Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Het algemene doel van dit protocol is om de directe en indirecte communicatie tussen primaire borstkankercellen en monocyten in een driedimensionaal co-cultuursysteem te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de inflammatoire micro-omgeving van het borstkankerveld, zoals hoe immuuncellen worden herverdeeld en geactiveerd, hoe deze cellen helpen om de inflammatoire micro-omgeving van de tumor te onderhouden en hoe deze micro-omgeving de invasie van tumorcellen bevordert. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een betaalbare alternatief biedt om intratumorcommunicatie te bestuderen en de potentieel van in vitro, 3-D celsystemen illustreert voor het onderzoeken van specifieke kenmerken van tumorbiologie.

Met name die met betrekking tot tumoragressie. Om te beginnen, kweek twee keer 10 tot de zesde U937 en THP1 monocyten in 10 milliliter RPMI1640-medium, aangevuld met 10 procent FBS en een procent antibiologisch antimycotisch. Kweek ook verse PM's in aangevuld DMEMF12-medium.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide. Plateer vier keer 10 tot de vijfde monocyten in één milliliter per putje van hun corresponderende medium. Plaats een insert in elke put en voeg 900 microliter van de vier keer 10 tot de vijfde BrC-celsuspensie toe in het corresponderende medium.

Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende vijf dagen en herstel de supernatanten. Haal de cellen op door middel van trypsinisatie als er een volgende analyse wordt uitgevoerd. Voeg controles van individuele cellencultures met het respectieve medium toe.

Om BrC-cellen en monocyten te labelen met commercieel verkrijgbare cumerine en rodamine voor de celcultuur, bereid een monolaag van twee keer 10 tot de zesde BrC-cellen van belang voor en vervang het standaardmedium met voldoende, voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 30 minuten. Zuig vervolgens de kleurstoffoplossing af en gebruik voldoende een XPBS om de cellen voorzichtig te spoelen.

Zuig de PBS af en voeg het standaardmedium toe. Om de cellen te trypsiniseren, voeg twee milliliter 05 procent trypsine en 0,48 millimolair EDTA toe aan de flacon en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot 10 minuten. Voeg 200 microliter FBS toe om de trypsinisatie te stoppen en zeven milliliter van het corresponderende medium zonder supplementen.

Suspensie de cellen opnieuw door te pipetteren, breng vervolgens 10 microliter van de cellen over naar een Neubauerkamer en tel ze. Pel de cellen vervolgens bij 430 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten, gooi het supernatant weg en gebruik drie milliliter voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof om de cellen opnieuw op te schorsen. Incubeer de celsuspensie bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 30 minuten.

Nadat de cellen opnieuw zijn gepellet, gooi de kleurstoffoplossing weg en gebruik vijf tot zeven milliliter van een XPBS om de cellen voorzichtig opnieuw op te schorsen. Pel de cellen vervolgens nog eens en gooi de PBS weg, schors de cellen opnieuw op in vijf tot zeven milliliter standaardmedium. Tel 10 microliter van de celsuspensie.

Stel een co-cultuur op door voldoende ECME op de bodem van de putjes te verspreiden om een gelijkmatige laag in elk putje van een vier putjes kamerslide systeem te vormen. Plate 20 microliter van een enkele celsuspensie die vijf keer 10 tot de vijfde gelabelde BrC-cellen per putje bevat. Voeg na 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius een suspensie van 2,5 keer 10 tot de vijfde gelabelde monocyten toe in 80 microliter van assaymedium aangevuld met 60 procent ECME.

Laat de ECME 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius stollen. Voeg nu een milliliter van een een-op-een mengsel van het BrC-cel en monocytencultuurmedium toe. Incubeer de co-culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving van vijf procent koolstofdioxide gedurende 24 uur, 48 uur of vijf dagen om veranderingen op verschillende tijdstippen te volgen.

Om de ECM-eiwitten af te breken en de cellen uit de culturen te herstellen, zuig en gooi het medium weg, voeg vervolgens 0,5 milliliter van een XPBS met 0,1 procent trypsine en 0,25 procent EDTA toe aan de cultuur. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Na de incubatie, voeg 0,5 milliliter van een XPBS met 10 procent FBS toe om de trypsine te neutraliseren en schors de cellen opnieuw op door krachtig te pipetteren om een enkele celsuspensie te verkrijgen.

Nadat de cellen zijn gepellet, gooi het supernatant weg en schors de cellen opnieuw op in vijf milliliter van een XPBS met 10 procent FBS. Herhaal deze stap eenmaal. Onderwerp de celsuspensie aan fax met het juiste instrument.

Zorg ervoor dat de uiteindelijke populaties minstens 95 procent zuiver zijn. Verspreid in elk putje van een acht putjes kamerslide systeem een 40 microliter basis van ECME en laat deze 30 minuten bij 37 graden Celsius stollen. Zaai 800 MCF10 A-cellen per putje in 400 microliter van aangevuld DMEM F12 cultuurmedium volgens het tekstprotocol.

Voeg vervolgens 400 microliter van geconditioneerd medium of aangevuld DMEM F12 cultuurmedium met 20 nanogram per milliliter van humane recombinante IL1 beta toe. Plaats de kamerslide in een glazen petrischaal die een 35 milliliter petrischaal bevat gevuld met twee milliliter PBS. De MCF 10A-cellen moeten zeer langzaam in elk putje worden gezaaid om schade aan de basis van ECME te voorkomen en om te voorkomen dat cellen zich nestelen en een monoly vormen.

Gebruik een optisch microscoop om de vorming van glandulaire acini om de 24 uur gedurende 14 dagen op te nemen. Voeg na 14 da