Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Voedseloverdraagbare pathogenen dragen wereldwijd bij aan een groot deel van de volksgezondheidsproblemen, die de menselijke sterfte- en morbiditeitsgraad aanzienlijk beïnvloeden. Conventionele methoden voor de detectie van voedseloverdraagbare pathogenen vereisen gecompliceerde monsterbehandeling en zijn tijdrovend. Onlangs hebben biosensoren zich bewezen als een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie en praktische bruikbaarheid.

De ontwikkeling van biosensoren is gebaseerd op een gemodificeerde elektrode met goudnanodeeltjes gestabiliseerd door polymelkzuur. De schermbedrukte koolstofelektrode werd gemodificeerd om het actieve oppervlak van de werkelektrode te vergroten. Metheenblauw, dat als redoxcomplex werd gebruikt, heeft een sterke binding met enkelstrengs DNA van geïmmobiliseerd sonde-DNA.

Deze relatie van hoge affiniteit wordt weergegeven door een hoge piekstroom. Hybridisatie van enkelstrengs DNA met zijn complementaire sequentie vervangt de gebonden metheenblauwmoleculen, wat de stroom van de differentiaalpulsvoltammetrie vermindert. Dit kan te wijten zijn aan een kleinere hoeveelheid metheenblauw op het oppervlak van de gemodificeerde elektrode met complementair dubbelstrengs DNA, wat werd veroorzaakt door een onbereikbare interactie tussen guaninebasen.

De kleur van de bereide oplossingen verandert van geel naar zwartachtig en ten slotte naar donker robijnrood. Dit duidt erop dat het goudzout is gereduceerd door de citratonen. Het opgeloste polymelkzuur werd gemengd met de eerder bereide oplossing van goudnanodeeltjes en vervolgens homogeen geroerd bij kamertemperatuur, wat vervolgens werd aangeduid als polymelkzuur gestabiliseerd goudnanodeeltjes.

Ultraviolet zichtbaar spectrum, röntgendiffractie, transmissie-elektronenmicroscopie en veld emissie rasterelektronenmicroscopie met energiedispersief röntgenspectrum werden gebruikt om de polymelkzuur gestabiliseerd goudnanodeeltjes te karakteriseren. Ongeveer 25 microliters van de homogene oplossing van polymelkzuur gestabiliseerd goudnanodeeltjes werd snel gepipetteerd op de schermbedrukte koolstofelektrode en gedurende 24 uur aan de lucht gedroogd voor gebruik. De gemodificeerde elektroden werden vervolgens elektrochemisch gekarakteriseerd in kaliumferrocyanide om de actieve oppervlakte te meten, elektrochemische impedantiespectroscopie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en stabiliteit.

Optimalisatie van de immobilisatieconditie werd bepaald met behulp van drie factoren, de concentratie van enkelstrengs DNA variërend van 0,2 tot 1,4 micromolair, tijd variërend van 30 tot 220 minuten en temperatuur variërend van 25 tot 75 graden Celsius. Aan de andere kant werd optimalisatie van de hybridisatieconditie bepaald via twee factoren, namelijk tijd variërend van vijf tot 35 minuten en temperatuur variërend van 25 tot 75 graden Celsius. De behandelde gemodificeerde elektroden werden vervolgens gedurende 30 minuten in 20 micromolair metheenblauw ondergedompeld.

De niet-specifiek geabsorbeerde DNA en overtollig metheenblauw werden verwijderd door wassen met saline acetaat buffer pH 4,5 en vervolgens gespoeld met gedeïoniseerd water. De piekstroom van metheenblauw reductie werd gemeten met behulp van de differentiaalpulsvoltammetrie techniek. De differentiaalpulsvoltammetrie meting werd uitgevoerd met behulp van fosfaatbufferoplossing pH 7,0 die geen indicator bevatte.

Een soortgelijke procedure werd uitgevoerd voor alle interacties. Vibrio parahaemolyticus als referentiestammen en acht andere bacteriestammen, namelijk Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus en Vibrio alginolyticus van de meest voorkomende voedseloverdraagbare pathogeen werden gebruikt voor de validatie van de elektrochemische DNA biosensor in deze studie. Een routinematige subcultuur van bacteriestammen op hun respectieve agar werd elke twee weken uitgevoerd om hun levensvatbaarheid te behouden.

De hoeveelheid Vibrio parahaemolyticus cellen werd bepaald met behulp van een verspreidingsplaattechniek. Een millimeter van de bacteriecelcultuur werd overgebracht in negen millimeter trypticase sojabouillon met 3% natriumchloride om een verdunningsfactor van 10 te verkrijgen. Vervolgens werd 0,1 milliliter van elke verdunningsfactor, beginnend bij eenmalige verdunningsfactor van 10 tot 10-voudige verdunningsfactor van 10, verspreid op een plaat CHROMagar Vibrio voor kolonietelling, respectievelijk.

De kokkels werden verkregen van de natte markt en vervolgens snel naar het laboratorium gebracht in een ijsbox voor analyse. De kokkels werden verdeeld in twee groepen, namelijk de behandelde en onbehandelde groep met de veronderstelling dat de kokkels uniform werden geoogst vanaf het begin van de oogst totdat ze in koude opslag op de markt werden geplaatst. Kokkels in de behandelde groep werden voorbehandeld door ze gedurende 24 uur op min 20 graden Celsius te bewaren, gevolgd door blootstelling aan ultraviolet licht bij 20 graden Celsius gedurende vier uur voorafgaand aan DNA-extractie.

De vriestemperatuur en ultraviolette blootstelling die voor de controlegroep werd gebruikt, zou het vermoorden of ten minste beperken van de natuurlijk accumulerende voedseloverdraagbare pathogenen in de kokkels. Een hoger pasteurisatieregime van 70 graden Celsius werd niet toegepast, aangezien het doel van de gecontroleerde conditie in dit onderzoek was om de werkelijke situatie van de verse kokkels na te bootsen. Ondertussen werden monsters van de onbehandelde groep direct geanalyseerd zonder enige voorbehandeling zodra ze in het laboratorium aankwamen.

Kokkels werden gewassen in gedestilleerd water en schoongemaakt van vuil voordat de weefsels van de schelpen werden verwijderd met behulp van steriele pincetten en een laminair flowkast. Ongeveer 10 gram kokkelweefselmonsters werden gehomogeniseerd met de homogenisator in 19 milliliter steriele trypticase sojabouillon met 3% natriumchloride gedurende 60 seconden. Een bekende hoeveelheid voedseloverdraagbare pathogenen werd vervolgens toegevoegd aan negen millimeter van het gehomogeniseerde monsterbrouwsel voor de gestikte monsters.

De ongesti