Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Het algemene doel van deze eenvoudige fluorescentie-gebaseerde reportertest is om te screenen op cellulaire componenten die nodig zijn voor de juiste transport van ricin toxine A of RTA-keten in het gistachtige modelorganisme. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over het intercellulaire transport van het ribosoom bij het activeren van een B-toxine. In ons geval, de cytotoxische subeenheid van de platte ricintoxine van het plasmamembraan naar het cytosoom.

Het grootste voordeel van deze test is de mogelijkheid om het effect van een individueel gistgen op RTA-transport snel en goedkoop te analyseren. Begin dit protocol met celtransformatie zoals beschreven in de tekstprotocol. Inoculeer vijf milliliter LB-kanamycine-medium met cellen die RTA-expressieplasmide of de lege vector bevatten.

Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 220 RPM. Voeg vijf milliliter precultuur toe aan een liter LB-kanamycine-medium. Vervolgens incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 220 RPM tot de cellen een optische dichtheid hebben bereikt van 0,8 tot 1,0 bij 600 nanometer.

Vervolgens wordt de kweektemperatuur verlaagd tot 28 graden Celsius. Induceer de RTA-expressie van de E.Coli door IPTG toe te voegen tot een eindconcentratie van één millimolar. Na 3,5 uur bij 28 graden Celsius en 220 RPM, oogst de cellen door centrifugatie bij 10.000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Was vervolgens de pellet met vijf milliliter bindingsbuffer en pellet bij 10.000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na één keer wassen, resuspendeer de pellet in vijf milliliter bindingsbuffer. Soniceer de cellen op ijs met vijf cycli van een 15 seconden puls en een 30 seconden pauze.

Na centrifugatie van de cel licate bij 21.000 g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten, filter de supernatant met behulp van een steriele spuitfilterset. Gebruik een geautomatiseerd zuiveringssysteem, uitgerust met een vijf milliliter nikkel-gebaseerde affiniteitskolom om de HIS-gelabelde RTA-fractie uit het steriele gefilterde E.Coli-supernatant te zuiveren. Gebruik in het algemeen een illusiesnelheid van één milliliter per minuut en koel het hele zuiveringssysteem om inefficiënte toxinebinding en verlies van toxineactiviteit te voorkomen.

Breef de affiniteitskolom uit met 20 milliliter bindingsbuffer om de opslagbuffer te verwijderen. Breng vervolgens het steriele, gefilterde supernatant aan op de affiniteitskolom met behulp van een spuit. Was de kolom met 25 tot 35 milliliter bindingsbuffer om de niet-gebonden eiwitten uit de kolom te verwijderen.

Voer de wasstap uit totdat de UV-absorbenten bij 280 nanometer dicht bij de initiële UV-waarde ligt. Eluteer vervolgens de gebonden RTA-fractie met 20 tot 35 milliliter elutiebuffer en bewaar de monster op ijs. Het is belangrijk om de RTA-fractie te starten kort na het UV, 280-waarde toeneemt en stop met het RTA-fractiemonstern wanneer deze weer op de oorspronkelijke basislijn komt.

Om de eluted RTA-fractie te ontzouten, vervang de affiniteitskolom van het zuiveringssysteem met de ontziltingskolom en breng de kolom in evenwicht met 20 milliliter 0,8 molair sorbitol. Breng de eluted RTA-fractie aan op de kolom via een spuit. Was de kolom met 100 milliliter 0,8 molair sorbitol en verdun de ontzilte RTA-fractie in een 15 milliliter buis zodra de UV-absorptie begint te stijgen.

Om zoutverontreiniging te voorkomen, stop met het monsternemen van de fractie direct wanneer de geleidbaarheid toeneemt. Bewaar de Eluded RTA-fractie bij vier graden Celsius. Na het transformeren van de gist zoals beschreven in het tekstprotocol, kies drie verschillende gistklonen van elke plaat.

Inoculeer de klonen in 100 milliliter lucine dropout raffinose medium bij 220 RPM en 30 graden Celsius tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 1,0 tot 2,0. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius bij 10.000 g. Na het wassen van de cellen tweemaal met vijf milliliter steriele water, resuspendeer de cellen in 50 milliliter spheroplasting buffer.

Incubeer de 50 milliliter cultuur bij 100 RPM en 30 graden Celsius gedurende 90 minuten. Na centrifugatie bij 400 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, was de cellen tweemaal met vijf milliliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium. Breng vervolgens de cellen in suspensie in vijf milliliter van hetzelfde medium om de cellen direct te gebruiken voor de GFP reporter test metingen.

Zaai de gistcelspheroplasten uit in 96-well platen. Voeg aan elke put 70 microliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium toe, dat de negatieve controle bevat, de lege vector of gezuiverde RTA in een eindconcentratie van vijf micromolar expressie. Voeg 70 microliter gestabiliseerd lucine drop out medium toe aan elk van de resterende putten om hun totale volume op 270 microliter te brengen.

Voor een positieve controle voor eiwitremming, voeg 70 microliter 0,8 molair sorbitol gestabiliseerde G418-oplossing toe, omdat G418 GFP-expressie in gist voorkomt. Voeg onmiddellijk 30 microliter gestabiliseerde galactose-oplossing toe om GFP-expressie te induceren. Bereid een extra negatieve controle voor door 30 microliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium toe te voegen in plaats van 30% galactose.

Nadat de steekproevoorbereiding is voltooid, plaats de 96-well plaat in een fluorescentiemeter en bereid deze voor op meting met behulp van de 475, 509 nanometer filterset die vereist is voor GFP-fluorescentiedetectie. Voer metingen uit bij 30 graden Celsius 120 RPM en een schuddiameter van één millimeter gedurende een tijdsvenster van 20 uur met meetintervallen van 10 minuten. Hier wordt een representatieve zuiveringsgrafiek van de affiniteitschromatografie van RTA en de lege vector controle weergegeven.

De blauwe piek in het zwarte vak vertegenwoordigt de gebonden RTA-fractie.