Name: Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer hoe je communicatie tussen primaire borstkankercellen en monocyten analyseert in een driedimensionaal ECME-systeem. Deze methode onthult interacties die tumoragressie en inflammatie bevorderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Project nr. 233061 naar Ezequiel M. Fuentes-Pananá en door Fondo de Apoyo a la Investigación, ziekenhuis Infantil de México Federico Gómez (projectnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez nb is een promovendus from Programa de Doctorado nl Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM) en ontvangen fellowship 231663 van CONACYT. E-S NA, ook erkennen dat de financiële steun van het Mexicaanse Instituut voor sociale zekerheid (IMSS).

<ol><li>Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+understanding+tumor+hierarchy+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity.</a> Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+microenvironment+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of tumor microenvironment in tumorigenesis.</a> J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Sica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in tumour progression.</a> Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Debnath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+apoptosis+in+creating+and+maintaining+luminal+space+within+normal+and+oncogene-expressing+mammary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini.</a> Cell. 111 (1), 29-40 (2002).</li>
<li>Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11533657">ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini.</a> Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).</li>
<li>Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+proteolysis%3A+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).</li>
<li>Sameni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAME+models+for+4D+live-cell+imaging+of+tumor%3A+microenvironment+interactions+that+impact+malignant+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protease+activity+in+living+cells%3A+from+two+dimensions+to+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20(2008).</li>
<li>Chimal-Ramirez, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP1%2C+MMP9%2C+and+COX2+expressions+in+promonocytes+are+induced+by+breast+cancer+cells+and+correlate+with+collagen+degradation%2C+transformation-like+morphological+changes+in+MCF-10A+acini%2C+and+tumor+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness.</a> Biomed Res Int. 2013, 279505(2013).</li>
<li>Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta%2C+IL-8%2C+and+Matrix+Metalloproteinases-1%2C+-2%2C+and+-10+Are+Enriched+upon+Monocyte-Breast+Cancer+Cell+Cocultivation+in+a+Matrigel-Based+Three-Dimensional+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System.</a> Front Immunol. 8, 205(2017).</li>
<li>Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+promotes+stemness+and+invasiveness+of+colon+cancer+cells+through+Zeb1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation.</a> Mol Cancer. 11, 87(2012).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18(2008).</li>
<li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Zymography of metalloproteinases.</a> Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15(2004).</li>
<li>Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+CagA+and+IL-1beta+Promote+the+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+a+Nontransformed+Epithelial+Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model.</a> Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163(2016).</li>
<li>Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+and+fibroblast+growth+factor+receptor+1+cooperate+to+induce+cyclooxygenase-2+during+early+mammary+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis.</a> Breast Cancer Res. 11 (2), 21(2009).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+%28EGF%29+and+interleukin+%28IL%29-1beta+synergistically+promote+ERK1%2F2-mediated+invasive+breast+ductal+cancer+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion.</a> Mol Cancer. 11, 79(2012).</li>
<li>Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+B-cell+and+viral+ITAM+signaling%3A+context+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything.</a> Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Hydrogels+-+Versatile+Matrices+for+3D+Cell+Culture+in+Cancer+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine.</a> Front Oncol. 5, 92(2015).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Pompaiah, M., Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Organoids%3A+An+Emerging+Model+System+to+Study+Helicobacter+pylori+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict.

Epitheliale cellen groeien in een 3D ruimtelijke bevleesdheid en hun interactie met de ECM-eiwitten is cruciaal voor de weefsel homeostase. Veel kanker studies zijn gebaseerd op cellen gekweekt in monolayers (2D) en hoewel ze kritische geweest tot begrip van vele aspecten van tumor ontstaan en progressie, monolayers doen niet recapituleren de kenmerken die de ECM oplegt aan cellen, voor aanleg: beperken van de proliferatie, overleving van de cel adhesie-afhankelijke apicale-basolaterale polariteit, ECM remodelleren, celd...

Biologie van de tumor is veel ingewikkelder dan eerder gedacht. Montage van bewijsmateriaal blijkt dat tumorcellen meer dan een louter bulk van ongecontroleerde delende cellen zijn; verschillende neoplastische cellen lijken eerder, voor het uitvoeren van verschillende functies hoge organisatie en hiërarchie binnen de tumor-1weer te geven. Tumorcellen zijn ook in intieme communicatie met niet-getransformeerd cellen: macrofagen, lymfocyten, adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, onder andere cellen zijn alle ondergedompeld in de steiger eiwitten en polysacchariden die de ECM vormen. Talrijke directe en indirecte interacties zijn gevestigd tussen getransformeerd en niet-getransformeerd cellen en met de ECM, die een krachtige invloed op de ziekte resultaat2,3oefent. In het specifieke geval van BrC is het met name belangrijk voor het ontleden van de mededeling van BrC cellen met TAMs, gezien het feit dat TAMs bleken te spelen een cruciale rol in de evolutie van de tumor, waardoor het risico van metastase en ziekte herhaling4 ,5.
Voor het analyseren van de intra-tumoral interacties en hun mogelijke uitkomsten, nieuwe 3D in vitro benaderingen zijn ontwikkeld op basis van het gebruik van ECM-extracten die een veel complexer communicatie bieden, dichter bij de realiteit van de biologie van de tumor, in vergelijking met de conventionele enkelgelaagde celculturen waarin de cellen groeien gekoppeld aan kunststof. Petersen en Bissell6 geleverd het eerste model van nonmalignant en kwaadaardige borstklier epitheliale cellen gekweekt op een laminin-rijke kelder membraan en waren de eerste om te beschrijven van de 3D organotypic-structuren die nonmalignant mens discrimineren borst epitheliale cellen uit hun kwaadaardige tegenhangers. Een decennium later, het model ontwikkeld door Debnath, Muthuswamy, en Brugge7,8,9 verstrekt een waardevol instrument voor het verhelderen van de biologische trajecten in gevaar komen tijdens de kwaadaardige omzetting van klierweefsel acini, dergelijke Als grote acini formatie als gevolg van de ongecontroleerde verspreiding, verplaatsing van strakke junction eiwitten als bewijs van verminderde cel polarisatie, en verlies van acini lumen als gevolg van cel weerstand tegen anoikis, een soort geprogrammeerde celdood optreedt die in Anchorage-afhankelijke cellen wanneer ze van de omliggende ECM losmaken. De modellen Sameni, Jedeszko en Sloane hebben gericht op imaging proteolytic activiteit door cellen, die nauw is aan invasiviteit, een ander essentieel karaktertrek van tumor maligniteit10,11,12 verwant. Deze modellen afhankelijk proteïne matrices gemengd met verschillende fluorescentie-uitgeblust eiwit substraten (DQ-gelatine, DQ-collageen I, en DQ-collageen IV), in welke TL signalen zijn indicatief voor de Proteolytische afbraak van collageen. 3D-modellen worden ook gebruikt voor het bestuderen van de stamcel eigenschappen van zowel niet-getransformeerd en tumorcellen, in welke cel aggregaten, ook wel genoemd spheroïden, kunnen worden gekweekt in suspensie of in ECM-achtige eiwitten voor mechanismen voor celdifferentiatie, asymmetrische ondervragen celdeling, naleving van de cel-naar-cel en cel motiliteit13,14. Invasie testen laten testen van de intrinsieke agressiviteit van de tumor en de identificatie van de moleculen die als chemoattractants tijdens de invasieve proces15 dienen. Algemene, 3D-modellen vertegenwoordigen een betaalbare diversificatie van in vitro cultuur van de cel die normaal en oncogene weefsel morfogenese nauwer te weerspiegelen.
We hebben een 3D co celcultuur op grond van de bovengenoemde modellen7,10,11, ontworpen met behulp van beide menselijke commerciële BrC cellijnen van bekende agressieve potentieel (luminal en triple-negatieve soorten) en primaire cellen transplanteren van BrC patiënten. We eerst een model ontwikkeld waar niet-agressieve (MCF-7) of agressieve (MDA-MB-231) BrC cellen waren mede gekweekte met U937 monocyten in een uittreksel van de extracellulaire matrix (ECME)-gebaseerde 3D systeem waardoor directe cel interacties. Deze co culturen werden gebruikt om te bepalen hoe de communicatie tussen deze twee cel lineages beïnvloed de transcriptie van een aantal genen aan agressief gedrag van kanker gerelateerde. Een aanzienlijke stijging van cyclooxygenase-2 (COX-2) afschrift werd waargenomen dat samenviel met een verhoogde productie van een van haar producten, prostaglandine E2 (PGE2), de vaststelling dat de rol van ontsteking in de progressie van kanker benadrukte. Verhoogde transcriptie van MMP werd ook waargenomen dat gecorreleerd met meer collageen proteolyse wanneer agressieve MDA-MB-231 cellen samen met U937 monocyten in DQ-collageen IV-bevattende culturen werden gekweekt. Van de nota, heeft onze mede culturen geen ondersteuning voor de veronderstelling dat cel-cel interactie mechanismen nodig zijn om aantasting van het collageen. Het eerder gesuggereerd dat de communicatie tussen de twee cel lineages was gemedieerd door secreted moleculen. Bovendien bevatte het supernatant geoogst van deze co cultuur assays oplosbare factoren die klieren acini gevormd door niet-getransformeerd MCF-10A cellen13ongeorganiseerd. Bleek dat agressieve en primaire BrC cellen uitgescheiden verhoogde niveaus van monocyt Chemotactische moleculen MCP-1, GM-CSF, en RANTES. Dus, we geschetst een 3D cultuur waarin cellen werden gescheiden in cel cultuur inzetstukken ter voorkoming van cel-cel interacties. Deze culturen werden gebruikt om aan te pakken van de indirecte communicatie tussen BrC cellen en monocyten. Voor deze tests, niet-agressieve en agressieve commerciële BrC cellijnen en primaire BrC cellen en drie verschillende soorten menselijke monocyten: commerciële U937 en THP-1 cellen en primaire monocyten (PMs) geïsoleerd uit perifeer bloed van gezonde donoren (alle monocyten werden gebruikt in een niet-geactiveerde staat) werden gebruikt. Verhoogde concentraties van inflammatoire cytokines IL-1β en IL-8 werden waargenomen worden verrijkt in co-cultuur. Ook bleek dat MMP-1 en MMP-2 MMP-10 werden eveneens verhoogd in het BrC cellen-monocyt co culturen, en daarmee versterken eerdere bevindingen14. In dit manuscript, wordt een punt-voor-punt workflow van primaire BrC cellen isolatie en testen in 3D culturen gepresenteerd samen met representatieve resultaten. Dit werk vormt een goed voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om specifieke aspecten van de biologie van de tumor te ondervragen.

<table><tbody><tr><td>U937</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>CRL-1593.2</td><td>Monocytic cell line/histiocytic lymphoma&nbsp;</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>TIB-202</td><td>Monocytic cell line/acute monocytic leukemia&nbsp;</td></tr><tr><td>MCF-10A</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>CRL-10317</td><td>Non-transformed breast cell line</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-22</td><td>Breast Cancer Cell line</td></tr><tr><td>T47D</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-133</td><td>Breast Cancer Cell line</td></tr><tr><td>HS578T</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-126</td><td>Breast Cancer Cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-26</td><td>Breast Cancer Cell line</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11964-092</td><td>4.5 g/L glucose</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>100 U/mL penicillin, 100 &micro;g/mL streptomycin, and 0.25 &micro;g/mL Fungizone</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA 1X</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X (Phosphate Buffered Saline</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15 (1.00mg)</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I1882-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H088-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin Vibrio cholerae</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Corning Inc</td><td>356237</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20&deg;C until use at 4&deg;C</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>MCP-1</td><td>PeproTech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>PeproTech</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>IL-8</td><td>PeproTech</td><td>200-08</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Crystal-violet</td><td>Hycel M&eacute;xico</td><td>541</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports (inserts)</td><td>Corning Inc</td><td>3422</td><td>6.5 mm diameter, 8 &micro;m pore size/24-well plates&nbsp;</td></tr><tr><td>Transwell permeable supports (inserts)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>140620</td><td>6.5 mm diameter, 0.4 &micro;m pore size/24-well plates&nbsp;</td></tr><tr><td>Monocyte Isolation Kit II Human&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-153</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay</td><td>EMD Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td></td></tr><tr><td>Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-072</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)</td><td>Nalge Nunc International</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell 35mm petri&nbsp; dishes</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire matrix extraheren (ecme)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Ingebed in de extracellulaire matrix (ECM), communiceren normale en neoplastisch epitheliale cellen intiem met hematopoietische en niet-hematopoietische cellen, dus sterk beïnvloeden van normale weefsel homeostase en ziekte resultaat. Bij borstkanker spelen tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) een cruciale rol in de progressie van de ziekte en metastase herhaling; inzicht in de mechanismen van de monocyte chemoattraction de tumor communicatie en hun interacties met tumorcellen is daarom belangrijk ter bestrijding van de ziekte. Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een driedimensionale (3D) mede cultuur systeem van menselijke (BrC) borstkankercellen en menselijke monocyten. BrC cellen geproduceerd gereglementeerde op-activering basale hoge, normale T-cel uitgedrukt en uitgescheiden (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (G-CSF), terwijl in co-cultuur met monocyten, pro-inflammatoire cytokines Interleukine (IL) -1 beta (IL-1β) en IL-8 werden verrijkt met matrix metalloproteinasen (MMP) -1, MMP-2 en MMP-10. Deze tumor stroma communicatie bevorderd weerstand tegen anoikis MCF-10A 3D acini-achtige structuren, chemoattraction van monocyten en invasie van agressieve BrC cellen. De hier gepresenteerde protocollen bieden een betaalbaar alternatief voor het bestuderen van de mededeling van de intra-tumor en zijn een voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om het ondervragen van de specifieke kenmerken van de tumor biologie aan de tumor gerelateerde agressie.

Morfologische analyse van BrC cellen in 3D culturen:
De morfologie van primaire BrC cellen groeien in 3D culturen op lage en hoge dichtheden werd bestudeerd over 5 dagen. Gedurende de eerste 48 uur, cellen voldoen aan de ECME en onderhouden van een lage dichtheid. Op dit punt van tijd, kan het duidelijk worden gewaardeerd dat cellen een langwerpige vorm van de spindel-achtige, sommige met twee of meer lang cytop...

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Het algemene doel van dit protocol is om de directe en indirecte communicatie tussen primaire borstkankercellen en monocyten in een driedimensionaal co-cultuursysteem te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de inflammatoire micro-omgeving van het borstkankerveld, zoals hoe immuuncellen worden herverdeeld en geactiveerd, hoe deze cellen helpen om de inflammatoire micro-omgeving van de tumor te onderhouden en hoe deze micro-omgeving de invasie van tumorcellen bevordert. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een betaalbare alternatief biedt om intratumorcommunicatie te bestuderen en de potentieel van in vitro, 3-D celsystemen illustreert voor het onderzoeken van specifieke kenmerken van tumorbiologie.Met name die met betrekking tot tumoragressie. Om te beginnen, kweek twee keer 10 tot de zesde U937 en THP1 monocyten in 10 milliliter RPMI1640-medium, aangevuld met 10 procent FBS en een procent antibiologisch antimycotisch. Kweek ook verse PM's in aangevuld DMEMF12-medium.Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide. Plateer vier keer 10 tot de vijfde monocyten in één milliliter per putje van hun corresponderende medium. Plaats een insert in elke put en voeg 900 microliter van de vier keer 10 tot de vijfde BrC-celsuspensie toe in het corresponderende medium.Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende vijf dagen en herstel de supernatanten. Haal de cellen op door middel van trypsinisatie als er een volgende analyse wordt uitgevoerd. Voeg controles van individuele cellencultures met het respectieve medium toe.Om BrC-cellen en monocyten te labelen met commercieel verkrijgbare cumerine en rodamine voor de celcultuur, bereid een monolaag van twee keer 10 tot de zesde BrC-cellen van belang voor en vervang het standaardmedium met voldoende, voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 30 minuten. Zuig vervolgens de kleurstoffoplossing af en gebruik voldoende een XPBS om de cellen voorzichtig te spoelen.Zuig de PBS af en voeg het standaardmedium toe. Om de cellen te trypsiniseren, voeg twee milliliter 05 procent trypsine en 0,48 millimolair EDTA toe aan de flacon en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot 10 minuten. Voeg 200 microliter FBS toe om de trypsinisatie te stoppen en zeven milliliter van het corresponderende medium zonder supplementen.Suspensie de cellen opnieuw door te pipetteren, breng vervolgens 10 microliter van de cellen over naar een Neubauerkamer en tel ze. Pel de cellen vervolgens bij 430 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten, gooi het supernatant weg en gebruik drie milliliter voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof om de cellen opnieuw op te schorsen. Incubeer de celsuspensie bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 30 minuten.Nadat de cellen opnieuw zijn gepellet, gooi de kleurstoffoplossing weg en gebruik vijf tot zeven milliliter van een XPBS om de cellen voorzichtig opnieuw op te schorsen. Pel de cellen vervolgens nog eens en gooi de PBS weg, schors de cellen opnieuw op in vijf tot zeven milliliter standaardmedium. Tel 10 microliter van de celsuspensie.Stel een co-cultuur op door voldoende ECME op de bodem van de putjes te verspreiden om een gelijkmatige laag in elk putje van een vier putjes kamerslide systeem te vormen. Plate 20 microliter van een enkele celsuspensie die vijf keer 10 tot de vijfde gelabelde BrC-cellen per putje bevat. Voeg na 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius een suspensie van 2,5 keer 10 tot de vijfde gelabelde monocyten toe in 80 microliter van assaymedium aangevuld met 60 procent ECME.Laat de ECME 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius stollen. Voeg nu een milliliter van een een-op-een mengsel van het BrC-cel en monocytencultuurmedium toe. Incubeer de co-culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 24 uur, 48 uur of vijf dagen om veranderingen op verschillende tijdstippen te volgen.Om de ECM-eiwitten af te breken en de cellen uit de culturen te herstellen, zuig en gooi het medium weg, voeg vervolgens 0,5 milliliter van een XPBS met 0,1 procent trypsine en 0,25 procent EDTA toe aan de cultuur. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Na de incubatie, voeg 0,5 milliliter van een XPBS met 10 procent FBS toe om de trypsine te neutraliseren en schors de cellen opnieuw op door krachtig te pipetteren om een enkele celsuspensie te verkrijgen.Nadat de cellen zijn gepellet, gooi het supernatant weg en schors de cellen opnieuw op in vijf milliliter van een XPBS met 10 procent FBS. Herhaal deze stap eenmaal. Onderwerp de celsuspensie aan fax met het juiste instrument.Zorg ervoor dat de uiteindelijke populaties minstens 95 procent zuiver zijn. Verspreid in elk putje van een acht putjes kamerslide systeem een 40 microliter basis van ECME en laat deze 30 minuten bij 37 graden Celsius stollen. Zaai 800 MCF10 A-cellen per putje in 400 microliter van aangevuld DMEM F12 cultuurmedium volgens het tekstprotocol.Voeg vervolgens 400 microliter van geconditioneerd medium of aangevuld DMEM F12 cultuurmedium met 20 nanogram per milliliter van humane recombinante IL1 beta toe. Plaats de kamerslide in een glazen petrischaal die een 35 milliliter petrischaal bevat gevuld met twee milliliter PBS. De MCF 10A-cellen moeten zeer langzaam in elk putje worden gezaaid om schade aan de basis van ECME te voorkomen en om te voorkomen dat cellen zich nestelen en een monoly vormen.Gebruik een optisch microscoop om de vorming van glandulaire acini om de 24 uur gedurende 14 dagen op te nemen. Voeg na 14 da

analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We hebben 3D coculture modellen voor live-cell imaging in real-time van de interacties tussen borsttumor cellen en andere cellen in hun micro-omgeving die van invloed zijn progressie naar een invasieve fenotype. Deze modellen kunnen dienen als preklinisch schermen voor drugs te paracriene-geïnduceerde proteolytische, chemokine / cytokine en kinase pathways die betrokken zijn bij invasiviteit richten.

MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Deze video beschrijft de 3D-co-cultuur van borstkankercellen met monocyten om hun interactie te bestuderen in een op extracellulair matrixextract (ECME) gebaseerde omgeving. Deze methode helpt bij het bestuderen van specifieke kenmerken zoals collageendegradatie, rekrutering van immuuncellen en celinvasie.

3D-cocultuur met directe interactie: kankercellen co-cultiveren met monocyten om hun interactie te bestuderen

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

We demonstreren een methode om 3D-surrogaten voor borstkanker te genereren, die kunnen worden gekweekt met behulp van een perfusiebioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen af te geven. Na de groei worden surrogaten gefixeerd en verwerkt tot paraffine voor evaluatie van parameters van belang. De evaluatie van één van deze parameters, celdichtheid, wordt uitgelegd.

Voorbereiding en analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Het doel van de hier gepresenteerde methode is om te laten zien hoe micro Environment micro arrays (MEMA) kunnen worden gefabriceerd en gebruikt voor het ondervragen van de impact van duizenden eenvoudige combinatorische micro-omgevingen op het fenotype van gekweekte cellen.

Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Leer hoe je communicatie tussen primaire borstkankercellen en monocyten analyseert in een driedimensionaal ECME-systeem. Deze methode onthult interacties die tumoragressie en inflammatie bevorderen.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem (Video) | JoVE Journal

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Meer video's verkennen