Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

Het algemene doel van deze procedure is om gestandaardiseerde omstandigheden te bieden voor succesvolle zaadsterilisatie van een groot aantal Arabidopsis-genotypen, terwijl microbiële groei wordt voorkomen. Deze methode stelt u in staat om honderden zaadmonsters tegelijk te steriliseren, waardoor een kritische stap in de bereiding van plantmateriaal wordt vereenvoudigd in de velden van genomica, proteomics, metabolomics en andere high-throughput studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het omstandigheden biedt waarin efficiënte sterilisatie wordt gecombineerd met een hoge kiemingsgraad voor een groot aantal zaadmonsters.

Begin met het bereiden van een 50% bleekoplossing met gedestilleerd water. Voeg voor elke 200 milliliter bleekoplossing 50 microliter TWEEN 20-detergent toe. De bleekoplossing kan maximaal een maand worden bewaard, zolang deze alleen in steriele omstandigheden wordt geopend.

Deel vervolgens 100 zaden in een 1,5-milliliter microcentrifugebuisje. Dit kan handmatig worden gedaan, of met behulp van een op maat gemaakte zaadrobot. Voeg nu in een laminaire stroomkap 500 microliter van de 50% bleekoplossing toe aan de zaden.

Breng vervolgens de buisjes over naar een rotator en incubeer de zaden in de bleek met lichte agitatie gedurende 10 minuten. Na 10 minuten zuigt u de bleekoplossing uit de buisjes en verwijdert u zoveel mogelijk. Voeg vervolgens 500 microliter steriele gedestilleerd water toe en draai de buisjes om om te mengen.

Laat de zaden bezinken, zuig vervolgens het water af en vervang het door een andere aliquot om de zaden opnieuw te wassen. Voer in totaal zes van dergelijke wasbeurten uit met gesteriliseerde gedestilleerd water. Zodra de zaden grondig met water zijn gewassen, schors ze in een milliliter water voordat ze worden geplaatst.

Voordat u begint met het sterilisatieproces, berekent u de volumes bleekmiddel en zoutzuur die nodig zijn om chloorgas te produceren. Gebruik de verstrekte vergelijking om het aanbevolen 6% chloorgas te verkrijgen. Zorg ervoor dat u precies het volume HCl berekent dat nodig is om een ​​succesvolle sterilisatie te garanderen en om spatten te voorkomen.

Zorg ervoor dat u handschoenen en een laboratoriumjas draagt ​​tijdens dit protocol en verwissel de handschoenen wanneer ze nat zijn van zuur of bleekmiddel. Breng onder een afzuiging de zaadbuisjes over in een rek met open deksels. Plaats vervolgens het rek in een plastic container waarin de sterilisatie kan plaatsvinden en bereid paraffinefoliestroken voor om het deksel op de container te verzegelen.

Laad nu de kolf met 100 milliliter bleekmiddel en plaats vervolgens een 250-milliliter kolf erin. Het gebruik van een overmaat aan bleekmiddel is een veiligheidsfunctie en de kolf moet minstens twee keer het totale volume van de oplossing die het bevat zijn. Behandel bleekmiddel en zuren altijd apart.

Voeg vervolgens drie milliliter zoutzuur toe aan de kolf en sluit vervolgens onmiddellijk de container en verzegel deze met parafilm. Bewaak de container gedurende één uur om ervoor te zorgen dat het gas zich tijdens de sterilisatie ophoopt. Chloorgas moet of zichtbaar zijn als een zwakke gele waas in de container of de oplossing kan worden gecontroleerd op verkleuren naar geel.

Controleer periodiek de afdichting op de container. Als het deksel loskomt of de paraffineafdichting begint los te raken, sluit u het deksel stevig weer af met een extra laag paraffinefolie. Na de eenuurs sterilisatie opent u een hoek van de container om het gas gedurende drie uur te laten ontluchten.

Na drie uur ontluchten, sluit u alle buisjes en bewaart u de gesteriliseerde zaden in droge omstandigheden totdat ze worden geplaatst. Neutraliseer nu de reactie door langzaam 1,5 gram natriumbicarbonaatpoeder toe te voegen terwijl u roert met een glazen roede om de vaste stoffen op te lossen. Blijf natriumbicarbonaat toevoegen totdat de kooldioxidegasbellen niet meer worden gevormd.

Meet vervolgens de pH van de oplossing en voeg, indien nodig, extra natriumbicarbonaat toe totdat de pH neutraal is. Mits de oplossing niet stinkt, kan deze worden weggegooid. Wacht anders tot alle geuren zijn verdwenen.

Voeg 500 microliter gesterileerd gedestilleerd water toe aan elke buis met gas-gesteriliseerde zaden. Giet vervolgens de zaden op een MS-plaat en verdeel ze gelijkmatig met behulp van een steriele inoculatielus voor eenmalig gebruik of een steriele pipettip. Na drie dagen zaadstratificatie bij vier graden Celsius, verplaatst u de platen naar 23 graden Celsius met 16 uur dagelijkse lichtblootstelling.

Houd de deksels bovenop zodat de wortels in het medium groeien. Na acht dagen groei, scoort u het aandeel zaden dat is ontkiemd. Ontkieming wordt geteld wanneer de wortel uit de zaadhuid is uitgesproken en de twee zaadlobben zichtbaar zijn.

Tel ook het aantal zaden dat door schimmels is aangetast om de effectiviteit van de sterilisatieomstandigheden te bepalen. Er werden vier verschillende concentraties bleekmiddel bij vijf verschillende blootstellingstijden getest op Columbia wild-type zaden. Hoge bleekconcentraties hadden een nadelige invloed op de kieming met te veel blootstelling.

Echter, hoge kiemingspercentages werden waargenomen bij 40 en 50% bleek bij alle blootstellingstijden. Zaden gesteriliseerd met hoge bleekconcentraties hadden een hoge sterfte en vertoonden vaak groeifouten, maar waren meestal volledig schimmelvrij. Sterilisatie door 50% bleek gedurende 10 minuten bleek het optimale evenwicht tussen schimmelremming en gezonde kieming te hebben.

Om de chloorgassterilisatieomstandigheden te optimaliseren, werden drie verschillende concentraties chloorgas gebruikt om Columbia wild-type zaden te steriliseren over twee verschillende tijdsperioden. Er was een significante interactie tussen tijd en gasconcentratie. Na één uur was er geen effect op de kieming, terwijl de hoogste gasconcentratie na drie uur nadelig was.

Dus werd een sterilisatieperiode van één uur gekozen. Schimmelgroei werd effectief