Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Het algemene doel van deze benadering van fluorescentiebeeldvorming is om de halfwaardetijd van een eiwit van belang in enkele levende cellen te bepalen met behulp van een SNAP-tag. Cellulaire eiwitten worden uitgebreid omgezet met synthese- en degradatiesnelheden die specifiek zijn voor elk eiwit en onderhevig zijn aan fysiologische regulatie. De meest gebruikte methoden om de halfwaardetijd van eiwitten te bepalen, zijn echter beperkt tot populatiegemiddelden uit lice-cellen of vereisen het gebruik van eiwitsyntheseremmers.

In deze video demonstreren we hoe een SNAP-tag in combinatie met fluorescentie-tijdsverloopmicroscopie kan worden gebruikt om de halfwaardetijden van eiwitten in levende cellen te meten. Het voordeel van deze methode is dat deze een resolutie op celniveau bereikt en daarom een schatting geeft van de heterogeniteit van halfwaardetijden in een populatie gekweekte cellen. De experimentele procedure die hier wordt gepresenteerd, kan worden toegepast op elk type adherente gekweekte cellen, die een eiwit van belang tot expressie brengen dat is gefuseerd met een SNAP-tag.

Dit kan worden bereikt door endogene eiwitmarkering of door overexpressie van getagde eiwitten te gebruiken. De SNAP-tag is een mutante versie van het DNA-reparatie-enzym, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, dat specifiek reageert met benzylguanine, dat kan worden gekoppeld aan moleculaire sondes. Daarom kan elk SNAP-tag-fusie-eiwit onomkeerbaar worden gelabeld met een florescentie-celdoorlatende kleurstof.

Na het wegspoelen van resterende kleurstof zal de gelabelde eiwitpopulatie exponentieel afnemen en kan de halfwaardetijd van het overeenkomstige eiwit worden afgeleid. In deze video gebruiken we embryonale stamcellen, die strakke kolonies vormen wanneer ze klassiek worden gekweekt op met gelatine beklede schotels. Om ze te laten groeien als een monolaag cellen, en daarmee een resolutie op celniveau te bereiken voor fluorescentiebeeldvormingsexperimenten, hebben we ze gekweekt op inc-beplaatjes, die de cel-cel-interacties verminderen die worden gemedieerd door cellulaire inc-expressie die wordt aangemaakt aan het plasmamembraan.

Verdun de recombinante inc-aanhanger tot vijf nanogram per microliter in PBS en voeg 30 microliters verdunde inc-aanhanger toe per klep in een 96-kleppenplaat, geschikt voor beeldvorming. Vermijd uitgebreid pipetteren, omdat recombinante inc-aanhanger erg kwetsbaar is. Incubeer gedurende anderhalf uur bij 37 graden.

Aspibeer de inc-aanhangeroplossing, was eenmaal met 100 microliter PBS en voeg tot 200 microliter voorgeweekt ESL-kweekmedium toe. Gebruik ESL-lijnen die een eiwit van belang tot expressie brengen dat is gefuseerd met de SNAP-tag. Was de cellen met vijf ml PBS.

Voeg vervolgens twee ml Tripson toe en incubeer gedurende vier minuten bij 37 graden. Voeg vier ml ESL-kweekmedium toe, hersuspendeer en centrifugeer gedurende vier minuten bij 1000 T. Aspibeer het supernatant, hersuspendeer in vers medium en tel de cellen.

Plaats 30.000 cellen per vierkante centimeter in de met inc-aanhanger beklede beeldvormingsplaat. Ga 24 uur na het zetten van de cellen verder met de SNAP-kleurstofkleuring. Verdun de celkleurstof in ESL-kweekmedium tot de eerder bepaalde optimale concentratie.

Aspibeer het medium met een pipet en voeg voorzichtig 50 microliter van de verdunde SNAP-kleurstof toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden. Aspibeer de kleurstof en was drie keer met 200 microliter voorgeweekt PBS.

Voeg 200 microliter ESL-kweekmedium toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden. Voer de wasstappen uit door voorzichtig te pipetteren en gebruik geen automatische aspirator, omdat cellen gemakkelijk losraken. Herhaal dezelfde wasstappen nog twee keer, voeg vervolgens 200 microliter beeldvormingsmedium toe.

Gebruik fenolroodvrij medium om de fluorescentieachtergrond te verminderen. Gebruik een microscoop die een gecontroleerde temperatuur en CO2 mogelijk maakt. Stel de temperatuur in op 37 graden en de CO2 op vijf procent voor gebruik en laat gedurende één tot twee uur in evenwicht komen.

Plaats de plaat in de microscoop en selecteer een plek die geschikt is voor beeldvorming. De heldere veldbeelden tonen de ESL die is bevestigd aan de met inc-aanhanger beklede schotel in een monolaag. Selecteer het objectief, een 20X objectief is geschikt voor deze grootte van ESL's.

Selecteer de verlichtingsinstellingen voor het fluorescentiekanaal dat moet worden opgenomen. Pas de laservermogen en belichting aan om een sterk signaal te verkrijgen, omdat dit zal afnemen in de loop van de film. Selecteer de acquisitieparameters voor het tijdsverloopexperiment.

Voor eiwitten met verwachte halfwaardetijden van twee tot twintig uur, kies acquisitietijdstippen van 12 tot 24 uur met tijdsintervallen van 15 minuten. Start het beeldvormingsexperiment. Gebruik de FIJI-software voor verwerking en analyse van de film.

Verzamel de verworven beelden als een stack en vervorm het. Gebruik de aftrekfunctie van de achtergrond in FIJI om de achtergrond van alle afbeeldingen in de stack te verwijderen. Selecteer een cel van belang, teken een interessegebied eromheen met behulp van de FIJI-werkbalk en voeg het interessegebied toe aan de ROI Manager.

Ga naar het volgende frame en herhaal de vorige acties. Volg de cel van belang gedurende de loop van de film en sla het ROI-set voor elke getraceerde cel op. Klik op meten om waarden voor de gemiddelde intensiteit en het gebied van de ROI's te verkrijgen.

Om de lokale achtergrond te schatten, voegt u een interessegebied toe in de buurt van de cel van belang voor elke tijdsframe. Klik uiteindelijk op meten om waarden voor de gemiddelde achtergrondintensiteit te verkrijgen. Bereken eerst de gemiddelde intensiteit van de cel door de verkregen waarde voor de gemiddelde intensiteit van het cellulaire ROI met het gebied ervan te vermenigvuldigen.

Vervolgens gaat u verder met het berekenen van de geïntegreerde achtergrondwaarde van de cel, door de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI te vermenigvuldigen met het gebied van de cellulaire ROI.