Name: Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een fluorescentie-gebaseerde reporter assay om cellulaire componenten voor ricine toxine A (RTA) transport in gist te identificeren. Deze methode analyseert snel en kosteneffectief het effect van individuele gistgenen op RTA-trafficking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Delen van deze studie waren vriendelijk, gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

Opmerking: Een overzicht van de algemene experimentele workflow is afgebeeld in Figuur 1.
Let op: RTA is zeer giftig voor de mens. Veiligheid lab toestemming S2 (biosafety level 2 equivalent) is nodig. Gelieve handschoenen te dragen tijdens het hele experiment.
1. heterologe uitdrukking van zijn-gelabeld RTA in Escherichia coli
<ol>
	<li>Transformeren van E. coli of cellen met waarden de expressie plasmide pET24-RTA(zijn) 6 de lege vector pET24a(+) met behulp van standaard electroporation protocollen9,10. Cellen met de lege plasmide dienen als een negatieve controle.</li>
	<li>Na selectie van positieve klonen op kanamycine-bevattende (100 µg/mL) LB platen, cellen met de RTA expressie plasmide of de lege vector in 5 mL LBkan medium (LB medium met 100 µg/mL kanamycine) beënten en incuberen bij 37 ° C en 220 rpm gedurende 24 uur.</li>
	<li>Aanvulling 1 L LBkan medium met 5 mL pre cultuur en Incubeer de cellen bij 37 ° C en 220 rpm tot cellen hebben bereikt een OD-600 voor 0.8-1.0 (ongeveer 3-4 h). Daarna Verlaag cultuur temperatuur tot 28 ° C en bereiden een 1 M van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-stockoplossing in H2O.</li>
	<li>Induceren RTA uitdrukking van de E. coli door toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM.</li>
	<li>Na 3,5 uur bij 28 ° C en 220 rpm, oogst cellen door centrifugeren op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, het wassen van de pellet tweemaal met 5 mL bindende buffer (500 mM NaCl, imidazool 10 mM en 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, en resuspendeer pellet in 5 mL bindende buffer. Opmerking: Protocol kan in dit stadium worden onderbroken en cellen kunnen worden achtergelaten bij 80 ° C voor meerdere dagen.</li>
</ol>
2. de zuivering van zijn-gelabeld RTA via de chromatografie van de affiniteit
<ol>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten cellen op ijs met behulp van de onderstaande voorschriften: 15 s pulse (20 micron), 30 s pauze. Herhaal deze stap vijf keer.</li>
	<li>Centrifugeer cel lysate op 21.000 x g- en 4 ° C gedurende 15 minuten en filtreer bovendrijvende vloeistof met behulp van een steriele injectiespuit filtersysteem (0,2 µm poriëngrootte). Opmerking: Cel pellets van monsters met succes sonicated transparante randen weergeven.</li>
	<li>Gebruik een geautomatiseerde zuiveringsinstallatie uitgerust met een 5 mL Ni2 +-op basis van affiniteit kolom om te zuiveren van de Fractie zijn-gelabeld RTA uit de steriele gefiltreerd E. coli bezinken. In het algemeen, gebruik een elutie snelheid van 1 mL/min en koel de hele zuiveringsinstallatie om te voorkomen dat niet-efficiënte toxin binding en verlies van toxine activiteit. Opmerking: Parameters voor efficiënte RTA zuivering worden weergegeven in tabel 1. Zie ook Becker et al.. voor verdere informatie9.<ol>
		<li>Kort, equilibreer de kolom affiniteit met 20 mL bindende buffer te verwijderen van de opslag-buffer. Steriele-gefilterd op de kolom van de affiniteit met behulp van een injectiespuit supernatant van toepassing.</li>
		<li>Was de kolom met 25-35 mL bindende buffer te verwijderen de niet-afhankelijke eiwitten uit de kolom. De wassen stap uitvoeren tot UV-absorptie bij 280 nm is dicht bij de eerste UV-waarde.</li>
		<li>Elueer afhankelijke RTA breuk in 20-35 mL elutie buffer (500 mM imidazool, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) en houden van het monster op ijs (figuur 2A en figuur 2B). Opmerking: De elutie van de RTA breuk wordt gekenmerkt door een toename van de UV-absorptie. Let op: uitsluitend het verzamelen van deze fractie om te voorkomen dat besmetting met niet-specifieke afhankelijke eiwitten.</li>
		<li>20 µL van geëlueerd monsters kunt uitvoeren Coomassie Blue kleuring11 of Western blot analyse12,13 (optioneel). Primaire anti-zijn antilichamen (1:1, 000) en secundaire anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) gebruiken om te detecteren RTA en controleer of monster zuiverheid (Figuur 3).</li>
		<li>Desalt geëlueerd RTA breuk op een 5 mL demineralisatie kolom en equilibreer monster in 0,8 M sorbitol.<ol>
			<li>De column van de affiniteit van de zuiveringsinstallatie van de demineralisatie kolom vervangen en equilibreer eerst de kolom met 20 mL van 0,8 M sorbitol.</li>
			<li>De eluted RTA breuk van toepassing op de kolom via een spuit. Was de kolom met 100 mL van 0,8 M sorbitol en elueer de desalted RTA breuk in een tube van 15 mL zodra de UV-absorptie begint te verhogen (figuur 2C).</li>
			<li>Winkel de eluted RTA breuk bij 4 ° C. Opmerking: Direct vastloopt RTA breuk bemonstering huidgeleiding verhoogt om zout verontreiniging te voorkomen. Parameters voor de demineralisatie procedure worden weergegeven in tabel 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Concentreer je geëlueerd RTA breuk bij 10.000 x g en 4 ° C gedurende 30-180 minuten met behulp van een 10 kDa cut-off spin kolom een eindvolume van 1-2 mL en opslaan van monster bij 4 ° C voor 3-4 weken. Let op: Niet het monster invriezen sinds de bevriezing leidt tot een volledig verlies van RTA activiteit.</li>
	<li>Bepalen eiwitconcentratie met behulp van een conventionele eiwit bepaling kit. Eiwitconcentratie moet in het bereik van 1 tot 1,5 mg/mL. Opmerking: RTA neigt te precipiteren als de eiwitconcentratie te hoog is (&#62; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. gist transformatie en verwijdering van de celwand
<ol>
	<li>Tover wild-type of geselecteerde gist schrapping mutanten met de GFP verslaggever plasmide pRS315-K28SP- GFP6 met behulp van standaard lithium acetaat transformatie methoden14. Incubeer de cellen op leucine drop-out (d/o) glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% gist stikstof Base (YNB) en 0.087% d/o mix zonder leucine) bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen voor positieve kloon selectie.</li>
	<li>Kies 3 verschillende gist klonen van elke plaat en enten van de klonen in 100 mL van leucine d/o raffinose medium (2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o Meng zonder leucine) bij 220 rpm en 30 ° C tot OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 cellen/mL). Nota: De celgroei van de verschillende giststammen verwijdering is verschillend. Monitor OD600 via een spectrofotometer.</li>
	<li>OD600 om waarden te berekenen, Verdun monsters OD600 = 0,1-0,3 (1:5 tot 1:10 verdunnen) en OD600 in een spectrofotometer meten. Als referentie, H2O aangevuld met het overeenkomstige bedrag van leucine d/o raffionose medium te gebruiken.</li></ol>Ten slotte resuspendeer OD600 = 125 in 5 mL steriel water (5 x 108 cellen/mL).
	<li>Centrifugeer bij 25 ° C gedurende 5 minuten bij 10.000 x g cellen, cellen tweemaal met 5 mL steriel water wassen en resuspendeer de cellen in 50 mL spheroplasting buffer (0,8 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 2 mM dithiothreitol (DTT) en 200 µg/mL lytische enzym).</li>
	<li>Incubeer de 50 mL cultuur op 100 rpm en 30 ° C gedurende 90 min. Optioneel: spheroplast formatie elke 15 min controleren door fase contrast microscopie. Onder de Microscoop, moeten cellen hebben een donker, doorschijnend grijze kleur. Bright (refractile) cellen zijn onvoldoende verteerd, overwegende dat spoken (bleke grijze cellen met weinig of geen, interne structuur) overdreven zijn verteerd.</li>
	<li>Controleer spheroplast voorbereiding werkzaamheid voor elk monster.
	<ol>
		<li>Na afwerking stap 3.5, meng 4 µL van de spheroplasted 50 mL-cultuur met 496 µL spheroplasting buffer (ongeveer 2 × 106 spheroplasts) en gedurende 10 minuten bij 400 x g centrifugeren.</li>
		<li>Resuspendeer pellet in 10 mL H2O gedestilleerd, vortex monster voor 30 s en plaat uit 10 µL van het monster op leucine d/o glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o mix zonder leucine).</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 3 dagen bij 30 ° C. Tel het totale aantal volwassen cel kolonies op de plaat. Voor de evaluatie van de gegevens, alleen monsters te gebruiken met een rendement hoger dan 98% (total celaantal kolonie &#60; 40 kolonies/plaat).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifuge cellen uit stap 3.5 bij 400 x g- en 4 ° C voor 10 min en wassen cellen tweemaal met 5 mL gestabiliseerd leucine d/o raffinose medium (0,8 M sorbitol, 2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% drop-out mix zonder leucine). Resuspendeer de cellen in 5 mL gestabiliseerde leucine d/o raffinose medium (1 x 108 cellen/mL) en rechtstreeks cellen gebruiken voor de GFP verslaggever assay metingen (afdeling 4).</li>

4. GFP verslaggever Assay meting in 96-wells-platen
<ol>
	<li>Zaad uit de gist cel spheroplasts verkregen in stap 3.7 in 96-wells-platen (200 µL per putje).</li>
	<li>Toevoegen van 70 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose opslagmedium met negatieve controle (eluaat van een Ni2 +-affiniteit gezuiverde cel lysate uit IPTG-geïnduceerde E. coli cellen uiten de lege vector) of RTA gezuiverd in een RTA eindconcentratie van 5 µM ( overeenkomend met 160 g/L RTA) in elk putje.</li>
	<li>Onmiddellijk vergroten met 30 µL gestabiliseerd galactose oplossing (30% galactose, 0,8 M sorbitol) om te induceren GFP expressie en vervolgens start de meting. Opmerking: Voer ten minste 3 technische replicatieonderzoeken per experiment en 3 biologische repliceert per giststam.</li>
	<li>Na afwerking bereiding van de monsters (stappen 4.1-4.3), leg de 96-wells-plaat in een fluorescentie-lezer en begin van de meting. Gebruik de 475/509 nm filter nodig voor de detectie van GFP fluorescentie instellen. Uitvoeren van metingen bij 30 ° C, 120 omw / m, en met een schudden diameter van 1 mm over een venster van de tijd van 20 h (meting van de intervallen van 10 min). Opmerking: De GFP filter set is normaal beschikbaar in alle systemen van de lezer. Temperatuur, in het venster tijd, meten van intervallen en RTA concentratie kan worden aangepast voor eigen behoeften. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4.</li>
	<li>Optioneel: Gebruik aanvullende interne beheersingsmaatregelen in de meting voor kwaliteitscontrole. Bereid een negatieve controle door het toevoegen van 30 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose medium in plaats van 30% galactose (geen GFP-inductie). Bovendien, 70 µL van 0,8 M sorbitol gestabiliseerd G418 oplossing (300 µg/mL) toe te voegen. De eiwit vertaling remmer G418 fungeert als positieve controle voor de remming van het eiwit zoals het GFP expressie in gist voorkomt.</li>
	<li>Relatieve GFP fluorescentie in procent voor het tijdstip van 20u volgens de volgende vergelijking berekenen (Zie figuur 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> waar NC is de negatieve controle
	<ol>
		<li>Anderzijds bepalen de relatieve GFP fluorescentie voor elke meting (in dit geval 10 min, zie ook stap 4.4) met behulp van de bovenstaande vergelijking. Zoals blijkt uit figuur 4B, een grafiek maken door het bevlekken van het GFP fluorescentie intensiteiten (y-as) na verloop van tijd (x-as).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
<li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119(2012).</li>
<li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+%28KDEL%29+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum%3A+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li>
<li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li>
<li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li>
<li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricin%3A+structure%2C+mode+of+action%2C+and+some+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li>
<li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24674070">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications.+1979%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li>
<li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymocin%2C+a+composite+chitinase+and+tRNase+killer+toxin+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast.</a> Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij het uitvoeren van het bovengenoemde protocol, raden we de volgende suggesties om een geslaagde uitkomst van het experiment.
Voor heterologe eiwit expressie is het belangrijk niet meer bedragen dan de concentratie van de IPTG van 1 mM. IPTG concentraties &#62; 1 mM remmen promotor-geïnduceerde RTA expressie en leiden tot lagere opbrengsten van de toxine. Bovendien moeten cellen niet gekweekt worden bij temperaturen hoger dan 28 ° C om te voorkomen dat integratie lichaam vorming, inefficiënt...

Patiënten met infecties door toxine producerende bacteriën vertegenwoordigen een ernstige medische en financiële lasten voor elke sociale systeem van de gezondheidszorg, in het bijzonder aangezien efficiënte therapeutische behandelingen nog grotendeels ontbreekt zijn. Ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën, de mechanismen van de complexe intoxicatie van medisch relevante A / B toxines zoals cholera-toxine, Shiga-toxine of ricine moeten volledig worden begrepen op moleculair niveau gebaseerd op de roman krachtige tests die moeten worden uitgevoerd.
In de afgelopen jaren geprobeerd verschillende studies voor het analyseren van A / B-toxine vervoer in gist en zoogdiercellen met behulp van tijdrovende en kostenintensieve methoden zoals radioactieve toxine labeling1,2 , alsmede siRNA gebaseerde screening 3benaderingen. In sommige gevallen toxine mensenhandel gevisualiseerde geweest in vivo door fluorescentie microscopie na chemische en/of genetische koppeling van individuele toxine subeenheden met fluorophores, quantumdots of fluorescerende eiwitten4,5. Helaas leiden dergelijke wijzigingen vaak tot inactieve en/of gewijzigde natuurlijke eigenschappen van de toxines. Een andere elegante manier om niet indirect een breed scala aan wetenschappelijke vragen te beantwoorden is het gebruik van verslaggever systemen op basis van enzymen zoals lacZ, luciferase of fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP of Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit () dsRed)).
In dit manuscript, is een eenvoudig protocol beschreven waarin het cellulaire componenten die nodig zijn voor het intracellulair transport van extracellularly toegepaste RTA in S. cerevisiae. Daarmee fungeert een fluorescentie-reporter plasmide met een N-terminal ER-import signaal gevolgd door GFP als een eiwit biosynthese sensor, die niet indirect RTA-gemedieerde eiwit vertaling remming door GFP fluorescentie emissie na in vivo meet vertaling6. In geval dat RTA endocytose en/of intracellulaire handel negatief (of positief) ondergaat in een bepaalde gist schrapping mutant in vergelijking met wild-type, kan dit worden gedetecteerd via een toename (of afname) in GFP fluorescentie emissie6.
Tot nu toe waren alle methoden analyseren van RTA vervoer in gistcellen beperkt tot de ER-te-cytosol retro-translocatie proces van RTA. In zulk een kunstmatige systeem, RTA met een signaal van de import ER zich van een afleidbare promotor, resulterend in een suïcidale fenotype1,7. Hoewel de cel B-subunit van ricine bindend eveneens in de experimentele opstelling wordt beschreven in dit manuscript ontbreekt en, zo niet geheel representatief is de natuurlijke situatie van ricine holotoxin intoxicatie8, vervoer van toxine van het plasma membraan door het Golgi-apparaat naar de ER kan nauw met deze nieuwe test worden geïmiteerd. Interessant is dat blijkt de voorlopige resultaten van de pilot-studie dat de mensenhandel trajecten gebruikt door RTA opvallende gelijkenissen met de route van de dronkenschap van ricine holotoxin onthullen.
Kortom, kan de beschreven methode worden gebruikt om te bepalen van de specifieke rol van geselecteerde cellulaire eiwitten in RTA endocytose en handel in gist. Bovendien, deze experimentele opstelling kan gemakkelijk worden aangepast aan andere ribosoom inactiveren toxines geproduceerd en uitgescheiden door verschillende gist en bacteriesoorten zoals zymocin of Shiga-toxine.

<table><tbody><tr><td>Bacterie- en giststammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742-deletiekmutanten</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>hele collectie</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Plasmiden gebruikt in dit protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>lytisch enzym voor celwandverwijdering</td></tr><tr><td>LB-bouillonmedium</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g agar werd toegevoegd voor plaatproductie</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gist-dropoutmix-supplementen zonder leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-raffinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE ruler vooraf gekleurd</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>eiwitreek gebruikt voor Western-analyse</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materiaal voor RTA-zuivering, ontzouting en leesmetingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>oud model, andere modellen beschikbaar</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>oud model, niet meer verkrijgbaar</td></tr><tr><td>&Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Product is stopgezet en vervangen</td></tr><tr><td>HisTRAP HP-kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP-ontziltingskolom</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart steriele filter</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0,2 &micro;m poriegrootte</td></tr><tr><td>BCA-eiwitassaykit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm-assaykit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96-wellsplaten</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen (optioneel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>primair antilichaam; 1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-muis-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>secundair antilichaam, 1:10.000 verdunning</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (rta) handel in gist

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Bacteriële en plant A / B toxines exploit de natuurlijke mensenhandel trajecten in eukaryotische cellen te bereiken hun intracellulaire doelgroep in het cytosol en uiteindelijk doden. Dergelijke A / B-toxine in het algemeen bestaan uit een enzymatisch actieve Asubunit (b.v., ricine toxine een (RTA)) en een of meer cellen bindende Bsubunit(s), die verantwoordelijk zijn voor de toxine binden aan specifieke cel oppervlakte receptoren. Onze huidige kennis van hoe A / B toxines in staat efficiënt bedwelmende cellen geholpen wetenschappers om te begrijpen fundamentele cellulaire mechanismen, zoals endocytose en intracellulaire eiwitten sorteren in hogere eukaryotische cellen zijn. Vanuit een medisch oogpunt is het ook belangrijk om te identificeren van de aanvoerroutes van grote toxine adequate behandeling om oplossingen te vinden voor patiënten of uiteindelijk therapeutische toxine gebaseerde om toepassingen te ontwikkelen voor kankertherapie.
Sinds het genoom-brede analyse van A / B-toxine handel in zoogdiercellen is complex, tijdrovend en duur, verschillende studies over A / B-toxine vervoer zijn uitgevoerd in de modelorganisme gist Saccharomyces cerevisiae. Ondanks het feit dat minder complex, fundamenteel cellulaire processen in gist en hogere eukaryotische cellen kunnen zijn vergelijkbaar en heel vaak de resultaten die zijn verkregen in gist worden overgedragen aan de zoogdieren situatie.
Hier beschrijven we een snelle en makkelijk te gebruiken verslaggever assay voor het analyseren van de intracellulaire mensenhandel van RTA gist. Een essentieel voordeel van de nieuwe bepaling is de mogelijkheid te onderzoeken van niet alleen RTA retro-translocatie van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het cytosol, maar eerder endocytose en retrograde toxine transport uit het plasma-membraan in de ER. De bepaling maakt gebruik van een verslaggever plasmide waarmee indirecte meting van RTA toxiciteit door fluorescentie emissie van de groen fluorescente proteïne (GFP) na in vivo vertaling. Sinds de opening van de proteïne biosynthese RTA efficiënt door 28 rRNA depurination voorkomt, kan deze test de identificatie van de ontvangende cel eiwitten die betrokken zijn bij intracellulair RTA transport via de detectie van veranderingen in fluorescentie emissie.

De algemene workflow voor het protocol beschreven in dit manuscript wordt geïllustreerd in Figuur 1, ruwweg de samenvatting van de enkele stappen voor succesvol RTA zuivering en de daaropvolgende GFP verslaggever assay experiment. Een meer gedetailleerde beschrijving van elke individuele stap kan worden gevonden in het protocol. Figuur 2 illustreert het verwachte resultaat van een succesvolle RTA zuivering door chromatografie van...

In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

Het algemene doel van deze eenvoudige fluorescentie-gebaseerde reportertest is om te screenen op cellulaire componenten die nodig zijn voor de juiste transport van ricin toxine A of RTA-keten in het gistachtige modelorganisme. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over het intercellulaire transport van het ribosoom bij het activeren van een B-toxine. In ons geval, de cytotoxische subeenheid van de platte ricintoxine van het plasmamembraan naar het cytosoom.Het grootste voordeel van deze test is de mogelijkheid om het effect van een individueel gistgen op RTA-transport snel en goedkoop te analyseren. Begin dit protocol met celtransformatie zoals beschreven in de tekstprotocol. Inoculeer vijf milliliter LB-kanamycine-medium met cellen die RTA-expressieplasmide of de lege vector bevatten.Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 220 RPM. Voeg vijf milliliter precultuur toe aan een liter LB-kanamycine-medium. Vervolgens incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 220 RPM tot de cellen een optische dichtheid hebben bereikt van 0,8 tot 1,0 bij 600 nanometer.Vervolgens wordt de kweektemperatuur verlaagd tot 28 graden Celsius. Induceer de RTA-expressie van de E.Coli door IPTG toe te voegen tot een eindconcentratie van één millimolar. Na 3,5 uur bij 28 graden Celsius en 220 RPM, oogst de cellen door centrifugatie bij 10.000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Was vervolgens de pellet met vijf milliliter bindingsbuffer en pellet bij 10.000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na één keer wassen, resuspendeer de pellet in vijf milliliter bindingsbuffer. Soniceer de cellen op ijs met vijf cycli van een 15 seconden puls en een 30 seconden pauze.Na centrifugatie van de cel licate bij 21.000 g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten, filter de supernatant met behulp van een steriele spuitfilterset. Gebruik een geautomatiseerd zuiveringssysteem, uitgerust met een vijf milliliter nikkel-gebaseerde affiniteitskolom om de HIS-gelabelde RTA-fractie uit het steriele gefilterde E.Coli-supernatant te zuiveren. Gebruik in het algemeen een illusiesnelheid van één milliliter per minuut en koel het hele zuiveringssysteem om inefficiënte toxinebinding en verlies van toxineactiviteit te voorkomen.Breef de affiniteitskolom uit met 20 milliliter bindingsbuffer om de opslagbuffer te verwijderen. Breng vervolgens het steriele, gefilterde supernatant aan op de affiniteitskolom met behulp van een spuit. Was de kolom met 25 tot 35 milliliter bindingsbuffer om de niet-gebonden eiwitten uit de kolom te verwijderen.Voer de wasstap uit totdat de UV-absorbenten bij 280 nanometer dicht bij de initiële UV-waarde ligt. Eluteer vervolgens de gebonden RTA-fractie met 20 tot 35 milliliter elutiebuffer en bewaar de monster op ijs. Het is belangrijk om de RTA-fractie te starten kort na het UV, 280-waarde toeneemt en stop met het RTA-fractiemonstern wanneer deze weer op de oorspronkelijke basislijn komt.Om de eluted RTA-fractie te ontzouten, vervang de affiniteitskolom van het zuiveringssysteem met de ontziltingskolom en breng de kolom in evenwicht met 20 milliliter 0,8 molair sorbitol. Breng de eluted RTA-fractie aan op de kolom via een spuit. Was de kolom met 100 milliliter 0,8 molair sorbitol en verdun de ontzilte RTA-fractie in een 15 milliliter buis zodra de UV-absorptie begint te stijgen.Om zoutverontreiniging te voorkomen, stop met het monsternemen van de fractie direct wanneer de geleidbaarheid toeneemt. Bewaar de Eluded RTA-fractie bij vier graden Celsius. Na het transformeren van de gist zoals beschreven in het tekstprotocol, kies drie verschillende gistklonen van elke plaat.Inoculeer de klonen in 100 milliliter lucine dropout raffinose medium bij 220 RPM en 30 graden Celsius tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 1,0 tot 2,0. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius bij 10.000 g. Na het wassen van de cellen tweemaal met vijf milliliter steriele water, resuspendeer de cellen in 50 milliliter spheroplasting buffer.Incubeer de 50 milliliter cultuur bij 100 RPM en 30 graden Celsius gedurende 90 minuten. Na centrifugatie bij 400 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, was de cellen tweemaal met vijf milliliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium. Breng vervolgens de cellen in suspensie in vijf milliliter van hetzelfde medium om de cellen direct te gebruiken voor de GFP reporter test metingen.Zaai de gistcelspheroplasten uit in 96-well platen. Voeg aan elke put 70 microliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium toe, dat de negatieve controle bevat, de lege vector of gezuiverde RTA in een eindconcentratie van vijf micromolar expressie. Voeg 70 microliter gestabiliseerd lucine drop out medium toe aan elk van de resterende putten om hun totale volume op 270 microliter te brengen.Voor een positieve controle voor eiwitremming, voeg 70 microliter 0,8 molair sorbitol gestabiliseerde G418-oplossing toe, omdat G418 GFP-expressie in gist voorkomt. Voeg onmiddellijk 30 microliter gestabiliseerde galactose-oplossing toe om GFP-expressie te induceren. Bereid een extra negatieve controle voor door 30 microliter gestabiliseerd lucine drop out raffinose medium toe te voegen in plaats van 30% galactose.Nadat de steekproevoorbereiding is voltooid, plaats de 96-well plaat in een fluorescentiemeter en bereid deze voor op meting met behulp van de 475, 509 nanometer filterset die vereist is voor GFP-fluorescentiedetectie. Voer metingen uit bij 30 graden Celsius 120 RPM en een schuddiameter van één millimeter gedurende een tijdsvenster van 20 uur met meetintervallen van 10 minuten. Hier wordt een representatieve zuiveringsgrafiek van de affiniteitschromatografie van RTA en de lege vector controle weergegeven.De blauwe piek in het zwarte vak vertegenwoordigt de gebonden RTA-fractie.

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Source: Becker, B., et al. A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the inducible expression of His-tagged ricin toxin A chain (RTA) in Escherichia coli. It outlines the steps involved in the selective culturing of bacteria transformed with a recombinant expression plasmid, induction of His-tagged RTA expression, and preparation of the bacteria for further...

Inducible Expression of Histidine-Tagged Ricin Toxin A Chain in E. coli

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor de snelle bouw van kunstmatige transcriptiefactoren (ATF) met verwante GFP verslaggevers en kwantificering van de ATFs mogelijkheid om GFP-expressie te stimuleren via flowcytometrie.

Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Leer een fluorescentie-gebaseerde reporter assay om cellulaire componenten voor ricine toxine A (RTA) transport in gist te identificeren. Deze methode analyseert snel en kosteneffectief het effect van individuele gistgenen op RTA-trafficking.

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Meer video's verkennen