Name: Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer hoe je eiwit halfwaardetijden kwantificeert in enkele levende cellen met SNAP-tags en fluorescentie tijdverloopmicroscopie. Deze methode onthult heterogeniteit in eiwitafbraak binnen celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Time-lapse microscopie experimenten werden uitgevoerd op de Biomoleculaire Screening faciliteit (BSF), EPFL. Wij danken Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) voor de videografie en het bewerken van de film.

Opmerking: In deze studie, de E14 ES-cellijn werd gebruikt. Dit protocol is echter direct van toepassing op alle andere muis ES cellijn uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten aan een module-code, door de endogene proteïne te labelen of met behulp van overexpressie. Voor een voorbeeld in het gedeelte ' resultaten ', doxycycline-afleidbare module-tag fusion cellijnen werden gebruikt (module-tag gesmolten aan de volgende eiwitten: Nanog, Oct4, Srsf11, of de mOrange2 van fluorescente proteïnen en sfGFP, en onder de controle van een Doxycycline-afleidbare promotor. (Zie11 voor meer informatie over de plasmiden gebruikt voor de generatie van de doxycycline-afleidbare fusion cellijnen van module-tag). De doxycycline-afleidbare systeem kunnen bijzonder nuttig, omdat het zorgt voor een strak controle van de timing en intensiteit van de uitdrukking van de proteïne van belang. C-terminal positionering van de module-tag wordt aanbevolen, als het veranderen van het N-terminaal aminozuur volgorde is meer kans om te veranderen de halfwaardetijd van het target-eiwit (N-einde regel12).
1. E-cadherine coating en cel zaaien
<ol><li>Het genereren van een ES-cellijn uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten met de module-label4.</li>
	<li>Jas 100 mm cel cultuur gerechten met 4 mL 0,1% gelatine (verdund in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 +/Mg2 +) voor 1 h. gelatine verwijderen en laten drogen voor 1 h. gebruik onmiddellijk of opslaan van de gecoate gerechten voor maximaal 2 maanden.</li>
	<li>Groeien de cellijn van belang in het kweekmedium cel van ES (Glasgow Minimum essentiële Medium, aangevuld met 10% ES cel-gekwalificeerde foetale runderserum met 2 mM natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 100 µM 2- mercaptoethanol, leukemie remmende factor (LIF), 3 µM CHIR99021 en 0.8 µM PD184352) op gelatine beklede gerechten bij 37 ° C en 5% CO2 voor 2 dagen tot het bereiken van een samenloop van 10-20 Mio cellen per schotel. Opmerking: Hier, LIF werd geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK 293T cellen, gevolgd door supernatant collectie en filteren. Elke batch van LIF is getest voor zijn potentieel te handhaven pluripotent, maar concentraties waren niet bepaald. Echter recombinante LIF ook commercieel beschikbaar is en de concentratie gebruikte voor de cultuur van de cel van de muis ES is 1000 eenheden/mL13.</li>
	<li>Jas van een 96-wells-plaat geschikt voor imaging met 30 µL van recombinante muis E-cadherine Fc chimera eiwit (E-cad-Fc) per putje (5 ng/µL, verdund in PBS met Ca2 +/Mg2 +. Gebruik van voorraad concentraties van 100 ng/µL, opgeslagen bij-80 ° C). Vermijd uitgebreide pipetteren, zoals E-cad-Fc erg kwetsbaar is. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur. Opmerking: Afhankelijk van de Microscoop, andere indelingen kunnen worden gebruikt.</li>
	<li>De E-cad-Fc gecombineerd, eens wassen met 100 µL van PBS met Ca2 +/Mg2 +en voeg 100 µL voorverwarmde ES cel kweekmedium.</li>
	<li>De cellen van belang met 5 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +wassen. Gecombineerd en voeg 2 mL trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Voeg 4 mL ES cel kweekmedium, resuspendeer en spin down bij 1000 x g gedurende 4 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver vers ES cel kweekmedium. Opmerking: PBS zonder Ca2 +/Mg2 + moet worden gebruikt voor het wassen van de cellen voor trypsinebehandeling om te verwijderen van Ca2 + -ionen, die nodig voor cel adhesie zijn. Daarentegen voor de E-cad-Fc verdunnings- en coating (stap 1.4), gebruikt PBS met Ca2 +/Mg2 +, sinds de hechting van ES-cellen naar E-cad-Fc gecoate gerechten is Ca2 +-afhankelijke14.</li>
	<li>Verdun de geresuspendeerde cellen 1:10 in 1 mL ES cel kweekmedium en tellen, met behulp van een tellen kamer (belasting 10 µL voor een kamer van 0.1 mm diepte).</li>
	<li>Zaad 30.000 cellen/cm2 in de E-cad-Fc gecoat imaging plaat. Vul tot 200 µL per putje met ES cel kweekmedium. Voor doxycycline-afleidbare cellijnen, veroorzaken met een passende dosis van doxycycline (optimaliseren dosis en tijdstip van de inductie van tevoren. De hier gebruikte cellijnen werden behandeld met 500 ng/mL doxycycline 24 h vóór imaging). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 en ga verder met de pols labeling en imaging 24 h na het zaaien van de cel.</li>
</ol>2. pulse labeling van de module-tag
Opmerking: Voor eiwit verval experimenten is het cruciaal om te gebruiken een adequate module kleurstof concentratie. De concentratie moet hoog genoeg om de opbrengst van een helder signaal in het begin van de tijd-tijdspanne, zoals de fluorescentie in de tijd afnemen zal. Echter, het gebruik van teveel kleurstof concentraties kan veroorzaken residuele kleurstof in het medium of in de cellen wordt overgelaten zelfs na het wassen. De gratis kleurstof kan het vervolgens binden aan nieuw geproduceerde module-tag moleculen in de loop van de film, die de verval-curve vervormen zal. De waargenomen fluorescentie signaal zal afhangen van de eigenschappen van de kleurstof, de cellijn gebruikt, evenals het niveau van de expressie van het overeenkomstige eiwit. Het is daarom van cruciaal belang voor het optimaliseren van de kleurstof concentratie door het testen van verschillende verdunningen, vanaf de verdunning voorgesteld voor beeldvorming van de levende cel door de fabrikant. Voor deze studie, werd een far-red fluorescerende substraat gebruikt. Een optimale concentratie van 12 nM was vastbesloten voor doxycycline-afleidbare overexpressie cellijnen.
<ol><li>Verdun de kleurstof van de module naar de juiste concentratie in voorverwarmde ES cel kweekmedium. Gebruik een pipet zachtjes het medium verwijderen uit de cellen die eerder in de 96-wells-plaat zaadjes en voeg 50 µL van verdunde module kleurstof per putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>De verdunde kleurstof met een pipet gecombineerd en 3 x met 200 µL voorverwarmde PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) wassen. Voeg 200 µL van ES cel cultuurmedium en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Herhaal de vorige stappen van wassen tweemaal meer. Opmerking: De uitgebreide wassen is belangrijk om een ongebonden kleurstof te verwijderen. De stappen van de herhaalde wassen met PBS verwijdert de residuele extracellulaire kleurstof in het medium, overwegende dat de 15 min incubations robuuste labeling van de module-tag fusion eiwitten zorgen vóór het opstarten van de beeldvorming experiment. Echter de stappen wassen door zachte pipetteren en gebruik niet een automatische aspirator, zoals cellen ontpit op E-cad-Fc de neiging om gemakkelijk los te maken.</li>
	<li>Voeg 200 µL van imaging medium. Vermindering van de fluorescentie-achtergrond, het gebruik van fenol red gratis medium (aangevuld met 10% ES cel-gekwalificeerde foetale runderserum 2 mM natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 en 0.8 µM PD184352).</li>
</ol>3. time-lapse microscopie
<ol><li>Gebruik een Microscoop geschikt voor levende imaging, waardoor gecontroleerde temperatuur en CO2. Stel de temperatuur tot 37 ° C en de CO-2 tot 5% voorafgaand aan gebruik en laat equilibreer gedurende 1-2 h.</li>
	<li>Plaats de plaat in de Microscoop en plekken te vinden die geschikt zijn voor imaging. Selecteer de plekken waar de cellen zijn gelijkmatig verdeeld, maar niet te dichte, aangezien dit de analyse zal vergemakkelijken. Aanpassen van het aantal geselecteerde plekken om het aantal cellen die nodig zijn voor de analyse. In deze studie, werden 3-5 plekken per cellijn geregistreerd.</li>
	<li>Selecteer het doel. Een 20 X doelstelling is geschikt voor de grootte van ES-cellen.</li>
	<li>Selecteer de instellingen van de verlichting voor de fluorescerende zender (s) worden geregistreerd. Het aanpassen van de kracht van de laser en de blootstelling volgens de intensiteit van de fluorescentie-signaal uit de cellen van belang. Zorg ervoor om het verkrijgen van een sterke eerste signaal, aangezien het zal in de loop van de film dalen, maar vermijd laser bevoegdheden hoger dan 30% om te minimaliseren van fototoxiciteit en photobleaching. Voor deze studie, een filter van de excitatie van 632/22 nm (golflengte/bandpass), emissie filter van 679/34 nm (golflengte/bandpass), laser macht van 10% en de blootstelling tijd van 100 ms werden gebruikt.</li>
	<li>Selecteer de imaging-intervallen en de duur van de time-lapse experiment. Kies voor eiwitten met verwachte half-leven van 2-20 h, tijden van de acquisitie van 12-24 h met tijdsintervallen van 15 min. Voor shorter-lived eiwitten, verminderen de intervallen en overname keer, voor de verhoging van de eiwitten van de langduriger dienovereenkomstig.</li>
	<li>Imaging starten</li>
</ol>4. verwerking en analyse van het beeld
<ol><li>Het verzamelen van de verworven beelden als een stapel in TIFF-indeling. Gebruiken voor verdere verwerking en analyse, de FIJI software15. Als de time-lapse gegevens worden niet verzameld als een stapel door de Microscoop software, opent u alle frames van de time-lapse experiment in de software (hetzij door te klikken op bestand | Open... of slepen en neerzetten van de bijbehorende bestanden naar de werkbalk) en klik op afbeelding | Stapels | Afbeeldingen stapelen.</li>
	<li>De functie aftrekken achtergrond te verwijderen van de achtergrond van alle afbeeldingen in de stack. Om dit te doen, klik op proces | Aftrekken van de achtergrond. Selecteer de rolstraal van de bal in het pop-upvenster. Gebruik een straal die minstens de grootte van de cellen beeld. Als u wilt aftrekken van de achtergrond toepassen op alle cellen in de stack, selecteert u Ja in het proces stack? pop-upvenster.</li>
	<li>Selecteer een cel van belang en een streek van belang (ROI) rond met behulp van de werkbalk Tekenen. Voor nucleaire signalen, gebruikt u de ovaal selectie door eerste op het overeenkomstige tabblad op de werkbalk te klikken en vervolgens te klikken op de kern van belang en aanpassing van de ovaal rond het. Gebruik de freehand selectie voor zitten kundig voor volgen de contouren van de cel voor cytoplasmatische signalen of zeer dichte regio's. Vermijd met inbegrip van te grote gebieden van de achtergrond, hoewel het is niet nodig om te volgen de contouren van de cel juist als gevolg van de latere aftrekken van alle achtergrondpixels (stap 4.8-4.9).</li>
	<li>De regio van belang aan de ROI-manager toevoegen door te klikken op analyseren | Tools | ROI manager | Toevoegen, of door op T te drukken op het toetsenbord.</li>
	<li>Het volgende frame gaan door het tabblad in het venster van de stapel te bewegen of door te drukken op shift + < op het toetsenbord, herhaalt u de vorige acties. Volg de cel van belang in de loop van de film en de ROI van elk frame toevoegen aan de manager van de ROI. Opslaan van de laatste ROI voor elke bijgehouden cel instellen door te klikken op meer | Opslaan... in de manager van de ROI. Opmerking: Na celdelingen, volgen beide dochtercellen afzonderlijk en optellen van hun geïntegreerde intensiteiten na achtergrond aftrekken (Zie stappen 4.6-4.9) ter verantwoording voor eiwit verdunning tijdens de celdeling. Sla de ROI-sets voor beide dochtercellen.</li>
	<li>Zodra de cel van belang wordt bijgehouden gedurende de film, klik op de maatregel, met het oog op de waarden voor de gemiddelde intensiteit en het gebied van de ROI. De verkregen waarden in een elektronische spreadsheet-programma kopiëren en de ruwe geïntegreerde intensiteit van de cel voor elk tijdstip als volgt berekenen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> waar bedoelcis de gemiddelde intensiteit engebiedChet gebied van de bijbehorende ROI.</li>
	<li>Toevoegen als u wilt schatten de lokale achtergrond, een ROI dicht bij de cel van belang voor elk frame van de tijd. Vermijd met inbegrip van elke cellulaire fluorescentie-signaal. Gebruik een circulaire ROI dat is ongeveer de grootte van een cel en verplaatsen of verschrompelen op dienovereenkomstig indien nodig, bijvoorbeeld als naburige cellen bemoeien. Ga verder zoals eerder beschreven met de cellular ROI ingesteld met het oog op een achtergrond ROI instellen en de van de gemeten intensiteitswaarden naar het werkblad kopiëren.</li>
	<li>Voor het verkrijgen van een achtergrond-gecorrigeerde waarde voor de geïntegreerde intensiteit van de cel, eerst de geïntegreerde intensiteit van de achtergrond voor elk tijdstip te berekenen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> waar bedoel vanBG is de gemiddelde intensiteit van het signaal van de achtergrond en het gebiedC is het gebied van de ROI rondom de cel. Gebruik niet het gebied van de achtergrond ROI, tenzij beide gebieden dezelfde grootte hebben.</li>
	<li>Bereken de definitieve achtergrond-afgetrokken geïntegreerde intensiteit van de cel voor elk punt van de tijd: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Verdeel de intensiteitswaarde van elke tijd-punt door de intensiteitswaarde van de eerste tijd-punt om te normaliseren de eencellige verval curven. Opmerking: De curve-fitting (zie stap 4.11) kan worden uitgevoerd op elke één cel of op de gemiddelde bevolking. Een normalisatie is vereist als het gemiddelde van een populatie, op basis wordt berekend om te voorkomen dat de vooroordelen van verschillende fluorescentie intensiteiten tussen cellen. De normalisatie zorgt dus voor dat elke cel met hetzelfde gewicht aan de kromme definitief verval bijdraagt. Bovendien, kan de normalisatie zinvol zijn om te visualiseren de eencellige vervalt onafhankelijk van hun absolute fluorescentie intensiteiten (Zie Figuren 3A-3 C). Echter als er slechts het half-leven van eencellige worden bepaald en de gegevens niet is gemiddeld, de normalisatie stap mag achterwege blijven en de curve-fitting kan rechtstreeks worden uitgevoerd op de ruwe gegevens.</li>
	<li>Gebruik het hulpmiddel van de montage van een gebogen lijn voor de schatting van de eiwit-halfwaardetijd. In deze studie werd de MATLAB-curve passend werkset 3.4.1 gebruikt, die zich standaard in de Apps sectie van de MATLAB-gebruikersinterface bevindt. Importeren van de intensiteit van de fluorescentie en tijdwaarden uit de elektronische spreadsheet in MATLAB door te klikken op de tab Gegevens importeren de curve passend werkset openen en selecteer de tijdstippen en de fluorescentie decay gegevens in de X gegevens en Y gegevens tab. Kies Aangepaste vergelijking in de curve-fitting tab en geef de vergelijking voor een exponentiële afname: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> waar f(t) de intensiteit van de fluorescentie op een bepaald tijdstip is, een de eerste intensiteit en b het verval tarief. In de Opties passen... tab, Selecteer 0 voor de ondergrens van zowel a en b. De geschatte waarden voor a en b wordt vervolgens weergegeven in het resultatenvenster. De halfwaardetijd als volgt berekenen: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15173609">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li>
<li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Select%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li>
<li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li>
<li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li>
<li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li>
<li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).</li>
<li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li>
<li>Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li>
<li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAST%3A+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076938">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li>
<li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability%2C+DNA+Binding%2C+and+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest cruciale stap bij het gebruik van een module-tag controleren eiwit verval om ervoor te zorgen is dat geen residuele ongebonden kleurstof niet in het medium of in de cellen na het wassen, anders het zou kunnen binden aan nieuw geproduceerd module-tag moleculen later in de loop van het experiment en ther Eby compromis de verval-curve. Dit is aan de ene kant bereikt door alle beschreven wassen stappen zorgvuldig uitvoert. Aan de andere kant, de kleurstof concentratie moeten zo laag mogelijk te houden, terwijl nog s...

Het is algemeen bekend dat cellulaire eiwitten ondergaan uitgebreide omzet, met synthese en degradatie tarieven specifiek voor elke proteïne en onder voorbehoud van fysiologische regelmechanismen. Traditioneel, zijn eiwit-afbraak-tarieven gemeten gebruik van bulk methoden, zoals radioactieve pulse chase analyse, of waarbij de eiwit synthese remmers zoals cycloheximide1. Meer recentelijk is te kwantificeren eiwit omzet op een wereldwijde schaal2stabiele isotoop labelen met aminozuren in celkweek (SILAC) in combinatie met massaspectrometrie opgezet. Echter, deze methoden worden beperkt door de bevolking gemiddeld, en informatie over de cel-naar-cel variabiliteit daarom verloren. Bovendien, voorbijgaande veranderingen in de afbraak van eiwitten die niet-gesynchroniseerde over de celpopulatie bevat zijn niet kunnen worden geïdentificeerd.
Als alternatief, eiwit halfwaardetijd kunnen ook worden bepaald door fluorescentie-gebaseerde benaderingen, die vaak het voordeel hebben van het verstrekken van eencellige resolutie. Bijvoorbeeld is een photoactivatable groen fluorescent proteïne (paGFP) gebruikt om te bepalen Oct4 halfwaardetijd in de vroege zoogdieren embryo3. Een andere methode om te controleren van eiwit verval in levende cellen is het gebruik van een module-tag in combinatie met fluorescentie time-lapse beeldvorming. De module-tag is een mutant versie van de DNA repair enzymen O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) die specifiek reageert met benzylguanine (BG) derivaten, die kunnen worden gekoppeld aan moleculaire sondes4,5, 6. daarom elke module-tag fusieproteïne onomkeerbaar kan worden aangeduid met een fluorescente, cel permeabele kleurstof. Pulse labeling van een proteïne van belang gesmolten tot de module-tag, gevolgd door wegspoeling van de resterende kleurstof, staat voor het toezicht op de afbraak van de gelabelde eiwit bevolking en dus voor de bepaling van eiwit half-life. MODULE-tags zijn met succes gebruikt voor het labelen van de puls-chase van eiwitten en voor de bepaling van eiwit halfwaardetijd in aanhanger cel cultuur en in vivo5,7,8,9. Een grote verscheidenheid van module-tag substraten die betrekking hebben op gebruikte TL spectra zijn commercieel verkrijgbaar, waardoor de selectie van de optimale kleurstof voor elke specifieke toepassing. MODULE-tags kunnen dus ook worden gebruikt voor multicolor imaging in combinatie met andere tl fusie-eiwitten of kleurstoffen. Cel-ondoordringbare kleurstoffen zijn geschikt voor het labelen van membraan-aangebonden proteïnen, terwijl cel-permeabele kleurstoffen die van toepassing zijn zijn voor het toezicht op zowel intracellulaire en membraan-gebonden eiwitten. Bovendien, sommige van deze sondes bijna geen basale fluorescentie vertonen en pas uitstoten een sterk fluorescerende signaal op binding aan een module-tag10.
Dit protocol beschrijft hoe meet je de tarieven van de afbraak van verschillende eiwitten van belang in afzonderlijke cellen met behulp van een module-tag. Hier wij deze methode toepassen op muis embryonale stamcellen (ES) cellen gekweekt op E-cadherine, maar het moet mogelijk zijn om het te gebruiken met elk celtype aanhangend gekweekte. We laten zien dat pols labeling van module-tag fusion eiwitten gevolgd door fluorescentie time-lapse imaging zorgt voor het bepalen van het eencellige half-leven van verschillende eiwitten van belang en schatting voorziet in de cel-naar-cel variabiliteit van helft-leven in een bevolking van gekweekte cellen.

<table><tbody><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES-cellijn die een SNAP-tag-fusie-eiwit van belang tot expressie brengt</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelde celcultuurschaal</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96-wel, zwart/helder, weefselcultuurbehandeld plaatje</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-verbeterde telkamer, 0,1 mm</td><td>Marienfeld-superieur</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Celbeeldvormingssysteem</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum, geschikt voor embryonale stamcellen</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium &nbsp; Niet-essentiële aminozuren</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Leukemie-remmende factor</td><td>-</td><td>-</td><td>Geproduceerd in het laboratorium door middel van transiente transfectie van HEK-293T-cellen, gevolgd door het verzamelen en filteren van het supernatant.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3-remmer XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit runderhuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS 10x geconcentreerd</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS Zonder Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA-oplossing 0,25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis E-Cadherin Fc Chimera-eiwit</td><td>R&amp;D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Open-source beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door time-lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Eiwitten zijn in een dynamische staat van synthese en degradatie en hun halfwaardetijd onder verschillende omstandigheden kunnen worden aangepast. Echter, meest gebruikte benaderingen te bepalen eiwit half-life zijn ofwel beperkt tot bevolking gemiddelden uit lysed cellen of vereisen het gebruik van proteïne synthese remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van de module-tag fusion eiwitten in combinatie met fluorescentie time-lapse microscopie. Een proteïne van belang gesmolten naar een module-tag kan worden covalent gebonden door een fluorescerende, cel permeabele kleurstof die is gekoppeld aan een benzylguanine-derivaat en het verval van de gelabelde eiwit bevolking kan worden gecontroleerd na wassen van de resterende kleurstof. Volgende cel bijhouden en kwantificering van de intensiteit van de geïntegreerde fluorescentie over tijd leidt tot een exponentiële afname kromme voor elke bijgehouden cel, zodat voor de bepaling van eiwit afbraak tarieven in afzonderlijke cellen door curve-fitting. Deze methode biedt een schatting voor de heterogeniteit van de helft-leven in een populatie van gekweekte cellen, die niet gemakkelijk worden beoordeeld door andere methoden. De hier gepresenteerde benadering is van toepassing op elk type van gekweekte Adherente cellen, uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten aan een module-code. Hier gebruiken we muis embryonale (ES) stamcellen gekweekt op E-cadherine-coated cel cultuur platen om te illustreren hoe één cel afbraak tarieven van eiwitten met een breed scala aan helft-leven kunnen worden bepaald.

Het beschreven protocol biedt een schatting van de variabiliteit van cel naar cel in half-life voor een bepaald eiwit gesmolten aan een module-code. Het gebruik van recombinante E-cadherine-Fc afdekhoes voor de beeldvorming plaat zorgt voor eencellige resolutie in ES-cellen, die anders in kolonies groeien. Afzonderlijke cellen kunnen afzonderlijk worden bijgehouden in de loop van de film ( figuur 1A).
Om te bepalen de halfwaardetijd eiwit voor elke één cel, is het...

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Het algemene doel van deze benadering van fluorescentiebeeldvorming is om de halfwaardetijd van een eiwit van belang in enkele levende cellen te bepalen met behulp van een SNAP-tag. Cellulaire eiwitten worden uitgebreid omgezet met synthese- en degradatiesnelheden die specifiek zijn voor elk eiwit en onderhevig zijn aan fysiologische regulatie. De meest gebruikte methoden om de halfwaardetijd van eiwitten te bepalen, zijn echter beperkt tot populatiegemiddelden uit lice-cellen of vereisen het gebruik van eiwitsyntheseremmers.In deze video demonstreren we hoe een SNAP-tag in combinatie met fluorescentie-tijdsverloopmicroscopie kan worden gebruikt om de halfwaardetijden van eiwitten in levende cellen te meten. Het voordeel van deze methode is dat deze een resolutie op celniveau bereikt en daarom een schatting geeft van de heterogeniteit van halfwaardetijden in een populatie gekweekte cellen. De experimentele procedure die hier wordt gepresenteerd, kan worden toegepast op elk type adherente gekweekte cellen, die een eiwit van belang tot expressie brengen dat is gefuseerd met een SNAP-tag.Dit kan worden bereikt door endogene eiwitmarkering of door overexpressie van getagde eiwitten te

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

We presenteren een methode voor het verkrijgen van fluorescentie reporter tijdcursussen van enkele cellen met behulp van micropatterned arrays. Het protocol beschrijft de voorbereiding van eencellige arrays, de installatie en werking van live-cell scanning time-lapse microscopie en een open-source beeldanalysetool voor geautomatiseerde voorselectie, visuele controle en tracking van celgeïntegreerde fluorescentietijdcursussen per adhesieplaats.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Leer hoe je eiwit halfwaardetijden kwantificeert in enkele levende cellen met SNAP-tags en fluorescentie tijdverloopmicroscopie. Deze methode onthult heterogeniteit in eiwitafbraak binnen celpopulaties.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Meer video's verkennen