Name: Differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van Cholesterol deeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Ontdek hoe lipideverlagende geneesmiddelen de morfologie van cholesteroldeeltjes beïnvloeden met de plaque array-methode. Deze techniek helpt onderzoekers bij het identificeren van biomarkers voor atherosclerose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een Plaxgen onderzoek subsidie aan SM (PLX-1008). Wij danken Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute voor het verzamelen van serummonsters van atherosclerose onderwerpen onder goedkeuring van de IRB.

1. voorbereiding van de TL-geëtiketteerden Cholesterol en lipide-verlagende geneesmiddelen Opmerking: aggregaten van de TL-geëtiketteerden cholesterol en statines werden voorbereid zoals beschreven in ons vorige artikel 21. Zie Tabel van materialen voor details van de reagentia, imaging stroom cytometer, chemie analyzers, en software van de analyse van gegevens in deze studie gebruikt.
<ol><li>Solubilize TL-geëtiketteerden gelyofiliseerd cholesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) poeder in 100% alcohol 1 mL.</li>
	<li>Het monster gedurende 3 minuten op 2,040 x g centrifugeren en gebruik het supernatant met oplosbare fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol aggregaten in de plaque matrix assay.</li>
	<li>Voor de bereiding van geneesmiddelen, individueel de poeders (2 mg) van simvastatine, Lovastatine Atorvastatine, ezetimibe en omega-3 vetzuur in 1 ml 100% alcohol solubilize.</li>
	<li>Na het centrifugeren gedurende 3 minuten op 2,040 x g, gebruiken het supernatant met drugs in de assay.</li>
	<li>Ook solubilize individueel de poeders (2 mg) Fluvastatine Rosuvastatine, niacine, en fibrate in 1 mL gedeïoniseerd water te maken van een stamoplossing van 2 mg/mL.</li>
	<li>Na het centrifugeren gedurende 3 minuten op 2,040 x g, gebruiken het supernatant met drugs in de plaque matrix assay.</li>
</ol> 2. Plaque Array Assay voor onderzoek In Vitro Cholesterol deeltjes vorming <ol><li>gebruik chemistry analyzer-1 (zie tabel van materialen) instellen op de plaque matrix assay voor cholesterol deeltjes vorming. Het uitvoeren van de bepaling in een ronde bodem, laag eiwitgehalte bindende 96-wells-plaat met behulp van de reagentia die in sectie 1 worden bereid. Het volume van de uiteindelijke reactie in elk putje op 200 µL handhaven en alle testen uitvoeren in drievoud.
	<ol><li>Eerste, belasting 194,5 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan elk putje.</li>
		<li>Elk Nou, toevoegen van 2,5 µL (5 µg) van elke drug lipide-verlagende oplossing en schud de plaat voor 30 s door het op de plaat te mengen gelijkmatig het geneesmiddel in oplossing chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie te plaatsen. Geen drug wordt toegevoegd aan de negatieve controlemonsters.</li>
		<li>Ten slotte 2 µL (2 µg) TL-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing toevoegen aan elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
		<li>De plaat op een lab-shaker voor 2 h vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.</li>
		<li>Na incubatie, verwerft u de beelden van deeltjes door imaging stroom cytometry.</li>
	</ol></li></ol> 3. Vastleggen van beelden van Cholesterol deeltjes met behulp van Imaging Stroom Cytometry <ol><li>Open de gegevenssjabloon voor de overname voor het laden van de juiste instrumentele instellingen. Klik op &#34; bestand &#34;, selecteer vervolgens &#34; Open sjabloon &#8230; &#34; en selecteer het sjabloonbestand.</li>
	<li>Klik op &#34; Flush, Lock en Load &#34; ter voorbereiding van het instrument voor monster laden.</li>
	<li>Wanneer de &#34; laden monster &#34; dialoog doos wordt geopend, klikt u op &#34; OK &#34; te laden 50 µL van de monsters uit elk goed voorbereid in sectie 2 in de beeldvorming stroom cytometer.</li>
	<li>Klik &#34; uitvoeren | Setup &#34; de deeltjes in het imaginggebied in real-time bekijken.</li>
	Klik op <li>wanneer de deeltjes in het imaginggebied in goede focus, &#34; uitvoeren | Verwerven &#34; te verwerven van de beelden van elk object gelijktijdig in zodanig hoge gegevensdoorvoer voor donkere velden (kant scatter/SSC), heldere (BF), groene fluorescentie en gele fluorescentie.</li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.5 te verwerven van 5.000-10.000 deeltjes van elk monster.</li>
	<li>Analyseren alle raw-afbeeldingsbestanden met behulp van de software van de analyse van de afbeelding voor het bepalen van object fluorescentie intensiteit en morfologische variaties.
	<ol><li>Klik op de &#34; Tools &#34; knop aan de bovenkant van de software van de analyse van de afbeelding en selecteer vervolgens &#34; gegevens batchbestanden &#34; uit de drop-down menu, die wordt geopend de &#34; partijen &#34; venster.</li>
		<li>In de &#34; partijen &#34; venster, klik op de &#34; Batch toevoegen &#34; knop, die wordt geopend de &#34; definiëren een Batch &#34; venster.</li>
		<li>In het &#34; definiëren een Batch &#34; venster, klik op de &#34; bestanden toevoegen &#34; knop en selecteer de raw-afbeeldingsbestanden, klikt u op de &#34; sjabloon &#34; knop en selecteert u de juiste gegevens analyse sjabloonbestand en vervolgens &#34; OK &#34; en &#34; dienen partijen &#34; om te beginnen van de verwerking en analyse van de raw-afbeeldingsbestanden.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plaque Array Assay gebaseerd evaluatie van lipide-verlagende Drugs Effect op de Cholesterol-deeltjes gezuiverd <ol><li>zoals beschreven in stap 2.1, voeren de cholesterol deeltjes vorming bepaling met behulp van gezuiverde VLDL, LDL en HDL lipoproteïnen/deeltjes. Uitvoeren van de bepaling van de matrix plaque in een 96-wells-plaat.
	<ol><li>Eerste, laden alle putjes met PBS; gebruiken van een 200 µL eindvolume voor elk putje.</li>
	</ol></li> <li>Voor de negatieve controle, 4 µg VLDL, LDL, toevoegen of HDL eiwitten/deeltjes individueel in elk goed zonder drugs en schud de plaat voor 30 s.
	<ol><li>Voor de behandeling van het lipide-verlagende drug effect, 4 µg VLDL, LDL, toevoegen of HDL eiwitten/deeltjes individueel aan elk goed en schud de plaat voor 30 s.</li>
		<li>Voor wells toegevoegd met 4 µg VLDL of LDL, HDL, voeg 2.5 µL (5 µg) ezetimibe, simvastatine, Lovastatine of niacine-oplossing toe en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen in chemistry analyzer-1.</li>
		<li>Ten slotte 2 µL (2 µg) cholesterol fluorescentie-geëtiketteerden statistische oplossing toevoegen aan alle putjes en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
	</ol></li> <li>De plaat gedurende 2 uur in een lab shaker vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.</li>
	<li>Verwerven van de monsters met behulp van imaging stroom cytometry na maatregelen 3.1-3.5.</li>
	<li>Analyseren van raw-afbeeldingsbestanden met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, zoals beschreven in stap 3.7.</li>
	<li>In de analyse template, gebruik van de volgende gating regeling voor de identificatie van cholesterol deeltjes subpopulaties.
	<ol><li>Op een perceel van aantal (x-as) van de pixels van de groene kanaal verzadigd en donkere veld kanaal aantal verzadigde pixels (y-as), objecten met een of meer verzadigde pixels in elk kanaal verwerpen.</li>
		<li>De objecten/deeltjes uitzetten zonder verzadigde pixels met behulp van groene kanaal intensiteit (x-as) en SSC intensiteit (y-as): objecten vallen in een van de drie gewesten (VLDL, LDL, HDL) op basis van hun groene kanaal en SSC intensiteiten. 
		Opmerking: Deze poorten waren gemaakt op basis van gegevens die zijn gegenereerd op basis van controle experimenten uitgevoerd met behulp van gezuiverde VLDL, LDL en HDL deeltjes/eiwitten zonder de drug.</li>
	</ol></li> <li>Om te bepalen van het effect van de drug lipide-verlagende voor elk monster, als volgt berekend: de totale lipoproteïne deeltjes concentraties, evenals het percentage van elke subpopulatie (VLDL, LDL, HDL) beschreven in stap 6.5.
	<ol><li>Berekenen het deeltje concentraties (deeltjes/mL) met behulp van de volgende vergelijking: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" /> Opmerking: The VLDL, LDL en HDL gating regio's in de fluorescentie dot-plot detecteren ~ 80% van hun respectieve subpopulaties, en de resterende ~ 20% van de deeltjes elkaar overlappen met andere gating gebieden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Meting van lipide concentraties in het serummonsters <ol><li>gebruiken voor het bepalen van de concentraties van LDL, HDL, cholesterol en triglyceriden door chemistry analyzer-2, serummonsters verkregen van leeftijd-matched normaal en dyslipidemia onderwerpen.</li>
	<li>Definiëren voor abnormale concentratie van LDL, HDL, cholesterol en triglyceriden gebaseerd op hun concentratie dan de bovenste en onderste referentiewaarden in serummonsters geïdentificeerd.</li>
	<li>Volg de normale referentie waarde aanbevelenDED door de fabrikant reagens: cholesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL) (4-100 mg/dL) LDL en triglyceriden (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identificeren serummonsters die een abnormale waarde hebben, als dan de lagere referentiewaarde of boven de hogere verwijzing voor cholesterol en triglyceriden waarde, en deze voor screening in de aanwezigheid en de afwezigheid van lipide-verlagende geneesmiddelen gebruiken.</li>
</ol> 6. Analyseren van het Effect van Drugs op Cholesterol deeltjes vorming in serummonsters <ol><li>Gebruik de chemie analyzer-1 de plaque matrix assay voor cholesterol deeltjes vorming in serummonsters instellen. Het uitvoeren van de bepaling in een ronde bodem, laag eiwitgehalte bindende 96-wells-plaat. Gebruik een laatste reactie volume van 200 µL per putje en alle testen uitvoeren in drievoud.</li>
	<li>De plaat door het laden van reagentia op een stapsgewijze manier bereiden.
	<ol><li>Bereiden de controleputjes.</li>
		<li>Load 193 µL van PBS aan elk putje.</li>
		<li>Toevoegen van 2,5% (v/v) patiënten serum (slechts één serummonster per putje) en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op de plaat van de reactie van chemicaliënverbruik analyzer.</li>
		<li>Toevoegen 2 µL (2 µg) van fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing in elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
	</ol></li> <li>Bereiden de putjes met drugs.
	<ol><li>Load 191 µL van PBS aan elk putje.</li>
		<li>Toevoegen van 2,5% (v/v) patiënten serum (slechts één serummonster per putje) en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
		<li>Toevoegen 2 µL ezetimibe, simvastatine en Lovastatine niacine oplossing (4 µg) aan alle putjes met uitzondering van de negatieve controle putten. Voeg slechts één drug per putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
		<li>Toevoegen 2 µL van fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing (2 µg) in elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.</li>
	</ol></li> <li>Drugs laden nadat alle putjes (controle en drug-behandeld) zijn geladen met hun respectieve serummonsters en fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol toevoegen aan het eind van deze stap.</li>
	<li>De plaat gedurende 2 uur in een lab shaker vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.</li>
	<li>Verwerven van de monsters door imaging stroom cytometer volgende instellingen beschreven in stap 3.1-3.6.</li>
	<li>Gebruik van de afbeelding analyseren van software voor batch-verwerking van alle afbeeldingsbestanden dezelfde sjabloon gebruiken zoals beschreven in stappen 3.7.
	<ol><li>De data-analyse uitvoeren door de tekening van poorten op het perceel, zoals beschreven in stappen 4.5 en 4.6.</li>
	</ol></li> <li>Om te bepalen van het lipide-verlagende drug effect/antwoord (laag, normaal en hoog) voor elk monster, het berekenen van de totale lipoproteïne deeltje concentratie, alsook het percentage van de totale deeltjes bestaande uit VLDL, LDL en HDL subpopulaties.</li>
	<li>Plot de VLDL, LDL en HDL populaties in een histogram van het object &#39; s helder veld image, breedte afgetrokken van lengte (lengte - breedte) en poort in bolvormige of lineaire regio's: objecten met (lengte - breedte) &#8804; 2 µm vallen de bolvormige regio voor de berekening van het percentage van bolvormige en lineaire gevormde deeltjes.</li>
	<li>Vergelijken het percentage van de bolvormige en lineaire gevormde LDL en HDL cholesterol deeltjes voor elk serummonster geïncubeerd met en zonder elk medicijn geïdentificeerd. Onder drievoudige voor elke serummonster verkregen waarden, accepteren het percentage bolvormige en lineaire vormige LDL en HDL-deeltjes die binnen het bereik van SD ±2 voor bepaling van het effect van de drug vallen.</li>
</ol>

<ol><li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-lowering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li>
<li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li>
<li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+cholesterol+and+coronaries%3A+from+plaques+to+genes+to+statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li>
<li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%2C+fibrates%2C+nicotinic+acid%2C+cholesterol+absorption+inhibitors%2C+anion-exchange+resins%2C+omega-3+fatty+acids%3A+which+drugs+for+which+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li>
<li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%3A+Mechanism+of+action+and+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li>
<li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+effects+of+statins+%28atorvastatin%2C+fluvastatin%2C+lovastatin%2C+pravastatin%2C+and+simvastatin%29+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li>
<li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+therapy+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Lipid%22%5BJournal%5D)">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li>
<li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+therapy%3A+mechanism+of+action+and+clinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Mana%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li>
<li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li>
<li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118(2016).</li>
<li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+fibrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li>
<li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit%5BTitle%5D)+AND+%22CardiovascDrugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li>
<li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Lipidome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li>
<li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li>
<li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li>
<li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li>
<li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+measures%2C+particle+heterogeneity%2C+proposed+nomenclature%2C+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Clinic+Chemi%22%5BJournal%5D)">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer%27s+disease+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li>
<li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+the+biochemical%2C+metabolic%2C+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li>
<li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li>
<li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li>
<li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol%22%5BJournal%5D)">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li>
<li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li>
<li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li>
<li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li>
<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Dr. Madasamy financiële steun ontvangen Plaxgen, Inc en een concurrerende financieel belang heeft. De andere auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.

In het algemeen, worden de distributie en de functionele eigenschappen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes in de bloedsomloop voornamelijk bepaald door metabole, genetische, epidemiologische, mobiele en plasma factoren22,23. In de huidige studie, onderzoek naar de effecten van het lipide-aanpassen drugs in de buffer is gebleken dat zeer lipofiele geneesmiddelen zoals ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en Atorvastatine een hogere niveau complexiteit op de morfologie van cholesterol deeltjes veroorzaakte vergeleken met het lagere niveau effect waargenomen met zeer hydrofiele Rosuvastatine en Fluvastatine drugs. Deze resultaten zijn in goede overeenstemming met onze eerdere studie met een beschrijving van een niet-enzymatische mechanisme gebaseerd effect van statines bij het moduleren van de LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in de buffer en serum monsters21. Dienovereenkomstig, de resultaten van de huidige studie bleek een niet-enzymatische werkingsmechanisme van ezetimibe, niacine, fibrate, en omega-3 vetzuur drugs die een directe rol bij het moduleren van de vorming van cholesterol deeltjes kunnen spelen. Het is mogelijk dat de interacties tussen geneesmiddelen en cholesterol aggregaten leidt tot de vergadering van groot formaat cholesterol deeltjes die groter zijn 2-60 µm2, bolvormige en lineaire strand morphologies exposeren.
Bovendien, suggereren de resultaten verkregen met behulp van gezuiverde lipoproteïne deeltjes interacties tussen cholesterol aggregaten en plasma factoren zoals VLDL, LDL en HDL eiwitten die de composities en morfologische eigenschappen van de cholesterol veranderen kunnen deeltjes. De drug behandelingsresultaten met gezuiverde lipoproteïne deeltjes aangegeven een hoger niveau drug effect op VLDL-deeltjes vorming in vergelijking met hun effect waargenomen op LDL cholesterol deeltjes vorming. De Lovastatine, simvastatine en ezetimibe drugs werden gebruikt als pro-drugs en hun doses bij de testen mag hoger zijn dan de fysiologische concentraties.
Interessant, vormige screening van serummonsters toonde variaties van drug effect op het veranderen van de profielen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming, met name hun effect op de formaties van lineaire LDL en HDL-deeltjes. Deze drugs geïnduceerde korting op lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in zowel dyslipidemia als leeftijd-matched normale serummonsters gevormd. De effecten van de drug waargenomen op het verminderen van lineaire gevormde deeltjes formatie was hoger in ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en niacine. De identificatie van cholesterol deeltjes met bolvormige en lineaire strand morphologies in de normale en dyslipidemia serummonsters suggereert dat deeltjes met soortgelijke morphologies in in vivo voorwaarden kunnen ontstaan. Eerdere studies gebleken dat de aanwezigheid van schijf en cholesterol van naald-achtige kristallen in de atherosclerotische plaques van ApoE- / - de mens en de LDLR- / - muizen modellen24,25,26 ,27,28.
De HDL-deeltjes circuleren in het bloed aanwezig zoals een heterogene mengsel en het niveau van kleine en grote HDL-deeltjes samen met functionele activiteit zijn belangrijke factoren om te oefenen hun cardio-beschermende effect via de reverse cholesteroltransport traject29,30. Recente studies hebben gewezen op het belang van de identificatie van de HDL cholesterol deeltje subfractions voor het ophelderen van hun rol in meerdere biologische functies zoals cholesterol efflux, anti-ontsteking, anti-trombotische en anti-oxidatieve31 . Daarnaast hebben een aantal studies het effect van therapie bij het vergroten van een laag om te matigen HDL-niveau in het plasma1,5,21lipide-verlagende gemeld. Dienovereenkomstig, de resultaten van deze studie geven nieuwe inzichten over morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes. Met name de detectie van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes in de serummonsters van dyslipidemia onderwerpen suggereert dat ze kunnen de betrouwbare biomerker voor zowel diagnose en evaluatie van de gevolgen van het wijzigen van het lipide medicijnen in patiënten. Er is echter verder onderzoek vereist grote klinische monsters met de cholesterol deeltjes met verschillende morphologies en hun deelname aan CVD beter te begrijpen.
In de plaque matrix assay voor de behandeling van het effect van de drug op de vergadering van cholesterol deeltjes, gebruikten we 2 µg fluorescentie met cholesterol aggregaten en 5 µgof elke drug omdat het label: (1) drugs concurrerend binden aan beide fluorescentie label cholesterol en endogene lipiden aanwezig in het serummonsters; (2) van elk monster verkregen we 5.000 tot 10.000 cholesterol deeltjes die zijn gemonteerd in grote maten en vormen variërend van ~ 2-60 µ2; (3) we waargenomen een grote verschillen van drug reactie onder serummonsters geïncubeerd met de drugs (doses 300 ng 5 µg) en ~ 1-5% van hen geïncubeerd met hoge doses toonde geen waarneembare veranderingen in het profiel van de vorming van de deeltjes van de cholesterol; en (4) de interactie tussen cholesterol aggregaten en lipide-verlagende geneesmiddelen wordt gemedieerd door een niet-enzymatische proces. Vandaar, de concentraties van de in de test gebruikte reagentia kunnen hoger zijn dan hun fysiologische niveau.
Kortom, we met succes is gebleken dat de voordelen van een in vitro imaging methode beschreven in deze studie voor het bepalen van het effect van een breed spectrum van lipide-verlagende geneesmiddelen op het moduleren van de morfologie en de samenstelling van de cholesterol deeltjes. De aanpak van visualiseren en kwantificeren van de morfologie van lipide deeltjes door gebruik te maken van een constellatie van afbeelding analyse algoritmen kan zowel de diagnose van atherosclerose en te evalueren van de resultaten van lipide-verlagende therapie bij patiënten helpen.

Talrijke klinische studies hebben aangetoond dat gunstige effecten van de lipide-verlagende geneesmiddelen bij het verminderen van plasma niveaus van low-density lipoproteins (LDL) cholesterol en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol, die Hiermee voorkomt u dat zowel primaire als secundaire gevallen van atherosclerose-nadelige cardiovasculaire gebeurtenissen1,2,3,4,5. Statines, een groep van HMG-CoA reductase enzym remmers, blokkeren endogene cholesterol synthese in de lever dat in beurt leiden tot lagere niveau van LDL-cholesterol in het bloed6,7 circulerende. Evenzo is de lipide verlagen effect van niacine gemedieerd door zijn directe en concurrerend remming van de hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, een belangrijke leverenzym triglyceride synthese8deelnemen. Betrekkelijk, vermindert ezetimibe plasma niveau van LDL door absorptie van exogene cholesterol door binding aan eiwitten van Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) gelegen in de epitheliale cellen van de dunne darm9te beperken. Fenofibraat, een andere lipide-verlagende drug, aanzienlijk vermindert de plasmaconcentraties van triglyceriden en vermindert ook matig LDL cholesterol via de peroxisome proliferator-geactiveerde receptoren traject10. Bovendien, omega-3 vetzuur is gemeld dat het anti-atherosclerotische effect vanwege haar vermogen om lagere niveaus van het plasma van LDL11.
De lipide-verlagende geneesmiddelen, naast hun primaire effect op het verlagen van LDL cholesterol, hebben een aantal gunstige pleiotropic effecten, met inbegrip van de verbetering van het HDL-niveau, verbetering van endothelial functies, vermindering van ontsteking en remming van de bloedplaatjes aggregaties12,13,14. Het onderliggende mechanisme van deze drugs in de verhoging van HDL cholesterol deeltjes en wijzigen hun structurele kenmerken zijn echter niet volledig begrepen. Aangezien deze geneesmiddelen zijn algemeen voorgeschreven voor de behandeling van atherosclerose-gerelateerde cardiovasculaire aandoeningen (CVDs), is het essentieel om hun mogelijke rol bij het bepalen van de morfologische kenmerken en verdeling van de deeltjes lipide verder te onderzoeken. De menselijk plasma lipidome bestaat uit ongeveer 600 verschillende lipiden en 22 verschillende moleculaire soorten cholesterols die aanwezig in verschillende maten, vormen, densiteiten en composities15,16,17 zijn . Analytische methoden zoals ultra-centrifugeren en NMR gradiënt gelelektroforese worden gebruikt voor het karakteriseren van de LDL en HDL-deeltjes en hun subfractions18,19. Toepassing van deze methoden is echter beperkt tot studies gericht op het vaststellen van het effect van drugs bij het moduleren van de morfologie en de assemblage van de lipide-deeltjes. De stroom cytometer gebaseerde plaque array is een functionele biochemische assay ontwikkeld voor detectie en visualisatie van serum verkregen lipide en amyloid plaque deeltjes20. De voordelen van in vitro imaging in deze studie beschreven methode inschakelen identificatie van lipide-modulerende effecten van de drug in het veranderen van de morfologie en de verdeling van de deeltjes van de cholesterol in buffer en serum monsters.

<table><tbody><tr><td>TopFluor fluorescent cholesterol</td><td>Avanti Polar lipids</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>simvastatine (prodrug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>lovastatine (prodrug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>rosuvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>atorvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>fluvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>ezetimibe (prodrug)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Niacine</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>fibrate</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>omega-3 vetzuren</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>bewaar 100 &micro;l aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>gezuiverde VLDL-eiwitten/deeltjes</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gezuiverde LDL-eiwitten/deeltjes</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gezuiverde HDL-eiwitten/deeltjes</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menselijk leeftijd-gematcht serum</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menselijk atherosclerotisch serum</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menselijk normaal serum</td><td>Stanford Blood center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDL-meetreagenspakket</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL-meetreagenspakket</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Totale cholesterolmeting</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells microtiterplates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triglyceriden meting</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Flow cytometer</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS beeldanalysesoftware</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemie-analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemie-analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Behandeling van dyslipidemia patiënten met lipide-verlagende medicijnen leidt tot een aanzienlijke vermindering van low-density lipoproteins (LDL) niveau en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol in plasma. Een mogelijke rol van deze drugs veranderen morfologie en verdeling van de deeltjes van cholesterol is echter slecht begrepen. Hier beschrijven we de evaluatie in vitro van lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes met de plaque matrix methode in combinatie met stroom cytometry imaging. Beeld analyses van de deeltjes die cholesterol aangegeven dat Lovastatine, simvastatine en ezetimibe Atorvastatine de vorming van zowel lineaire als bolvormige strand-vormige deeltjes veroorzaken, overwegende dat niacine, fibrates en Fluvastatine Rosuvastatine veroorzaken de vorming van alleen bolvormige-vormige deeltjes. Volgende, gezuiverde zeer low-density lipoprotein (VLDL) en LDL deeltjes geïncubeerd met deze drugs toonde veranderingen in de morfologie en afbeelding textuur van cholesterol deeltjes subpopulaties. Bovendien, screening van 50 serummonsters bleek de aanwezigheid van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes bij patiënten met dyslipidemia (gemiddelde van 18,3%) in vergelijking met de normale leeftijd-matched (gemiddelde van 11,1%) monsters. Wij merkte tevens aanzienlijke verschillen in lipide-verlagende drug effecten op het verminderen van lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in serummonsters gevormd. Deze bevindingen wijzen erop dat lipide-verlagende geneesmiddelen, naast de cel-gemedieerde hypolipidemic gevolgen ervan, rechtstreeks morfologie van cholesterol deeltjes door een niet-enzymatische mechanisme van actie moduleren kunnen. De resultaten van deze resultaten hebben potentieel te informeren van de diagnose van atherosclerose en voorspellen van optimale lipide-verlagende therapie.

Het doel van deze studie was om te evalueren in vitro lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes. Vergelijking van lipide-verlagende geneesmiddelen toonde variaties in hun effect bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes.

Differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van Cholesterol deeltjes

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Het algemene doel van deze studie is om het effect van cholesterolverlagende medicijnen op het moduleren van morfologische kenmerken van cholesteroldeeltjes te evalueren met behulp van een plaque-array-methode, en om potentiële biomarkers te identificeren voor de diagnose van atherosclerose en het bepalen van de effecten van geneesmiddelen. De rol van cholesterolverlagende medicijnen bij het moduleren van cholesteroldeeltjesvorming is slecht begrepen. Hier laten we zien dat cholesterolverlagende medicijnen een directe rol spelen bij het veranderen van profielen en morfologische kenmerken van cholesteroldeeltjesvorming.Het belangrijkste voordeel van de op plaque-array gebaseerde in vitro-beeldvormingsmethode boven andere deeltjesdetectiemethoden is dat het de visualisatie van cholesteroldeeltjes mogelijk maakt voor het evalueren van het effect van cholesterolverlagende medicijnen in serum. Jason Lundry, laboratoriumtechnicus voor Plaxgen, zal demonstreren hoe we de plaque-array-test opstelden met behulp van een chemische analyzator. Raymond Kong, senior wetenschapper bij Millipore Sigma, zal demonstreren hoe we de monsterverwerking doen met behulp van flowcytometrie met beeldvorming.Ten slotte zal David Liu, laboratoriumtechnicus voor Plaxgen, de gegevensanalyse voor cholesteroldeeltjesbeelden demonstreren. Gebruik een chemische analyzator-1 om de plaque-array-test op te zetten voor cholesteroldeeltjesvorming. Houd gedurende de test het uiteindelijke reactievolume in elk putje op 200 microliter, en voer alle tests in drievoudig uit.Laad eerst 194,5 microliter fosfaatgedempte zoutoplossing, of PDS, in elk putje van een ronde bodem, laag-eiwitbindende 96-welplate. Voeg aan elk putje twee punt vijf microliter van elke lipidverlagende medicijnoplossing toe, geen medicijn wordt toegevoegd aan de negatieve controlemonsters. Schud vervolgens de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen om het medicijn uniform in de oplossing te mengen.Voeg tenslotte twee microliter fluorescent gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje. Schud de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen zoals eerder. Incubeer vervolgens de plaat op een laboratoriumschudder gedurende twee uur ingesteld op 37 graden Celsius en 200 tpm.Na incubatie, verwerf de beelden van deeltjes door flowcytometrie met beeldvorming. Open de gegevensverwervingssjabloon om de juiste instrumentinstellingen te laden. Klik op Bestand en selecteer vervolgens Sjabloon laden en selecteer het sjabloonbestand.Klik op Laden om het instrument voorbereiden voor monsterladen. Wanneer het dialoogvenster Monster laden opent, klikt u op OK om 50 microliter van de monsters in de flowcytometer met beeldvorming te laden. Wacht tot de deeltjes in realtime in het beeldgebied zichtbaar zijn.Wanneer de deeltjes in het beeldgebied goed in focus zijn, klikt u op Verwerven om beelden van elk object tegelijkertijd op te halen op een hoge doorvoer voor donkerveld, helder veld, groen fluoresceren en geel fluoresceren. Aan het einde van de verwerving, klikt u op de knop Terug om het monster terug te brengen. Herhaal deze stappen om 5.000 tot 10.000 deeltjes van elk monster te verwerven.Analyseer alle ruwe beeldbestanden met behulp van de beeldanalysesoftware voor het bepalen van objectfluorescentie-intensiteit en morfologische variaties, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een ronde bodem, laag-eiwitbindende 96-welplate voor door reagensen stapsgewijs te laden, met behulp van een uiteindelijk reactievolume van 200 microliter per putje. Bereid eerst de controlepottetjes voor.Laad 193 microliter PBS in elk putje. Voeg 2,5% van het patiëntenserum toe, waarbij slechts één serummonster per putje wordt geladen. Schud vervolgens de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator te plaatsen.Voeg vervolgens twee microliter fluorescentie-gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje. Schud weer de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen. Om de putjes met geneesmiddelen voor te bereiden, laad 191 microliter PBS in elk putje.Voeg vervolgens 2,5% van elk patiëntenserum per putje toe en schud de plaat gedurende 30 seconden door deze op een chemische analyzator-1 reactieplaat te plaatsen. Voeg twee microliter ezetimibe, lovastatine, simvastatine of niacine-oplossing toe aan alle putjes behalve de negatieve controlepottetjes. Voeg slechts één geneesmiddel per putje toe.Schud de plaat gedurende 30 seconden zoals eerder. Voeg vervolgens twee microliter fluorescentie-gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje voordat u de plaat gedurende 30 seconden schudt. Incubeer vervolgens de plaat gedurende twee uur in een laboratoriumschudder, ingesteld op 37 graden Celsius en 200 tpm.Na incubatie, verwerf de monsters door flowcytometrie met beeldvorming volgens dezelfde instellingen als eerder. Gebruik de beeldanalysesoftware voor batchverwerking van alle beeldbestanden zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier getoonde zijn representatieve resultaten die de identificatie van globulaire en lineaire strengvormige cholesteroldeeltjes, geïnduceerd door statines, door een niet-enzymatische mechanisme laten zien.Bevestiging van twee verschillende morfologieën van cholesteroldeeltjesvorming, geïnduceerd door andere lipidverlagende medicijnen, wordt getoond. Inclusief ezetimibe, niacine, fibraat en omega-3-vetzuur. Hier getoonde zijn dotplots, waarbij de X-as een spectrum van cholesteroldeeltjes weergeeft die in het groen fluoresceren kanaal worden gedetecteerd.En de Y-as toont zijwaartse verstrooiing, gating toont regio's van zeer lage dichtheid lipoproteïne, lagedichtheids-lipoproteïne en hogedichtheids-lipoproteïne deeltjes, gedetecteerd in de fluorescentie dotplots. Deze resultaten laten zien hoe het lipidverlagende effect de profielen van gezuiverde VLDL en LDL-cholesteroldeeltjes verandert, in afwezigheid van geneesmiddel, ezemide, lovastatine, simvastatine en niacine. Hier getoond is

differential-effects-lipid-lowering-drugs-modulating-morphology

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De cholesterol test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen en de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren kwantificeren. De test bestaat uit het etiketteren van cellen met cholesterol, evenwicht van cholesterol tussen de intracellulaire zwembaden en het vrijgeven van cholesterol aan een extracellulaire acceptor.

Cholesterol efflux Assay

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Twee methoden van cholesterolverrijking worden gepresenteerd: de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol om zoogdierweefsels en -cellen te verrijken, en het gebruik van met cholesterol verrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies (liposomen) om Xenopus-eocyten te verrijken. Deze methoden zijn instrumenteel voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus in moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie.

Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol

Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.

Isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen door ultracentrifugatie

Hierin beschrijven we de protocollen om de hoeveelheid fluorescerende fosfolipide te meten die specifiek uit lipidedonordeeltjes wordt verwijderd door lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) die aanwezig is in volledig menselijk plasma of serum. We hebben aangetoond dat deze metriek van HDL-functionaliteit incidentele hart- en vaatziekten voorspelt.

Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Het doel van dit protocol is om de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro die gemengde kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen beoordelen.

Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker<em&gt; In Vitro</em

Konijnen worden veel gebruikt om de farmacokinetiek van intraoculaire geneesmiddelen te bestuderen. We beschrijven een methode voor het uitvoeren van farmacokinetische studies van intraoculaire geneesmiddelen met behulp van konijnenogen.

Het gebruik van Rabbit Eyes In farmacokinetisch onderzoek van de intra-oculaire Drugs

Ontdek hoe lipideverlagende geneesmiddelen de morfologie van cholesteroldeeltjes beïnvloeden met de plaque array-methode. Deze techniek helpt onderzoekers bij het identificeren van biomarkers voor atherosclerose.

Differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van Cholesterol deeltjes

Meer video's verkennen