Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

Het algemene doel van deze methode is de stabiele transfectie van hepatocyten in vivo, met vectorconstructies voor induceerbare gen- of shRNA-expressie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van leveronderzoek te beantwoorden. Het kan bijvoorbeeld worden toegepast om mechanismen bij leverkanker en regeneratie te onderzoeken.

Het grootste voordeel van deze techniek is de gecombineerde expressie van CreER samen met een induceerbare transgen-R shRNA-expressie in muishepatocellen in vivo, bereikt door hydrodynamische staartvene-injectie. Eric Hubner, een medische student uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Begin met het combineren van 150 nanogram invoervector die de korte haarspeld-RNA voor het doelwiteiwit bevat met 150 nanogram pTC Tet-vector en TE-buffer tot een totaal volume van acht microliters.

Breng vervolgens LR clonase enzymmix II op ijs en incubeer gedurende twee minuten. Vortex twee keer tijdens de incubatie. Voeg vervolgens twee microliters LR clonase enzymmix II toe aan de reactie en incubeer gedurende één uur bij 25 graden Celsius.

Na de incubatie, stopt u de reactie door één microliter proteïnase K-oplossing toe te voegen. Incubeer vervolgens gedurende tien minuten bij 37 graden Celsius. Transformeer vervolgens Stbl3 competente bacteriën met twee microliters kloningsmix volgens een standaard warmteschokprotocol.

Na het plateren van de transformatie op agarplaten met ampicilline, incubeer gedurende 24 uur bij 30 graden Celsius. De volgende dag, kies enkele kolonies en inoculeer kleine volumes bacteriële groeimedium voor incubatie overnacht. Na het isoleren van DNA en het bevestigen van de vectorintegriteit door Sanger-sequencing, bereid maxi-schaal DNA-preps van de constructie voor injectie voor.

Begin met het wegen van de muizen. Bereid vervolgens een steriele zoutoplossing voor die 15 microgram per milliliter endotoxinevrije Sleeping Beauty-vectorconstructie en één microgram per milliliter endotoxinevrije pchsB5 bevat. Bereid voldoende oplossing om elke muis te injecteren met een volume dat 10%van hun lichaamsgewicht is.

Vul een steriele 3-milliliter spuit met het vereiste volume voor één muis en bevestig een 27 gauge naald. Nadat u een geschikte hoeveelheid tissuepapier hebt toegevoegd om minimale bewegingsruimte te laten, maar voldoende ruimte voor ademhaling, plaatst u de muis in een geschikte begrenzer met ademhalingsgaten. Verwarm de staart gedurende 30 tot 60 seconden met een infraroodlamp terwijl u zorgvuldig kijkt naar tekenen van oververhitting, zoals snelle beweging van de staart of andere tekenen van agitatie.

Reinig vervolgens de staart met een alcoholdoekje. Steek de naald bijna horizontaal in een van de twee laterale staartaderen dicht bij de staartbasis. Als het succesvol is geplaatst, kan een kleine hoeveelheid bloed terugstromen in de kegel van de naald.

Injecteer het totale volume in de staartader binnen acht tot tien seconden. Verwijder de muis na de injectie onmiddellijk uit de begrenzer. Comprimeer het injectiewond met steriele gaas gedurende minimaal 30 seconden of totdat elk bloeden stopt.

Succesvolle hydrodynamische staartvene-injectie is cruciaal voor transfectie en vooral afhankelijk van injectiesnelheid, volume en tijd. Om intraveneuze injectie gemakkelijker te maken, zorg ervoor dat de muizen op de dag van injectie niet gestrest of uitgedroogd zijn. Na 30 tot 60 minuten solohuisvesting in een herstelkooi, plaats de muis terug in zijn oorspronkelijke kooi.

Begin de inductie van Cre recombinase 10 tot 15 dagen na staartvene-injectie om de opruiming van niet-geïntegreerde vectoren mogelijk te maken. Los tien milligram tamoxifen op in 40 microliters ethanol en incubeer gedurende tien minuten bij 55 graden Celsius met schudden. Vortex meerdere keren totdat het tamoxifen is opgelost.

Voeg vervolgens 960 microliters maïsolie toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 55 graden Celsius. Na afkoeling, trek de oplossing in een 1-milliliter insulinespuit met een 20 gauge naald. Vervolgens overschakelen naar een 27 gauge naald.

Om te injecteren, grijp eerst de muis bij de nek door deze voorzichtig met de duim en de tweede vinger vast te pakken, waarbij de staart tussen de basis van de hand en de vierde en vijfde vinger wordt vastgezet. Injecteer vervolgens intraperitoneaal 0,1 milliliter van de oplossing in de linker onderbuikkwadrant van de buik. Voor experimenten van minder dan tien dagen, geeft u continu doxycycline toe via drinkwater volgens het volgende protocol.

Los eerst vijf gram sucrose op in 100 milliliter leidingwater en autoclaveer. Los vervolgens 100 milligram doxycyclinehyclaat op in vijf milliliter van de sucroseoplossing in een 15-milliliter conische buis. Gebruik vervolgens een 10-milliliter spuit om de oplossing door een 0,2-micronfilter te steriel filteren.

Voeg vervolgens de gefilterde doxycyclineoplossing toe aan de resterende 95 milliliter sucroseoplossing en geef de oplossing aan de muis in plaats van drinkwater. Controleer dagelijks en vervang onmiddellijk als de oplossing troebel wordt, aangezien dit wijst op bacteriële overgroei. Bereid een 1-milliliter spuit met een 27 gauge naald voor met één milliliter van een 4%paraformaldehyde-oplossing.

Gebruik dissectiescharen en anatomische pincetten om een mediane laparotomie uit te voeren en de lever van de geëuthaniseerde muis bloot te leggen. Verplaats de dunne darm naar rechts om de poortader en de onderste holle ader bloot te leggen. Steek de naald van de voorbereide spuit in de onderste holle ader en snijd de poortader door.

Injecteer langzaam één milliliter PFA om het leverweefsel te doordrenken en autofluorescente rode bloedcellen te verwijderen. Na het verwijderen van de lever, spoel het in water en breng het over naar vijf tot tien milliliter 4%PFA-oplossing voor post-fixatie voordat het wordt gesneden. Injectie van een transposonconstructie die de constitutieve expressie van een induceerbare Cre recombinase combineert met induceerbare expressie van een transgen of een shRNA naar keuze in Cre-reportermuizen toonde robuuste expressie van het GFP-reportergen na Cre recombinase-