Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase

Het algemene doel van dit protocol is het identificeren en verwijderen van contaminerende nucleaseactiviteit tijdens eiwitzuivering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de retrovirologie, zoals de biochemie, structuur en dynamiek van integratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de identificatie en verwijdering van contaminerende DNA-nucleaseactiviteit uit een recombinant eiwit van belang tijdens de zuivering mogelijk maakt.

Begin met het ontdooien op ijs van één pellet E.coli die prototype schuimvirus-integrase tot expressie brengt. Gebruik een sonicator uitgerust met een biohorn van 0,5 inch diameter en een taps toelopende microtip van 0,125 inch diameter om gedurende 30 seconden te soniceeren bij 30% amplitude, terwijl de buis op ijs staat. Breng het celmonster na sonicatie over naar een koude ultracentrifugebuis en centrifugeer 60 minuten bij 120 000 ×g bij vier graden Celsius.

Na centrifugatie moet er een duidelijke pellet aanwezig zijn en kan de supernatant een gele kleur hebben. Overbreng de supernatant naar een koude conische buis van 50 milliliter. Stel vervolgens de FPLC-kolom van 110 millimeter lang en vijf millimeter diameter in met een 1,5 milliliter nikkelgeladen hars.

Sluit eerst de kolom aan op het FPLC-instrument en breng buffer aan. Het instrument moet real-time gegevens van de geleidbaarheid en de UV-absorptie bij 280 nanometer verzamelen. De geleidbaarheids- en UV-metingen moeten stabiliseren.

Indien nodig, laat buffers verder door de kolom stromen tot de metingen stabiel zijn. Laad met behulp van een superloop het eiwitmonster op de kolom met een stroomsnelheid van 0,15 milliliters per minuut en een maximale druklimiet van 0,5 megapascal. Bevestig de superloop aan de AKTA FPLC.

Nadat de kolom is gewassen en de eiwitten zijn geëlueerd, neemt u aliquots van 15 µL van de initiële flowthrough, de wasfrakties en de fracties met de piekabsorbentie bij 280 nm, en voegt u 15 µL van 2X SDS-PAGE-monsterbuffer toe aan elk monster. Kook de monsters gedurende drie minuten. Laad 10 µL van elk monster op 10% SDS-PAGE-gels, samen met vier µL voorgekleurde eiwitstandaarden.

Inspecteer de gel visueel om fracties te identificeren die nagenoeg zuiver prototype foamy virus integrase lijken te bevatten. Combineer deze fracties en noteer het volume tijdens het pipetteren. Dit is doorgaans acht tot 10 milliliters.

Meet met een spectrofotometer de UV-absorbentie bij 280 nanometer van de gecombineerde fracties en bereken de totale hoeveelheid prototype foamy virus integrase-eiwit. Een typische opbrengst is ongeveer 10 milligram per liter geïnduceerde cultuur. Om de hexahistidine-tag te verwijderen, supplementeert u het prototype foamy virus integrase met een eindconcentratie van 10-millimolair DTT en 0,1-millimolair EDTA.

Voeg vervolgens 15 microgram menselijk rhinovirus 3C-protease toe per milligram prototype foamy virus integrase en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Om heparin-affiniteitschromatografische fractionering van het prototype foamy virus integrase uit te voeren, wordt de natriumchlorideconcentratie van het monster verlaagd tot 200 millimolair door toevoeging van 1,5 volume buffer C. Laad vervolgens het verdunde prototype foamy virus integrase monster op de heparin-Sepharosekolom met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut en een maximale druklimiet van één megapascal. Na het wassen van de kolom en het opvangen van de gradiënt en de laatste wasbeurt, worden de load, flowthrough, wash en fracties geanalyseerd via 8%SDS-PAGE.

Evalueer vervolgens de fracties door de gel te kleuren met Coomassie-blauw. Prototype foamy virus integrase en de contaminerende nuclease hebben verschillende affiniteiten voor heparine-Sepharose-chromatografie. Identificeer de heparine-Sepharose-fracties die schijnbaar bijna zuiver prototype foamy virus integrase bevatten om te gebruiken in de nuclease-assay.

Om de nuclease-assay te starten, combineert u 3 µL heparinefractie, 50 ng supergecoild plasmid DNA van 3 kb en reactiebuffer tot een eindvolume van 15 µL. Incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C. Stop de reactie met 1 mg/mL Proteinase K en 0,5% SDS, en incubeer gedurende één uur bij 37 °C.

Voeg vervolgens 3,5 µL 6X laadkleurstof toe aan de nuclease-assayreacties en breng het volledige volume aan op een 1% agarosegel. Laat de gel één uur lang lopen bij 100 volt op kamertemperatuur, of totdat de kleurfrontzijde het einde van de gel bereikt. Wanneer de elektroforese is voltooid, moet een fluorescente scanafbeelding van de gel laten zien dat lineair DNA op de juiste grootte van 3 kb loopt, supercoiled DNA sneller loopt naar ongeveer 2 kb, en dat relaxed circle DNA langzamer loopt op circa 3,5 kb.

Bereken met behulp van beeldanalysemonsoftware het pixelvolume van het supergecoilde, lineaire en ontspande cirkelvormige plasmide in elke baan. Noem de som van de pixelvolumes van deze drie DNA-vormen de totale DNA-waarde en gebruik deze om het percentage lineaire en ontspannen cirkels te berekenen. Fracties die nuclease-contaminatie bevatten, vertonen een hoger percentage lineaire en ontspannen cirkels vergeleken met de negatieve controle.

Combineer de heparin Sepharose-fracties die geen contaminerende nuclease-activiteit vertonen en breng deze over in dialysebuizen met een poriegrootte van 10 millimeter en een molecular weight cut-off van zes tot acht kilodalton. Dialyseer gedurende één nacht bij vier graden Celsius tegen één liter dialyseoplossing. Win de volgende dag het nuclease-vrije prototype foamy virus integrase-monster uit de dialysebuis terug.

Meet de absorbantie bij 280 nanometer en bereken de uiteindelijke eiwitconcentratie. Verdeel het eiwit in aliquoten en vries deze snel in met vloeibare stikstof. Bewaar de aliquoten vervolgens bij minus 80 graden Celsius.

De nuclease-assay werd uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Negatieve controles omvatten plasmide-DNA zonder proteïne en een eerdere zuivering van wild-type prototype foamy virus integrase waarvan bekend is dat deze nucleasevrij is. Een positieve controle voor contaminerende nuclease-activiteit is een eerdere zuivering van katalytisch inactief prototype foamy virus integrase waarvan bekend is dat deze contaminerende nuclease bevat.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals biochemische assays of single-molecule imaging, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals over enzymkinetiek en -dynamiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u contaminerende nuclease-activiteit in een recombinant eiwit kunt identificeren en verwijderen.