen gerichte therapieën efficiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Dr. Veronica Zanoni voor het bewerken van het manuscript.

Opmerking: Dit protocol is specifiek afgesteld voor de analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verworven resistentie aan trastuzumab van HER-positieve maagkanker cellijnen. Alle laboratoriuminstrumenten die nodig zijn worden gemeld in de Tabel van materialen.
1. generatie van gerichte therapie resistente subklonen
Nota: Dit is de meest kritische en moeilijk te standaardiseren stap in het protocol wijten aan het feit dat verschillende cellijnen verschillende gevoeligheden aan de gerichte therapeutische remmer onafhankelijk van hun histotype of drug-concentratie van de tumor vertonen kunnen gebruikt.
<ol><li>Cultuur NCI-N87 cel lijn in RPMI medium aangevuld met foetaal kalfsserum (10%) en glutamine (2 mM, 1%), als een enkelgelaagde bij 37 ° C, en het zaad op 25 cm2 cultuur kolven.</li>
	<li>Als de startdosis aan het kweekmedium in elke kolf 10 µg/mL trastuzumab toevoegen. De cellen aan de startdosis bloot totdat zij weer gaan groeien. Opmerking: De startdosis van de gerichte therapie-remmer moet 10-fold lager zijn dan de concentratie ervan plasma piek. Plasma piek concentratie is het hoogste niveau van concentratie van de drug gevonden in patiënt bloed meestal na meerdere doses van standaard therapie. Deze waarde kan worden opgehaald uit studies over farmacokinetiek.</li>
	<li>Celgroei controleren met de trypan blauwe uitsluiting methode; celgroei (meestal na een periode van twee tot drie weken) wordt hervat, worden blootgesteld cellen tot een 10-fold hogere dosis concentratie van trastuzumab.</li>
	<li>Bloot cellen aan een geleidelijk aan stijgende dosis van trastuzumab (van 100 µg/mL tot 400 µg/mL) tot cellen blijven groeien (na ongeveer 2 weken) ondanks de aanwezigheid van een hoge drug concentratie (ten minste 2.5 - 4-fold hoger dan de plasma piek).</li>
	<li>
Uitvoeren van een clonogenic-test om te beoordelen van het niveau van weerstand tegen gerichte therapie bij elke wijziging in de concentratie van de doelgroep therapie-remmer in het kweekmedium en relatieve weerstand IC50 index (RR IC50) als volgt definiëren.
	<ol>
<li>Zaad 500 cellen in 24 multi goed cultuur platen. Opmerking: 5 putten moeten worden voorbereid voor elke voorwaardenset.</li>
		<li>Bloot cellen aan toenemende doel therapie remmer (trastuzumab) concentraties van 100 µg/mL tot 400 µg/mL.</li>
		<li>Incubeer de cellen in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 15 dagen.</li>
		<li>Na incubatie, repareren en vlek monsters als volgt.<ol>
<li>Medium en spoelen cellen met 10 mL 1 x PBS verwijderen. Neem 1 x PBS en voeg 2-3 mL van fixatie oplossing (1:7, acetic acid: methanol, (vol/vol)). De fixatie-oplossing verwijderen en toevoegen van 0,5% kristalvioletoplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur</li>
			<li>De Kristalvioletoplossing zorgvuldig verwijderen door met een pipet zuigen en platen in leidingwater te spoelen uit elke kristalviolet oplossing residuen onder te dompelen. Drogen bij kamertemperatuur maximaal 2 dagen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Telling kolonies van meer dan 50 cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop (4 X vergroting). Opmerking: De twee onafhankelijke waarnemers zijn hiervoor nodig.</li>
		<li>RR IC50 berekend als de verhouding tussen de waarde50 IC van doel-therapie-resistente subclone cellen en de waarde van de oorspronkelijke/naïef cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. validatieprotocol voor de kandidaat-lidstaten gerichte therapie resistentie gen (R-gen)
Opmerking: Na de karakterisatie van genexpressie, handtekeningen die samenhangen met de verworven resistentie aan target therapie en elke kandidaat-gen als bestuurder van weerstand worden via onderzocht zal: a) RT-PCR, en b) de westelijke analyse van de vlek.
<ol><li>
RT-PCR in real time
	<ol>
<li>Uittreksel totaal RNA van cellijnen, met behulp van zuur guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform mengsel (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Het uitvoeren van omgekeerde transcriptie (RT) Reacties met behulp van willekeurige hexamer inleidingen en de thermische cycler als volgt instellen: priming bij 25 ° C gedurende 5 minuten, RT bij 46 ° C gedurende 20 min, en RT inactivatie bij 95 ° C gedurende 1 min.</li>
		<li>Gebruik 400 ng van totale RNA voor een 20 µL reactie. Voorbereiden op het reactiemengsel monster als volgt: 7 µL RNase gratis H2O, 2 µL cDNA (10 ng/µL), 1 µL 20 x TL-geëtiketteerden doelgroepen gerichte sonde, en 10 µL 2 x Mix met buffer dNTPs en polymerase van DNA (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>20 µL van het reactiemengsel toevoegen aan elke goed plaat en start het volgende programma: houden van de fase bij 50 ° C gedurende 2 minuten, bij 95 ° C gedurende 10 min (1 cyclus); dan 40 cycli bij 95 ° C voor 15 s en bij 60 ° C gedurende 1 minuut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Westelijke vlek
	<ol>
<li>Schorsingen van de cel herstellen door toevoeging van 2 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% en 2-3 min voor trypsine te werken.</li>
		<li>2 delen van gemiddeld met 10% foetale runderserum te neutraliseren trypsine (bv2 mL medium voor elk 1 mL trypsine) samen en centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 5 min. Discard supernatant en wassen cellen met koude 1 x PBS toevoegen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 5 min en weggeworpen. Resuspendeer de pellet cel met lysis-buffermengsel en incubeer op een rocker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.<ol>
<li>Het bedrag van lysis buffer is afhankelijk van het aantal cellen (bijvoorbeeld, 100 µL voor 1 x 106 cellen); Zorg ervoor om te bereiden verse lysis-buffermengsel telkens. Voor 1 mL lysis buffer voorbereiding (verlof op ijs): gebruiken van 975 µL M-PER zoogdieren lysate buffer, 15 µL protease en phosphatase inhibitors en 10 µL 100 µM PMSF remmers.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Herstellen het supernatant eiwit door cel lysate centrifugeren bij 13.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>De eiwit-concentraties bepalen met behulp van een BCA eiwit bepaling.</li>
		<li>4 x LaemmLi monster Buffer toevoegen aan EiwitSteekproeven (minimaal 20-30 µg van eiwit) en warmte bij 100 ° C gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Gebruik van geprefabriceerd 4-20% gels en laden van 20-30 µg LaemmLi eiwit oplossing en 5-10 µL van eiwit standaard per monster.</li>
		<li>Vul de westelijke vlek ring met TRIS/GLICYNE /SDS 1 x buffer en uitvoeren van gel bij 110 V voor 30-60 min (wanneer tijd Controleer de kleurstof bereikt het einde van de gel stopt, anders lopen voor een paar extra minuten)</li>
		<li>Electroblot eiwit overbrengen naar een membraan PVDF (Zie Tabel van materialen) met behulp van een semi-droge systeem.</li>
		<li>Het membraan door onderdompelen in de juiste eiwit oplossing (melk/BSA 5%) in het roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur geblokkeerd.</li>
		<li>Maak een oplossing van de 1:400 met anti-IQGAP1 primair antilichaam in een melk-oplossing van 5% (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Plaats het membraan in primair antilichaam oplossing op een shaker in een koude kamer 's nachts.</li>
		<li>De volgende dag, het negeren van de antilichaam-oplossing en geniet in T-TBS 1 x oplossing (1 x T-TBS: 1 x Tris Saline Buffer toegevoegd door Tween20 0,1%) in een roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.</li>
		<li>Gooi T-TBS 1 x oplossing en vervangen. Herhaal dit 3 keer.</li>
		<li>Maak een 1:10,000 secundaire muis-antilichamen oplossing door toevoeging van antilichaam voor standaard Western blot detectie (Zie Tabel van materialen) en plaats het membraan op een shaker; laat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
		<li>Negeren van de antilichaam-oplossing en geniet in T-TBS 1 x oplossing in een roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.</li>
		<li>Gooi T-TBS 1 x oplossing en vervangen. Herhaal dit 3 keer.</li>
		<li>Membraan voor 5 minuten weken in een chemiluminescentie oplossing, en beeld van het membraan op een chemiluminescentie imager.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. herstel Target-therapie-remmer gevoeligheid door kandidaat-R-gen Knock-down
<ol><li>
Voorbereiding van de cel
	<ol>
<li>Maak eencellige suspensie door trypsinebehandeling. Transfectie uitvoeren op de dag dat de cellen zijn verguld.<ol>
<li>Wassen NCI-N87 cellen met PBS en Incubeer bij 37 ° C met trypsine/EDTA-oplossing 0,05% voor 5-10 min. 2 toevoegen volume van RPMI gemiddeld met 10% foetale runderserum te neutraliseren trypsine (bv2 mL medium voor elk 1 mL trypsine).</li>
			<li>Cellen tellen met een hemocytometer met trypan blauw kleuring. Zaad 2.5 x 105 cellen (60% samenvloeiing) in een maatkolf van T25-cm-2 voor elke voorwaarde. Opmerking: Het juiste aantal cellen voor het zaaien wordt bepaald door de verdubbeling tijd van de cellijn en de duur van het experiment. Het doel is te bereiken van het doel-gen knock-down voor de gehele duur van het experiment. Negen T25 cm2 flacons zijn ideaal voor Transfectie voorwaarden en de clonogenic assay (3 flacons voor besturingselementen, 3 flacons voor negatieve transfectie besturingselementen, 3 flacons voor gen-target transfectie).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Omgekeerde transfectie
	<ol>
<li>Bereiden van gen-target en negatieve controle transfectie mix voor elke kolf T25 cm2 als volgt.<ol>
<li>Verdun 12,5 µL van elk gen-targeting siRNA oligonucleotides of negatieve controle siRNA oligonucleotides in minimale essentiële transfectie medium (verhouding 1:55; Zie Tabel van materialen).</li>
			<li>Voeg een transfectiereagens kationische liposoom (1:1 verhouding met gentargeting siRNA oligonucleotides; Zie Tabel van materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Opmerking: Het totale volume van de transfectie mix is 700 µL.</li>
			<li>700 µL van het mengsel van de Transfectie aan elke T25 cm2 kolf toevoegen. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Controleer of de gene knock-down door RT-PCR en westelijke vlekkenanalyse. Controleer of de impact van de vermeende R-gen knock-down op de restauratie van de gevoeligheid aan de gerichte therapeutische agent door kolonie vorming experimenten (Herhaal stap 1.5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapies%3A+a+new+generation+of+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+with+small+molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.</a> Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).</li>
<li>Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+human+monoclonal+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Development trends for human monoclonal antibody therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).</li>
<li>Chabner, B. A., Roberts, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline%3A+Chemotherapy+and+the+war+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Timeline: Chemotherapy and the war on cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).</li>
<li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+resistance%3A+surviving+stressful+situations%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations.</a> Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).</li>
<li>Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2C+clinical+indications%2C+and+resistance+mechanisms+in+molecular+targeted+therapies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer.</a> Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).</li>
<li>Ellis, L. M., Hicklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+Targeted+Therapies%3A+Refining+Anticancer+Therapy+in+the+Era+of+Molecular+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology.</a> Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).</li>
<li>Asić, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+mechanisms+of+primary+resistance+differ+from+dominant+mechanisms+of+secondary+resistance+to+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).</li>
<li>Arienti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evidence+of+multiple+mechanisms+underlying+trastuzumab+resistance+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer.</a> Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).</li>
<li>Tanner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+HER-2+in+gastric+carcinoma%3A+association+with+Topoisomerase+IIalpha+gene+amplification%2C+intestinal+type%2C+poor+prognosis+and+sensitivity+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab.</a> Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).</li>
<li>Bang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+in+combination+with+chemotherapy+versus+chemotherapy+alone+for+treatment+of+HER2-positive+advanced+gastric+or+gastro-oesophageal+junction+cancer+%28ToGA%29%3A+a+phase+3%2C+open-label%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773">http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029">http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390</a> (2017).</li>
<li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer%3A+Future+steps+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li>
<li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477(2014).</li>
<li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li>
<li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+%28R%29-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl de persoonlijke en gerichte therapieën hebben ontlokte groeiend enthousiasme, deze zogenaamde 'slimme' therapieën gezicht de dezelfde grote hindernis als traditionele chemotherapie drugs, dat wil zeggen, de snelle en onvoorspelbare verwerving van medicamenteuze resistentie. Ter verbetering van de resultaten van gerichte therapie, moeten-resistentie problemen worden opgelost door middel van een beter begrip van de mechanismen die ze veroorzaken. Hier voorgesteld hebben we een algemeen toegankelijk in ...

In aansluiting op de cruciale ontdekkingen in de moleculaire en cellulaire biologie, zijn een aantal nieuwe gesynthetiseerde antikanker moleculen ontwikkeld om te selectief richten oncogene signaalroutes in een breed scala van soorten van de tumor. Met name twee categorieën van gerichte therapeutische agenten met unieke eigenschappen in oncologie, namelijk synthetische chemische verbindingen en recombinant monoclonal antilichamen, bekend is dat hebben bereikt klinische successen en drastisch veranderde kanker zorg in afgelopen decennia1,2,3.
Niettemin, ondanks hun indrukwekkende eerste reactie op behandeling, het merendeel van de patiënten met kanker hebben ontwikkeld resistentie aan alle gerichte therapeutische agenten, monoklonale antilichamen zowel kinase-remmers. Dientengevolge, is resistentie, de grote hindernis voor de klassieke anti-kanker medicijnen4, nog steeds een grote uitdaging voor opkomende gerichte therapieën5,6.
Weerstand tegen gerichte therapie mogelijk intrinsieke (d.w.z., primaire) of verworven (d.w.z., secundair). Intrinsieke resistentie beschrijft een DOVO gebrek aan respons op therapie, terwijl secundaire weerstand na een periode van reactie op drug behandeling7 optreedt. De laatste is veroorzaakt door uitbraken van kleine cohorten van tumorcellen binnen het grootste deel van de primitieve tumor of genesteld in de distale cryptische anatomische niches, tentoonstellen tot 90% weerstand aan één of meer gerichte therapeutische agenten. Moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van een resistentie aan gerichte therapie vooral gevolg van doel genmutaties en redundante activering van andere pro-overleving signaalroutes, waarvan begrip nog verre van compleet8 is.
In dit werk voorgesteld hebben wij een aanpak op tijd en goedkoop cost-effective om te onderzoeken in vitro mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, de generatie van resistente cellulaire subklonen vanaf de beschrijving monddood maken procedures voor het herstellen van de gevoeligheid aan de Inhibitor van de omwenteling, een cruciaal instrument dat wordt gebruikt voor het testen en valideren van de werkhypotheses gebruikt. In het bijzonder werd onze aanpak gebruikt om te onderzoeken, in maagkanker, de resistentie-mechanismen voor trastuzumab (bijvoorbeeldHerceptin), een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam gericht op het extracellulaire domein van HER2 eiwitten9. Trastuzumab + chemotherapie algemeen aanvaard wordt als de standaardbehandeling van de eerste regel voor HER2-positieve uitgezaaide borstkanker. Dankzij recente Preklinische studies waaruit blijkt dat anti-HER2 therapieën hebben belangrijke activiteit in beide in vitro en in vivo HER2-positieve maagkanker modellen10,11, moleculaire drugs gericht op HER2 geweest uitgebreid onderzocht in klinische proeven, zijn waarvan sommige nog niet afgerond, bij patiënten met gastro-oesofageale kanker12,13,14,15.
Deze studies hebben gewezen op het stijgende aantal patiënten ervaren weerstand tegen trastuzumab16, ook bij wat voor andere gerichte therapeutische remmers is waargenomen. In het bijzonder de respons van trastuzumab was 47% en de gemiddelde totale overleving voor patiënten op trastuzumab + chemotherapie was slechts 2.7 maanden langer dan voor patiënten op chemotherapie alleen17. Dit suggereerde dat terwijl primaire trastuzumab weerstand heerst, secundaire trastuzumab weerstand onvermijdelijk is. Daarom is er dringend behoefte aan het verduidelijken van de mechanismen waardoor HER2-gerichte therapie resistentie in maagkanker, wat nog problematischer gezien de intra-tumoral genetische heterogeniteit van deze neoplasie18.
Mechanismen van resistentie aan trastuzumab in maagkanker gebleken Daarnaast uitdagend om te verklaren, gedeeltelijk als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van betrouwbare preklinische modellen vertegenwoordiger van deze aandoening. Oshima et al. rapporteerde een selectiemethode in vivo van trastuzumab-resistente maagkanker cellijnen, bestaande uit een herhaalde cultuur van een klein residueel peritoneale metastase na behandeling met trastuzumab19. Echter de noodzaak van een behuizing, specifieke dierlijke behandeling deskundigheid, en de goedkeuring van de dier-ethische Commissie toe bijgedragen dat het een methode en kosten-tijdrovend. De aanpak die we in dit werk beschrijven is eenvoudig en breed inzetbaar, en kan gemakkelijk worden uitgebreid tot het onderzoeken van de mechanismen van de weerstand tot andere therapeutische drugs in verschillende tumor histotypes20.

<table><tbody><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol Reagent is een reagens voor het isoleren van hoogwaardige totale RNA of het gelijktijdig isoleren van RNA, DNA en eiwitten uit verschillende biologische monsters</td></tr><tr><td>ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>De iScript cDNA-synthesekit is een gevoelig en gemakkelijk te gebruiken kit voor de synthese van de eerste streng cDNA voor genexpressieanalyse met behulp van real-time qPCR.</td></tr><tr><td>TaqMan gene expressie assay</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expressie Assays bestaan uit een paar ongelabelde PCR-primers en een TaqMan-sonde met een Applied Biosystems FAM- of VIC-kleurmerker op het 5&rsquo;-uiteinde en een minor groove binder (MGB) en een niet-fluorescerende quencher (NFQ) op het 3&rsquo;-uiteinde.</td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagens is ontworpen om een zeer efficiënte extractie van totaal oplosbaar eiwit uit gekweekte zoogdiercellen te bieden.</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) biedt de gemak van één oplossing met volledige bescherming van eiwitmonsters voor cel- en weefsellysaten.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>De Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is een tweecomponenten, hoogprecisie, detergent-compatibele assayreagensset om de totale eiwitconcentratie (A562nm) te meten in vergelijking met een eiwitstandaard.</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>Gebruik 4x Laemmli Sample Buffer voor de bereiding van monsters voor SDS PAGE. Voor reductie van monsters, voegt u een reducerend middel zoals 2-mercaptoethanol toe aan de buffer voorafgaand aan het mengen met het monster.</td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels hebben een nieuwe formulering en kunnen worden gebruikt voor zowel standaard denaturerende eiwitscheidingen als voor native elektroforese.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained Standards zijn verkrijgbaar in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope en Dual Xtra formaten. Alle vier hebben dezelfde gelmigratiepatronen, met 3 hoge-intensiteitsreferentiebanden (25, 50 en 75 kD).</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glycine/SDS is een voorgemengde loopbuffer voor het scheiden van eiwitmonsters door SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs voor snelle, efficiënte overdracht van eiwitten van mini-gels met behulp van het Trans-Blot Turbo Transfer System. Elke vacuümverpakte, gebruiksklare overdrachtspack bevat twee bufferverzadigde ionenreservoirstacks en een voorbevochtigde PVDF-membraan.</td></tr><tr><td>Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugaat voor chemiluminescente of colorimetrische detectie van Precision Plus Protein Unstained Protein Standards of Precision Plus Protein WesternC Protein Standards op western blots.</td></tr><tr><td>Immun-Star WesternC solution</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>Immun-Star WesternC oplossing, een methode voor eiwitdetectie, detecteert midden-femtogram hoeveelheden eiwit.</td></tr><tr><td>Universal Negative Control</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td>Negative Control siRNA heeft geen significante sequentie-overeenkomst met muis-, rat- of menselijke gensequenties. De controle is ook getest in cel-gebaseerde screenings en heeft bewezen geen significant effect te hebben op celproliferatie, levensvatbaarheid of morfologie.</td></tr><tr><td>opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium is een verbeterd Minimum Essential Medium (MEM) dat een vermindering van de aanvulling met foetaal bovien serum met minstens 50% mogelijk maakt zonder verandering in groeisnelheid of morfologie.</td></tr><tr><td>Silencer Select Pre-Designed &amp; Validated siRNA</td><td>Ambion</td><td>4390824</td><td>RNA interferentie (RNAi) is de beste manier om effectief genexpressie te onderdrukken om eiwitfunctie te bestuderen in een breed scala van celtypen.</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens biedt een geavanceerd, efficiënt oplossing voor siRNA-bezorging. Geen ander siRNA-specifiek transfectiereagens biedt zo gemakkelijke en efficiënte siRNA-bezorging in een breed scala aan cellijnen, waaronder gangbare celtypen, stamcellen en primaire cellen, evenals traditioneel moeilijk te transfecteren celtypen.</td></tr><tr><td>Mouse anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>werkconcentratie: 1:400 in 5% melkoplossing</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>werkconcentratie: 1:10000 in 5% melkoplossing</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td><td>dit is een remmer van serine proteasen en acetylcholinesterase</td></tr><tr><td>Thermocycler voor RT-PCR</td><td>MJ Research</td><td>MJ Research PTC-200 Thermal Cycler</td><td>het zorgt voor temperatuurhomogeniteit en een oprampsnelheid van maximaal 3&deg;C/sec. Het protocol kan ook worden uitgevoerd met andere thermocyclers</td></tr><tr><td>Real Time RT-PCR instrument</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCR systeem</td><td>Dit is een vijfkleurig platform dat fluorescentie-gebaseerde polymerasekettingreactie (PCR) reagentia gebruikt om een relatieve kwantificering te bieden met behulp van comparatieve CT assay type. Het protocol kan ook worden uitgevoerd met andere thermocyclers</td></tr><tr><td>Microvolume Spectrofotometers</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>Het biedt een nauwkeurige en snelle acid nucleid meting met behulp van een kleine hoeveelheid monster</td></tr><tr><td>Blotting systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo systeem</td><td>Het voert een semi-droge overdracht uit in enkele minuten</td></tr><tr><td>Beeldverwervingssysteem en geldocumentatie</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemidoc beeldsysteem</td><td>Het is eenvoudig te gebruiken voor

op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente subclone generatie en gevoeligheid herstellen door gene knock-down

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

De afgelopen twee decennia hebben gezien een verschuiving van cytotoxische medicatie naar gerichte therapie in de medische oncologie. Hoewel gerichte therapeutische agenten hebben aangetoond indrukwekkender klinische werkzaamheid en geminimaliseerde bijwerkingen dan traditionele behandelingen, is resistentie de belangrijkste beperking op hun uitkeringen geworden. Verschillende preklinische/in vitro/in vivo modellen van verworven resistentie aan gerichte agentia in de klinische praktijk hebben ontwikkeld voornamelijk met behulp van twee strategieën: i) genetische manipulatie voor de modellering van genotypen van verworven resistentie, en ii) in vitro / in vivo selectie van resistente modellen. In het huidige werk stellen wij een verenigende raamwerk, voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, uitgaande van de generatie van resistente cellulaire subklonen naar de beschrijving van Silencing procedures gebruikt voor het herstellen van de gevoeligheid aan de Inhibitor van de omwenteling. Deze eenvoudige tijd en goedkoop cost-effective benadering is breed inzetbaar en kan gemakkelijk worden uitgebreid voor het onderzoek naar resistentie-mechanismen tot andere drugs gerichte therapeutische in verschillende tumor histotypes.

Figuur 1 schetst het kader van de experimentele procedure. Drie maagkanker-cellijnen uiting van een hoog niveau van HER2 en gevoelig voor trastuzumab (IC50 < piek plasma niveau van drug, figuur 2A, linker grafiek) waren gegroeid in kweekmedium dat de gerichte therapeutische agent. Een dosis 10-fold lager dan de piek plasma concentratie van trastuzumab (10 µg/mL) werd ingesteld als de startdosis, en geleidelijk verhoogd...

Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Het algemene doel van deze preklinische platform is om een standaardprocedure te bieden om de mechanismen die verworven resistentie tegen gerichte therapieën aansturen te identificeren en te karakteriseren. Deze methode kan helpen om genome drive in de oncologie te implementeren, in het bijzonder om belangrijke vragen over tumorheterogeniteit en de meerdere mechanismen die verantwoordelijk zijn voor verworven resistentie tegen gerichte therapieën aan te pakken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de tijd- en kosteneffectieve aanpak die de in-vitro onderzoek van resistentiemechanismen tegen gerichte therapie toestaat.De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot kankertherapie, aangezien longresistentie nog steeds een uitdaging vormt voor opkomende gerichte therapieën. Deze methode kan inzicht bieden in het mechanisme dat betrokken is bij resistentie tegen gerichte therapie, maar kan ook worden gebruikt om de werkzaamheid van conventionele chemotherapeutische middelen te bestuderen. Over het algemeen zullen operators die deze methode gebruiken moeite hebben met een generatie van geneesmiddelresistente subklonen, de stap die het moeilijkst te standaardiseren is.We b

looking-for-driver-pathways-acquired-resistance-to-targeted-therapy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.

Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics

Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.

Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde evaluatie van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte signaleringsremmers in NSCLC-patiënt-afgeleide organoïdemodellen.

Profileringsgevoeligheid voor gerichte therapieën in EGFR-mutante NSCLC-patiënt-afgeleide organoïden

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van chemoresistente cellen met behulp van een dosis-escalatie-methode, gevolgd door een CRISPR/Cas9-gebaseerde screen met een gerichte sgRNA-bibliotheek die epigenetische modifiers gebruikt om regulatoren van verworven chemoresistentie te identificeren. Het protocol biedt ook meerdere optimalisatiepunten die zijn afgestemd op chemoresistente celmodellen, en biedt een robuust kader voor onderzoekers die resistentiemechanismen onderzoeken.

Epigenoom-brede CRISPR-Cas9-gebaseerde knockout-screens op chemoresistente cellen

Leer hoe u resistente subklonen genereert en gevoeligheid herstelt door gen knock-down bij kankercellen. Deze gestandaardiseerde methode identificeert mechanismen van verworven resistentie tegen gerichte therapieën efficiënt.

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down (Video) | JoVE Journal

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

Meer video's verkennen