Differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van Cholesterol deeltjes
10 november 2017
Het doel van deze studie was om te evalueren in vitro lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes. Vergelijking van lipide-verlagende geneesmiddelen toonde variaties in hun effect bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes.
Het algemene doel van deze studie is om het effect van cholesterolverlagende medicijnen op het moduleren van morfologische kenmerken van cholesteroldeeltjes te evalueren met behulp van een plaque-array-methode, en om potentiële biomarkers te identificeren voor de diagnose van atherosclerose en het bepalen van de effecten van geneesmiddelen. De rol van cholesterolverlagende medicijnen bij het moduleren van cholesteroldeeltjesvorming is slecht begrepen. Hier laten we zien dat cholesterolverlagende medicijnen een directe rol spelen bij het veranderen van profielen en morfologische kenmerken van cholesteroldeeltjesvorming.
Het belangrijkste voordeel van de op plaque-array gebaseerde in vitro-beeldvormingsmethode boven andere deeltjesdetectiemethoden is dat het de visualisatie van cholesteroldeeltjes mogelijk maakt voor het evalueren van het effect van cholesterolverlagende medicijnen in serum. Jason Lundry, laboratoriumtechnicus voor Plaxgen, zal demonstreren hoe we de plaque-array-test opstelden met behulp van een chemische analyzator. Raymond Kong, senior wetenschapper bij Millipore Sigma, zal demonstreren hoe we de monsterverwerking doen met behulp van flowcytometrie met beeldvorming.
Ten slotte zal David Liu, laboratoriumtechnicus voor Plaxgen, de gegevensanalyse voor cholesteroldeeltjesbeelden demonstreren. Gebruik een chemische analyzator-1 om de plaque-array-test op te zetten voor cholesteroldeeltjesvorming. Houd gedurende de test het uiteindelijke reactievolume in elk putje op 200 microliter, en voer alle tests in drievoudig uit.
Laad eerst 194,5 microliter fosfaatgedempte zoutoplossing, of PDS, in elk putje van een ronde bodem, laag-eiwitbindende 96-welplate. Voeg aan elk putje twee punt vijf microliter van elke lipidverlagende medicijnoplossing toe, geen medicijn wordt toegevoegd aan de negatieve controlemonsters. Schud vervolgens de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen om het medicijn uniform in de oplossing te mengen.
Voeg tenslotte twee microliter fluorescent gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje. Schud de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen zoals eerder. Incubeer vervolgens de plaat op een laboratoriumschudder gedurende twee uur ingesteld op 37 graden Celsius en 200 tpm.
Na incubatie, verwerf de beelden van deeltjes door flowcytometrie met beeldvorming. Open de gegevensverwervingssjabloon om de juiste instrumentinstellingen te laden. Klik op Bestand en selecteer vervolgens Sjabloon laden en selecteer het sjabloonbestand.
Klik op Laden om het instrument voorbereiden voor monsterladen. Wanneer het dialoogvenster Monster laden opent, klikt u op OK om 50 microliter van de monsters in de flowcytometer met beeldvorming te laden. Wacht tot de deeltjes in realtime in het beeldgebied zichtbaar zijn.
Wanneer de deeltjes in het beeldgebied goed in focus zijn, klikt u op Verwerven om beelden van elk object tegelijkertijd op te halen op een hoge doorvoer voor donkerveld, helder veld, groen fluoresceren en geel fluoresceren. Aan het einde van de verwerving, klikt u op de knop Terug om het monster terug te brengen. Herhaal deze stappen om 5.000 tot 10.000 deeltjes van elk monster te verwerven.
Analyseer alle ruwe beeldbestanden met behulp van de beeldanalysesoftware voor het bepalen van objectfluorescentie-intensiteit en morfologische variaties, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een ronde bodem, laag-eiwitbindende 96-welplate voor door reagensen stapsgewijs te laden, met behulp van een uiteindelijk reactievolume van 200 microliter per putje. Bereid eerst de controlepottetjes voor.
Laad 193 microliter PBS in elk putje. Voeg 2,5% van het patiëntenserum toe, waarbij slechts één serummonster per putje wordt geladen. Schud vervolgens de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator te plaatsen.
Voeg vervolgens twee microliter fluorescentie-gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje. Schud weer de plaat gedurende 30 seconden door deze op de reactieplaat van de chemische analyzator-1 te plaatsen. Om de putjes met geneesmiddelen voor te bereiden, laad 191 microliter PBS in elk putje.
Voeg vervolgens 2,5% van elk patiëntenserum per putje toe en schud de plaat gedurende 30 seconden door deze op een chemische analyzator-1 reactieplaat te plaatsen. Voeg twee microliter ezetimibe, lovastatine, simvastatine of niacine-oplossing toe aan alle putjes behalve de negatieve controlepottetjes. Voeg slechts één geneesmiddel per putje toe.
Schud de plaat gedurende 30 seconden zoals eerder. Voeg vervolgens twee microliter fluorescentie-gelabelde cholesterolaggregatieoplossing toe aan elk putje voordat u de plaat gedurende 30 seconden schudt. Incubeer vervolgens de plaat gedurende twee uur in een laboratoriumschudder, ingesteld op 37 graden Celsius en 200 tpm.
Na incubatie, verwerf de monsters door flowcytometrie met beeldvorming volgens dezelfde instellingen als eerder. Gebruik de beeldanalysesoftware voor batchverwerking van alle beeldbestanden zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier getoonde zijn representatieve resultaten die de identificatie van globulaire en lineaire strengvormige cholesteroldeeltjes, geïnduceerd door statines, door een niet-enzymatische mechanisme laten zien.
Bevestiging van twee verschillende morfologieën van cholesteroldeeltjesvorming, geïnduceerd door andere lipidverlagende medicijnen, wordt getoond. Inclusief ezetimibe, niacine, fibraat en omega-3-vetzuur. Hier getoonde zijn dotplots, waarbij de X-as een spectrum van cholesteroldeeltjes weergeeft die in het groen fluoresceren kanaal worden gedetecteerd.
En de Y-as toont zijwaartse verstrooiing, gating toont regio's van zeer lage dichtheid lipoproteïne, lagedichtheids-lipoproteïne en hogedichtheids-lipoproteïne deeltjes, gedetecteerd in de fluorescentie dotplots. Deze resultaten laten zien hoe het lipidverlagende effect de profielen van gezuiverde VLDL en LDL-cholesteroldeeltjes verandert, in afwezigheid van geneesmiddel, ezemide, lovastatine, simvastatine en niacine. Hier getoond is
Overzicht
Deze studie evalueert de effecten van lipiderverlagende geneesmiddelen op de morfologie van cholesterolpartikels met behulp van een plaque-arraymethode. De bevindingen wijzen erop dat deze geneesmiddelen de profielen en morfologische kenmerken van de vorming van cholesterolpartikels aanzienlijk kunnen veranderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Cardiovasculair Onderzoek
Achtergrond
- De rol van lipidenverlagende geneesmiddelen bij de vorming van cholesteroldeeltjes is nog onvoldoende bekend.
- Cholesteroldeeltjes zijn cruciaal bij de ontwikkeling van atherosclerose.
- Bestaande methoden voor het bestuderen van cholesteroldeeltjes kennen beperkingen.
- De plaque array-methode biedt een verbeterde visualisatie van cholesteroldeeltjes.
Doel van de studie
- Om de effecten van cholesterolsenkende geneesmiddelen op de morfologie van cholesterolpartikels te evalueren.
- Om potentiële biomarkers te identificeren voor het diagnosticeren van atherosclerose.
- Om het begrip van de effecten van geneesmiddelen op de vorming van cholesterolpartikels te vergroten.
Gebruikte methoden
- Een plaque-arraymethode werd gebruikt voor in vitro imaging van cholesteroldeeltjes.
- Assays werden in triplo uitgevoerd met een finaal reactievolume van 200 microliters.
- Imaging flowcytometrie werd ingezet voor de analyse van de deeltjes.
- Beeldbestanden werden geanalyseerd op fluorescentie-intensiteit en morfologische variaties.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonbare verschillende morfologieën van cholesteroldeeltjes geïnduceerd door diverse lipيدverlagende geneesmiddelen.
- Identificatie van variaties in de respons van de vorming van cholesteroldeeltjes tussen verschillende serummonsters.
- Aantoonde dat lipideverlagende geneesmiddelen de profielen van VLDL- en LDL-cholesteroldeeltjes kunnen veranderen.
- Bevestiging van de aanwezigheid van globulaire en lineaire, strengvormige cholesteroldeeltjes.
Conclusies
- Lipidverlagende geneesmiddelen moduleren de morfologie van cholesteroldeeltjes significant.
- De plaque array-methode is effectief voor het evalueren van de effecten van geneesmiddelen op cholesteroldeeltjes.
- Verder onderzoek is nodig om de implicaties voor de diagnose van atherosclerose te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze studie introduceert een in vitro imagingbenadering om te evalueren hoe lipidenverlagende geneesmiddelen de morfologie van cholesterolpartikels direct moduleren, wat een mechanistisch inzicht biedt dat verder gaat dan traditionele lipidenprofielen. Door onderscheid te maken tussen globulaire en lineaire strengvormige partikels, ondersteunt deze methode targetvalidatie en fenotypische screening in atheroscleroseonderzoek. De bevindingen suggereren een potentiële bruikbaarheid bij het voorspellen van de medicijnrespons en het verfijnen van de patiëntenstratificatie voor de behandeling van dyslipidemie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door drugbehandelingen te koppelen aan specifieke morfologische veranderingen in cholesterolpartikels.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van door geneesmiddelen geïnduceerde structurele veranderingen in VLDL-, LDL- en HDL-subpopulaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve imaging-uitlezingen voor het screenen van drugseffecten op de partikelmorfologie in diverse serummonsters.
- Operationele waarde: Standaardiseert assay-condities door gebruik te maken van triplaatmetingen en gecontroleerde reactievolumes om reproduceerbaarheid te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt in vitro morfologische screening met klinische relevantie door hogere niveaus van lineair gevormde HDL te identificeren in dyslipidemische versus normale monsters.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit door menselijke serummonsters te gebruiken om de variabiliteit in medicijnrespons te beoordelen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De plaque-arraymethode kan worden geïntegreerd in vroege ontdekkingsworkflows als een fenotypische screeningstool die voorafgaat aan lead-optimalisatie door mechanistische inzichten te bieden in interacties tussen geneesmiddelen en cholesterol.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk over hoe lipide-verlagende middelen de vorming van cholesterolpartikels beïnvloeden, onafhankelijk van enzymatische pathways.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve morfologische output die geschikt is voor vergelijkende analyse tussen verschillende drugklassen en patiëntmonsters.
- Analytics: Genereert op beelden gebaseerde metrieken voor partikelvorm en -textuur die datagestuurde vergelijkingen van drugseffecten ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Gebruikt dyslipidemische en normale serummonsters om in vitro bevindingen te koppelen aan klinische observaties van de partikelverdeling.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor het beoordelen van lipide-modulerende verbindingen over verschillende therapeutische gebieden.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door niet-enzymatische mechanismen van geneesmiddelwerking op de structuur van cholesteroldeeltjes te onthullen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor monsterpreparatie, incubatie en imaging flowcytometrie.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door differentiële effecten van geneesmiddelen op pathogene subtypes van deeltjes te identificeren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van lipide-verlagende kandidaten op basis van morfologische modulatieprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in imaging flowcytometrie en software voor beeldanalyse voor morfologische kwantificering.
- Afhankelijk van toegang tot een chemische analyzer en plaque array-compatibele 96-well platen voor de behandeling van reagentia.
- Vereist standaardisatie tussen assay-operators en beeldanalisten om een consistente partikelclassificatie te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van de methode naar andere lipidetypen of ziekte-relevante lipoproteïnesystemen.
- Beperkt door het in vitro karakter van de assay, waardoor dynamische in vivo lipoproteïneremodeling mogelijk niet volledig wordt weerspiegeld.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Plaque Array Assay for Examining In Vitro Cholesterol Particles Formation
2:45
Capturing Images of Cholestrerol Particles Using Imaging Flow Cytometry
4:04
Analyzing the Effect of Drugs on Cholestrerol Particle Formation in Serum Samples
6:21
Results: Evaluating the Effects of Lipid-lowering Drugs on Modulating Morphology of Cholesterol Particles
8:25
Conclusion
