Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten
21 december 2017
Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.
Het algemene doel van dit protocol is om individuele transcripten in E.Coli te labelen voor fluorescentie gelabelde DNA-probes voor visualisatie in enkele-molecuul FiSH-experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de systeembicologie, zoals het karakteriseren van transcripten cel tot cel in het gebied van belang. Evenals de transcripten van celwand lokalisatie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoeveelheid informatie biedt over de statistieken van transcriptionele processen. Om het protocol te beginnen, kweek E.Coli MG1655 overnacht in LB-medium in een orbitale shaker, op 260 RPM en 37 graden Celsius. De volgende dag, verdun de overnacht cultuur bij een tot 100 in vers medium en meet de optische dichtheid in een spectrofotometer, tot een waarde van 0,2 tot 0,4.
Pellet vervolgens de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 4.500 G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant uit alle buizen. Voeg een milliliter 1XPBS toe aan elke buis en re-suspendeer het pellet om cel-tot-cel aggregatie te minimaliseren.
Voeg vervolgens vier milliliter fixatiebuffer toe en vortex de buis voorzichtig. Incubeer de monsters in een orbitale shaker. Re-suspendeer het pellet om cel-tot-cel aggregatie te minimaliseren, wat de celbeeldvorming kan verstoren.
Na incubatie, pellet de cellen, verwijder het supernatant en voeg een milliliter 1XPBS toe. Breng suspensies over naar 1,8 milliliter conische bodem microcentrifugebuizen. Pellet de cellen door centrifugatie.
Begin met bacteriële permeabilisatie door voorzichtig het supernatant te verwijderen. Gebruik kleine volume pipetten om alle vloeistof buiten het pellet te verwijderen. Vervolgens re-suspendeer het pellet in 300 microliters DEPC behandeld water.
Voeg 350 microliters hoogwaardige absolute ethanol toe en meng de oplossing voorzichtig door de buis om te draaien. Voeg nog eens 350 microliters ethanol toe en meng opnieuw. Draai vervolgens het monster met de buisrotator gedurende één uur op 20 RPM bij kamertemperatuur.
Pellet de cellen uit de permeabilisatie. Na centrifugatie, verwijder het supernatant. Voeg een milliliter van 20% wasbuffer toe aan de monsters.
Laat ze enkele minuten staan. Pellet vervolgens cellen door centrifugatie gedurende zeven minuten bij 750 G en vier graden Celsius. Verwijder het supernatant zeer voorzichtig en gebruik kleine volume pipetten om alle vloeistof buiten het pellet te verwijderen.
Voeg vervolgens de oligonucleotide probe set stock oplossing toe aan het hybridisatie buffer aliquot zodat de uiteindelijke oligonucleotide concentratie 250 nanomolar is en vortex de buis krachtig. Suspendeer de monsters in 50 microliters hybridisatie buffer die de oligonucleotide probes bevat, terwijl het vormen van bubbels wordt vermeden. Laat de monsters overnacht in het donker, op een heatblock bij 30 graden Celsius.
Om het wassen voor te bereiden, verkrijg voor elke te beeld te brengen monster een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg een milliliter wasbuffer toe aan elke buis. Voeg 10 tot 15 microliters van de gehybridiseerde monsters toe aan de nieuwe buis die de wasbuffer bevat.
Pellet de cellen door centrifugatie. Verwijder vervolgens het supernatant. Was de monsters nog twee keer.
Re-suspendeer het pellet in 25 microliters wasbuffer. Bereid een agarose gel voor door 150 milligram agarose toe te voegen aan 10 milliliter 2X SSC buffer. Magnetron de oplossing gedurende 10 tot 15 seconden elke keer, totdat agarose volledig is opgelost.
Stel vervolgens de buis opzij om een paar minuten af te koelen. Plaats vervolgens een scheidings, siliconen frame op de schuif zodat het midden van de schuif bloot blijft. Plaats een 10 millimeter brede, een tot twee millimeter dikke stijve ring in het midden van de schuif.
Deponeer een kleine hoeveelheid gel in het midden voor verzegeling en wacht een paar minuten tot het gel hard is geworden. Voeg vervolgens meer gel toe, tot een hoge koepelvorm is gevormd. Wacht ongeveer 10 minuten tot het gel is hard geworden en verwijder de ring.
Deponeer 10 microliters van was bacteriële cellen op het gel en verzegel het met een nummer nul dekglas schuif. Houd het monster in het donker om foto-bleken te voorkomen. smFiSH metingen van E.coli cellen tonen het niveau van galK inductie in reactie op variabele extracellulaire D-fucose concentraties.
Het achtergrondsignaal wordt getoond door een galK verwijderde stam, of delta galK JW0740 als negatieve controle. Talrijke vlekken worden gezien in de meeste cellen. Overeenkomstig met enkele of weinig galK transcripten wanneer twee millimolair D-fucose wordt toegevoegd aan de bacteriecultuur.
Terwijl een paar vlekken worden gezien in de afwezigheid van extracellulaire D-fucose. Een ander voorbeeld voor de toepassing van dit protocol wordt geleverd door het sodB gen, met fluorescentie en fasecontrast afbeeldingen van smFiSH in een wild type of een JW1648 sodB verwijderde stam. Monsters bereid met dit protocol kunnen ook worden afgebeeld met behulp van STORM die nauwkeurige precisie van transcripten in de cel mogelijk maakt.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van de systeembicologie om de statistieken van transcriptiegebeurtenissen in individuele cellen te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele messenger RNA (mRNA) transcripten met fluorescerend gelabelde DNA-sondes voor gebruik in single-molecuulfluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) experimenten in E. coli. Deze techniek maakt de gelijktijdige detectie, lokalisatie en kwantificering van enkele mRNA-moleculen in gefixeerde individuele cellen mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Systeembiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Single-molecuulfluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een krachtige visualisatiemethode.
- Deze methode maakt de studie van transcriptionele processen op enkel-celniveau mogelijk.
- Het begrijpen van mRNA-lokalisatie en kwantificering is cruciaal voor systeembiologie.
- E. coli dient als modelorganisme voor deze experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om individuele mRNA-transcripten in E. coli te labelen.
- Om mRNA-lokalisatie te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde DNA-sondes.
- Om het begrip van transcriptionele variabiliteit tussen cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kweek E. coli MG1655 overnacht in LB-medium.
- Verdun de overnachtelijke kweek in vers medium.
- Meet de optische dichtheid om de juiste groeicondities te waarborgen.
- Pas fluorescerend gelabelde DNA-sondes toe voor smFISH-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van individuele mRNA-transcripten.
- Visualisatie van mRNA-lokalisatie binnen gefixeerde cellen.
- Kwantificering van transcriptionele processen op het niveau van enkele moleculen.
- Inzichten in cel-tot-cel-variabiliteit in transcriptexpressie.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van mRNA-dynamiek.
- Het draagt waardevolle informatie bij aan het veld van systeembiologie.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende onderzoeksvragen met betrekking tot genexpressie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
