Name: Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Leer een elektrochemische DNA-biosensor ontwikkelen voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus met behulp van polylactaat-gestabiliseerde goudnanodeeltjes op koolstofelektrodes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs wil erkentelijk voor de steun van Universiti Putra Maleisië.

Opmerking: Alle chemische en biochemische reagentia moeten worden gebruikt moeten worden van p.a. en gebruikt zonder verdere zuivering. Alle oplossingen met behulp van steriel gedeïoniseerd water voor te bereiden. Autoclaaf alle glaswerk vóór sterilisatie.
Let op: Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van laboratoriumactiviteiten met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast ' glovebox ') en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, gesloten-teen schoenen).
1. fabricage en karakterisering van bewerkt elektrode met behulp van PLA-AuNPs
<ol><li>
Bereiding en karakterisatie van PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Snel toevoegen van 10 mL Natriumcitraat oplossing (38.8 mM) tot 100 mL kokend waterige chloroauric zure oplossing (1 mM) en afkoelen tot omgevingstemperatuur. Observeer de veranderingen in kleur in de bereide oplossing van de AuNPs die als geel, wijzigingen in zwartachtig begint en eindigt uiteindelijk als donker Robijnrood.</li>
		<li>Plaats de PLA-pellets in een mal van roestvrij staal voor het smeltproces en verwarm ze bij een temperatuur van 190 ° C gedurende 10 minuten volgen met de dringende procedure: leg ze onder een druk van 2,2 MPa voor 1 min als onderdeel van de voorbereiding van PLA blad. Het PLA blad zal zijn klaar voor gebruik na afkoelen voor ongeveer 3 h.</li>
		<li>Krachtig roeren, Los 0.68 mg PLA bladen in 5 mL chloroform bij kamertemperatuur. Meng de opgeloste PLA met 10 mL van de oplossing AuNPs eerder bereid en roer het homogeen bij kamertemperatuur. De homogene mengsels kunnen vervolgens worden aangeduid als PLA-AuNPs en gekenmerkt met behulp van UV-Vis, XRD, TEM en FESEM met EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding en karakterisatie van gemodificeerde gezeefdrukt koolstof elektrode Opmerking: Het SPCE gebruikt in deze studie omvat een drie-elektrode-systeem: een teller-elektrode, een koolstof werken elektrode en een Ag/AgCl-elektrode.<ol>
<li>Pipetteer 25 µL van de homogene oplossing van PLA-AuNPs op de SPCE en vervolgens de lucht droog het snel voor 24 h vóór gebruik.</li>
		<li>Elektrochemisch karakteriseren de gemodificeerde elektroden, SPCE/PLA-AuNPs, in ferro kaliumcyanide (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) voor het meten van de werkzame oppervlakte, elektrochemische impedantie spectroscopie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, en stabiliteit30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ontwikkeling van de elektrochemische DNA Biosensor
<ol><li>
Sonde voorbereiding Opmerking: De sequenties van de ssDNA sonde en cDNA werden gekozen op basis van informatie van het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) database.<ol>
<li>Aankoop synthetische oligonucleotides (20-mer ssDNA sonde, 20-mer cDNA 20-mer mismatched DNA en 21-mer niet-cDNA) als gelyofiliseerd poeder uit commerciële laboratoria, op basis van de volgende reeks: thiolated ssDNA sonde: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' cDNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 ' één-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC-ṪTAATCCG - 3 ' drie-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT-Ċ-ṪṪTAATCCG - 3 ' niet-cDNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '</li>
		<li>Bereiden van stamoplossingen van alle oligonucleotides (100 µM) met behulp van een steriele TE oplossing (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) in analytische gedeelten is gesplitst. Houd dit in-4 ° C en breng de juiste verdunningen enkel voorafgaand aan het gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimalisatie van immobilisatie en kruising Opmerking: Een SPCE gewijzigd met PLA-AuNPs, aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs, werd gebruikt voor deze studie en een druppel gieten methode werd gebruikt voor de DNA immobilisatie en kruising.<ol>
<li>Ten eerste het immobiliseren van 25 µL van thiolated sonde van de ssDNA op de SPCE/PLA-AuNPs en dan lucht droog het gedurende 24 uur bij kamertemperatuur, waarna het zal worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Optimalisatie van de immobilisatie conditie bepalen met behulp van drie factoren: de concentratie van ssDNA (variërend van 0.2 tot 1.4 µM), tijd (variërend van 30 tot 210 min.) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C).</li>
		<li>Pipetteer 25 µL van het cDNA op het oppervlak van SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA voor het uitvoeren van de kruising gebeurtenis, waarna het kan worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Optimalisatie van de conditie van de kruising via de twee factoren van tijd (variërend van 5 tot 30 min) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C) te bepalen.</li>
		<li>Dompel de geïmmobiliseerdet en gehybridiseerde elektroden in 20 µM MB voor 30 min. het niet-specifiek geadsorbeerde DNA en overtollige MB verwijderen door te wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en dan spoelen met gedeïoniseerd water. Maatregel de huidige piek van MB reductie met behulp van DPV techniek. Uitvoeren van de meting van de DPV met 0,1 M PBS (pH 7) met geen indicator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karakterisering van de gefabriceerde DNA biosensor
	<ol>
<li>Dompel de SPCE/PLA-AuNPs in 20 µM MB voor 30 min, wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en spoel na met gedeïoniseerd water voorafgaand aan meten. Volg een soortgelijke procedure voor alle interacties met inbegrip van de sonde DNA, cDNA niet-overeenkomende DNA en niet-complementaire DNA-monsters.</li>
		<li>Meet de elektrochemische vermindering. Opmerking: We gemeten met behulp van een commercieel vervaardigde Autolab met interfacesoftware DPV. De DPV metingen van de MB elektrochemische vermindering uitgevoerd op een potentieel variërend van -0,5 V tot 0,25 V, met een mogelijke stap van 0.005 V, modulatie amplitude van 0,05 V, en een scanfrequentie van 7.73 mVs-1 in 0,1 M PBS (pH 7), waarin geen indicator. De selectiviteit, de gevoeligheid, de reproduceerbaarheid, en de stabiliteit van de warmte van de gefabriceerde DNA biosensor werden verder bestudeerd. Gerapporteerde resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde waarde metingen in drie wordt gerepliceerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bevestiging van de gefabriceerde DNA Biosensor met behulp van echte monsters
<ol><li>Voorbereiding van de bacteriestammen
	<ol>
<li>Selecteer bacteriële monsters op basis van hun significante besmetting van zeevruchten31,32 . Opmerking: V. parahaemolyticus als referentie spanningen en 8 andere bacteriestammen (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella longontsteking, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus, en Vibrio alginolyticus) van de gemeenschappelijke foodborne pathogen werkten voor de elektrochemische DNA biosensor validatie in deze studie.</li>
		<li>Voeren een routine subcultuur van bacteriestammen op hun respectieve agar elke twee weken te handhaven hun levensvatbaarheid, Zie tabel 1 voor cultuuromstandigheden.</li>
		<li>Behoud op lange termijn van de bacteriestammen in hun respectieve groeiende bouillon met 20% (v/v) glycerol bij-80 ° C als glycerol bacteriën beschermt door te voorkomen dat de vorming van ijskristallen die hen tijdens het vriesproces beschadigen kunnen handhaven. Inoculeer vervolgens een lus van bewaarde bacteriële celcultuur in glycerol voorraden in de respectieve Bouillon. Incubeer de Bouillon volgens hun respectieve groei tijd- en temperatuurdisplays wanneer nodig te doen herleven van de bacteriën.</li>
		<li>Bepaalt de hoeveelheid V. parahaemolyticus cellen met behulp van een verspreiding plaat techniek33, een standaard en een bekende methode voor het opsommen van micro-organismen afkomstig van een reeks verdunningen.<ol>
<li>Cultuur V. parahaemolyticus in Trypticase soja Bouillon (TSB + 3% NaCl) bij 37 ° C in een 140-rpm schudden voorwaarde. Breng vervolgens 1 mL van de cultuur van de cel van de bacteriën in 9 mL TSB + 3% NaCl te verkrijgen van de verdunningsfactor van een 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Herhaal deze stap negen keer om een volledige serie van maximaal 10-10 verdunningsfactor. Vervolgens verspreid 0,1 mL van elk verdunningsfactor (vanaf 10-1 tot 10-10) op een Vibrio van selectieve agarplaat kolonie tellen, respectievelijk. Incubeer de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Gebruik een Kolonieteller tellen van afzonderlijke kolonies en vervolgens terug-Bereken (graaf het CFU/afgepipetteerde bedrag x verdunningsfactor) om een kolonie-vormende eenheid per milliliter dichtheid (CFU mL-1). De concentratie van de kolonievormende eenheden (CFUs) in de cel suspensies van de bacteriën uit de plot van de kalibratie van CFU mL-1 tegen extinctie ontlenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de PCR-test
	<ol>
<li>Uittreksel genomic DNA na een gewijzigde lysis procedure34gekookt. Eerste, streep een individuele bacteriële stam op agarmedia en het enten in Bouillon media, gevolgd door het aan het broeden op de relatieve groei voorwaarde, een 140 rpm schudden voorwaarde.</li>
		<li>Pipetteer een cultuur van 1 mL Bouillon in een micro centrifugebuis. Centrifugeer dit bij 4830 x g- en 4 ° C voor 1 min te verkrijgen van de pellets. Ongeveer 500 µL van steriele buffer TE gebruiken voor resuspensie met de pellet. Houd de resulterende schorsing gedurende 10 minuten bij 98 ± 2 ° C in een blok van de verwarming en onmiddellijk het koelen bij-18 ° C gedurende 10 min te lyse de cellen en de vrijgave van het DNA.</li>
		<li>Centrifugeer het genomic DNA bij 4830 x g- en 4 ° C gedurende 3 minuten aan een duidelijke schorsing verkrijgen en houden van het supernatant bij-20 ° C voor verder gebruik. Gebruik een biophotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht) om te bepalen van de concentratie en zuiverheid van de geëxtraheerde genomic DNA en vervolgens identificeren alle stammen met behulp van standaard biochemische tests35 en controleren door 16S rRNA gen sequencing36. Ten slotte, denatureren van de genomic DNA op 92 ° C gedurende 2 minuten en snel afkoelen in ijswater alvorens tot de biosensor.</li>
		<li>Verder bevestigen de aanwezigheid V. parahaemolyticus met behulp van PCR te richten op het toxR-gen. Deze procedure uitvoeren in een thermocycler met behulp van een primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' en 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimaliseren van de PCR versterking in een volume van de totale reactie van 25 µL bestaande uit steriel water (15,5 µL), buffer (5 µL) primer (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA sjabloon (2 µL) en polymerase van DNA Taq (0.2 µL, 10 x).</li>
		<li>Goed mengen van de componenten en de PCR versterking voor de doel-sequence in een thermocycler geprogrammeerd voor 30 cycli van versterking te regelen. In onze studie, bestond elke cyclus van drie-stap reacties dwz., eerste denaturatie (94 ° C, 3 min) gevolgd door 30 cycli van denaturatie (94 ° C, 1 min.), gloeien (63 ° C, 1.5 min) en extensie (72 ° C, 1.5 min), gevolgd door definitieve extensie (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Bepaal de versterkte producten en hun grootte via elektroforese op 1,5% agarose gel. Het vastleggen van de beelden van de gel met een commercieel geproduceerde gel-documentatie systeem.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van de monsters van de kokkel
	<ol>
<li>Verse monsters krijgen. Opmerking: Onze verse kokkels (Anadara granosa) werden verkregen uit de natte markt Serdang, Selangor, en snel gebracht naar het laboratorium in een koelere koelbox voor analyse. Verdeel de monsters in 2 groepen, namelijk de behandelde en onbehandelde groep, ervan uitgaande dat de kokkels gelijkmatig zijn geoogst vanaf het begin van de oogst tot het plaatsen van hen in koude opslag.</li>
		<li>Pre-Treat kokkels in de behandelde groep door deze te slaan bij-20 ° C gedurende 24 uur, gevolgd door de blootstelling aan UV-licht bij 20 ° C gedurende 4 uur voorafgaand aan DNA-extractie. Opmerking: De vriestemperatuur en UV-blootstelling gebruikt voor de gecontroleerde groep doodt of op zijn minst beperkt de natuurlijk accumuleren V. parahaemolyticus in de kokkels. Niet van toepassing een hogere regime van pasteurisatie van 70 ° C, aangezien het doel van de gecontroleerde voorwaarde in deze studie is om na te bootsen de werkelijke situatie van de verse kokkels. Ondertussen, analyseren monsters rechtstreeks vanuit de onbehandelde groep zonder enige voorbehandeling zodra ze in het laboratorium aankomen.</li>
		<li>Subcultuur een stam van V. parahaemolyticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Bepalen van het aantal levensvatbare cellen in het entmateriaal via beplating van passende verdunningen van TSB (3% NaCl) op Certificeringsinstantie om het verkrijgen van een entmateriaal van 104 CFU mL-1 van V. parahaemolyticus. Elke kokkel in gedistilleerd water wassen en schrobben het vrij zijn van vuil voordat u steriel pincet in een laminaire flow kabinet om de weefsels van de shell.</li>
		<li>Meng ongeveer 10 g kokkel weefselsteekproeven met een homogenizer in 90 mL steriele TSB (3% NaCl) voor 60 s. toevoegen een bekende hoeveelheid V. parahaemolyticus tot 9 mL van de Bouillon gehomogeniseerde monster voor de verrijkte monsters. Gebruik de unspiked monsters als een negatieve controle. Schatten van de graven van de cel van de V. parahaemolyticus spiked op de kokkel monsters door plating 0,1 mL van de monsters op CA, en vervolgens 1 mL van de monsters in een microcentrifuge buis voor DNA pipetteren proef extractie, moeten worden gebruikt voor de biosensor en PCR assay.</li>
		<li>Pak de genomic DNA van de V. parahaemolyticus uit de monsters van het puntige en unspiked na een gewijzigde lysis procedure36gekookt. Tot slot, het bepalen van de DNA-concentratie en zuiverheid een bio fotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht).</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De kritische stappen in een kader voor de succesvolle ontwikkeling van dit soort elektrochemische biosensor zijn selectie van passende biologische erkenning elementen voor de transducer (nucleïnezuur of DNA hier); chemische aanpak voor de bouw van de sensing laag van de transducer; transductie materiaal; optimalisatie van DNA immobilisatie en kruising; en validatie van de ontwikkelde biosensor met behulp van echte monsters.
Core aan de succesvolle ontwikkeling van een gevoelige en selectieve e...

Een belangrijk onderwerp van openbare en wetenschappelijke debat in de afgelopen jaren, voedselvergiftiging is vooral geassocieerd met 3 agenten: micro-organismen1, chemische stoffen2en3van de parasieten. Besmet voedsel kan ernstige gezondheidsproblemen veroorzaken bij de mens, vooral in de hogere risicogroep voor mensen met een zwak immuunsysteem, ouderen, zwangere vrouwen, baby's en jonge kinderen4. Met meer dan een miljoen gevallen van acute diarree zich jaarlijks bij kinderen jonger dan 5 jaar in Afrika, Azië en Latijns-Amerika, voedselvergiftiging is een belangrijke wereldwijde ziekte5,6 en de World Health Organization heeft vastgesteld micro-organismen als de belangrijkste contribuant7. Vibrio parahaemolyticus onderscheidt zich onder de meest bekende virulente stammen. Meestal gevonden in kustgebieden, estuariene en mariene omgevingen8, is het een gram-negatieve bacterie, die actief zijn in hoge zout omgevingen wordt, en veroorzaakt ernstige menselijke gastro-enteritis toen gegeten in onvoldoende gekookt, onjuist afgehandelde of rauw marine producten-9. Zorg bovendien voor bestaande medische aandoeningen bij sommige mensen hen vatbaar voor infectie, sepsis of oor infecties die voortvloeien uit de V. parahaemolyticus10wond. De virulentiefactoren van V. parahaemolyticus hemolysine zijn onderverdeeld in twee soorten die tot de pathogenese van de ziekte bijdragen: thermostable directe hemolysine (TDH) gecodeerd door tdh genen en TDH-gerelateerde hemolysine gecodeerd door trh genen11. De markers (tdh en trh genen) van de virulentie van de V. parahaemolyticus zijn voornamelijk gevonden in klinische monsters in plaats van milieu exemplaren.
V. parahaemolyticus bezit het vermogen om te overleven onder een brede waaier van voorwaarden, snel reageren op veranderingen in het milieu12. Het mechanisme voor proliferatie escaleert zijn potentieel gevaar naarmate de toxiciteit in parallel met cel massa13toeneemt. Erger nog, klimaatverandering is het verstrekken van deze bacteriën met voldoende voorwaarden om te versnellen hun cel bevolking groei14. Als gevolg van de hoge frequentie moet V. parahaemolyticus worden gecontroleerd langs de levensmiddelenketen, met name in de handels- en productie van zeevruchten omdat deze producten waar ze worden aangetroffen in enorme hoeveelheden15,16 over de hele wereld. Op dit moment de bacteriën worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van een aantal methoden, met inbegrip van biochemische tests, verrijking en selectieve media17, enzyme-linked immunomagnetic sorptiemiddel assay (ELISA)18, pulse-field gelelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinatietests en polymerase kettingreactie (PCR) tests20. Deze methoden vereisen meestal gekwalificeerd personeel, geavanceerde instrumenten en moeizame technieken die geen informatie over verontreiniging onmiddellijk geven. Dit beperkt ernstig de kans op schadelijke verontreiniging en on-site toepassingen onmiddellijk te detecteren. Snelle detectieprogramma's blijven een belangrijke uitdaging is.
Biosensing is in opkomst als een veelbelovende optie voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers omdat het biedt u een tijdbesparende, rendabele, praktische en real-time analyse methode21,22,23,24 . Al zijn er veel positieve resultaten voor de detectie van de analyt in verrijkte monsters en standaardoplossing met behulp van biosensoren, is er echter nog steeds een gebrek aan onderzoek toegepast op echte monsters in waterige mengsels of organische extracten25. Onlangs, elektrochemische biosensoren met behulp van directe en/of indirecte deoxyribonucleic acid (DNA) detectie verhoogde aandacht onder wetenschappers, als gevolg van hun specifieke detectie van de complementaire doelstelling via een kruising gebeurtenis26 hebben gekregen , 27 , 28 , 29. deze unieke benaderingen zijn stabieler in vergelijking met enzym gebaseerde biosensoren, waardoor een veelbelovende technologie voor miniaturisatie en commercialisering. Het doel van de studie gemeld hier is voor de bouw van een snel hulpmiddel dat V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit, gevoeligheid en bruikbaarheid detecteren kan, gebaseerd op de DNA sequentie specificiteit tijdens hybridisatie. Identificatie strategieën betrekking hebben op de combinatie van polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs)30 en gezeefdrukt Koolelektroden (SPCEs) in aanwezigheid van de kruising indicator, methyleenblauw (MB). Het potentieel van de ontwikkelde detectie constructie wordt verder onderzocht met behulp van bacteriën DNA lysate en verse kokkel monsters.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethaan tetra-azijnzuur</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Twice basisch natriumfosfaat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumwaterstoffosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Goud (III) chloorhydride trihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methyeenblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisch natriumfosfaat, monohydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(melkzuur)hars, commerciële kwaliteit 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>R&amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferraat III</td><td>R&amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat anhydrisch zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix met Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP's</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosine methyleenblauw agar&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol eierdooier polymyxine agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een elektrochemische dna biosensor te detecteren een foodborne pathogen

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is een gemeenschappelijk foodborne ziekteverwekker die aan een groot aantal problemen voor de volksgezondheid wereldwijd bijdraagt, aanzienlijke invloed zijn op het tempo van de menselijke mortaliteit en morbiditeit. Conventionele methodes voor het opsporen van V. parahaemolyticus zoals cultuur gebaseerde methoden, immunologische testen en moleculaire gebaseerde methoden vereisen ingewikkeld monster behandeling en zijn duur, tijdrovend en vervelend. Onlangs, biosensoren hebben bewezen een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid. Dit onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een snelle methode voor het opsporen van V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit en gevoeligheid op basis van de beginselen van DNA hybridisatie. In het werk, werd karakterisering van gesynthetiseerde polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs) bereikt met behulp van röntgendiffractie (XRD), UV-zichtbaar-spectroscopie (UV-Vis), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), veld-emissie Scanning elektronen microscopie (FESEM), en cyclische voltammetrie (CV). Ook voerden we verder testen van stabiliteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de PLA-AuNPs. We vonden dat de PLA-AuNPs een degelijke structuur van gestabiliseerde nanodeeltjes in waterige oplossing gevormd. We hebben ook vastgesteld dat de gevoeligheid verbeterd als gevolg van de kleinere gratis overdracht (Rct) weerstandswaarde en een toename van actieve oppervlakte (0.41 cm2). De ontwikkeling van onze DNA biosensor was gebaseerd op de wijziging van een gezeefdrukt koolstof-elektrode (SPCE) met PLA-AuNPs en het gebruik van methyleenblauw (MB) als de redox-indicator. Wij beoordeeld vinden de gebeurtenissen immobilisatie en kruising door differential pulse voltammetrie (DPV). Vonden we dat aanvullende, niet-complementaire en niet-overeenkomende oligonucleotides werden specifiek onderscheiden door de verzonnen biosensor. Het bleek ook betrouwbaar gevoelige detectie in Kruisallergie studies tegen verschillende voedsel overgedragen ziekteverwekkers en de identificatie van de V. parahaemolyticus in verse kokkels.

Vorming van AuNPs werd geopenbaard door de verandering in de kleur van de waterige oplossing met Natriumcitraat aanwezig. Dit veroorzaakt de kleur overstappen van licht geel op een diep Robijnrood. De generatie van PLA-AuNPs werd bevestigd van de UV-vis-spectra (Figuur 1), waar de groei van de oppervlakte plasmon resonantie (SPR) piek werd aangetroffen bij ongeveer 540 nm. De oprichting en het bestaan van PLA-AuNPs werd aangegeven op de 500-600 nm golflengte ...

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Voedseloverdraagbare pathogenen dragen wereldwijd bij aan een groot deel van de volksgezondheidsproblemen, die de menselijke sterfte- en morbiditeitsgraad aanzienlijk beïnvloeden. Conventionele methoden voor de detectie van voedseloverdraagbare pathogenen vereisen gecompliceerde monsterbehandeling en zijn tijdrovend. Onlangs hebben biosensoren zich bewezen als een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie en praktische bruikbaarheid.De ontwikkeling van biosensoren is gebaseerd op een gemodificeerde elektrode met goudnanodeeltjes gestabiliseerd door polymelkzuur. De schermbedrukte koolstofelektrode werd gemodificeerd om het actieve oppervlak van de werkelektrode te vergroten. Metheenblauw, dat als redoxcomplex werd gebruikt, heeft een sterke binding met enkelstrengs DNA van geïmmobiliseerd sonde-DNA.Deze relatie van hoge affiniteit wordt weergegeven door een hoge piekstroom. Hybridisatie van enkelstrengs DNA met zijn complementaire sequentie vervangt de gebonden metheenblauwmoleculen, wat de stroom van de differentiaalpulsvoltammetrie vermindert. Dit kan te wijten zijn aan een kleinere hoeveelheid metheenblauw op het oppervlak van de gemodific

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Source: Barber, A. E., et al. Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the detection of specific analytes using a bacterial biosensor. A bacterial culture carrying a plasmid with a red fluorescent protein (RFP) gene under an analyte-sensitive promoter is taken. After thoroughly wiping the test surface, a small section of the wipe is immersed in the culture and incubated. The analyte...

Detection of a Target Analyte Using a Bacterial Biosensor

This video demonstrates a technique to detect bacterial contaminants in food and water samples using nanosensors. The target pathogenic bacteria are detected through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Detecting Bacterial Contamination Using Magneto-fluorescent Nanosensors

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande...

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

We beschrijven een protocol voor colorimetrische detectie van E. coli met behulp van een gemodificeerde lakmoestest die gebruikmaakt van een RNA-splitsend DNAzyme, urease en magnetische kralen.

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Salmonella spp. /Shigella spp. zijn gemeenschappelijke ziekteverwekkers toegeschreven aan diarree. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. PCR in real time te gebruiken in combinatie met begeleide cultuur.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Leer een elektrochemische DNA-biosensor ontwikkelen voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus met behulp van polylactaat-gestabiliseerde goudnanodeeltjes op koolstofelektrodes.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Meer video's verkennen