Name: Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer een 3D hydrogelcultuurmethode voor primaire ratgliacellen om neuro-inflammatie en gliaire littekenvorming te bestuderen. Deze techniek ondersteunt regeneratieve strategieën en gedetailleerde celbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de NSERC, CFI, AIHS, Alberta gezondheidsdiensten en de Davey Endowment for hersenonderzoek.

Het protocol voor de hersenen weefsel extractie van dag 1 Sprague-Dawley ratten pups, euthanized door onthoofding, werd goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Alberta.
1. Microglia en Astrocyt isolatie67,68
Opmerking: Alle media voor isolatie en cultuur van de cel is voorverwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) heeft 1% penicilline-streptomycine (PS). Alle Dulbecco van bewerkt Eagle's media met Ham de F12 nutriënten mengsel (DMEM/F12) wordt aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS). Enige mengsels met trypsine ontbreken FBS. Alle materialen in dit protocol zijn steriele (filter, alcohol, gekochte en gesteriliseerde met autoclaaf) en elke stap na stap nummer 1.8 is uitgevoerd in een kabinet met aseptische techniek bioveiligheid.
<ol><li>Verwarm 15 mL HBSS en 12,5 mL DMEM/F12 tot 37 ° C in 50 mL conische centrifuge buizen, en ongeveer 2 mL 0,25% trypsine met 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in een conische centrifuge tube van 15 mL per hersenen. Verwarm een extra 25 mL van DMEM/F12. Warme trypsine ongeveer 10 min voorafgaande te gebruiken ter voorkoming van verlies van enzymatische activiteit.</li>
	<li>Giet genoeg warm HBSS in steriele, 6 en 10 cm cultuur gerechten ter dekking van het oppervlak. Het bereiden van een 10 cm schotel voor elke twee hersenen plus een extra 6 cm schotel.</li>
	<li>Plaats maximaal 2 hersenen in elk 10 cm2 gerecht (figuur 2A).</li>
	<li>Onder een Microscoop dissectie, gebruik pincet gebogen en rechte scheidt de cortices langs de middellijn en het cerebellum met hersenstam. Dit levert drie secties van weefsel per hersenen (figuur 2B).</li>
	<li>Schil de dunne, semi-transparante, laag (hersenvliezen) van weefsel bevattende bloedvaten van elke sectie van de weefsels en negeren, overdracht van de resterende weefsel in een aparte cultuur schotel. Pak de dunne lagen blootgesteld door kortingen op de weefsels, met de Tang, en trek voorzichtig tot grote delen zijn 'opknoping uit' het hersenweefsel. Ten slotte Verwijder dit gedeelte door zachtjes trekken. Zie figuur 2C-2E voor representatieve foto's van vóór, tijdens en na deze stap.</li>
	<li>In een kast bioveiligheid, de resterende HBSS uit de cultuur schotel, zorgvuldig behoud van het weefsel te verwijderen. Het weefsel met een scalpel maceraat en overdracht van weefsel aan de voorverwarmde 15 mL tube met trypsine.</li>
	<li>Deze buis gedurende 25 minuten in een bad van 37 ° C te verteren het weefsel enzymatisch uit te broeden.</li>
	<li>Centrifugeer de buis naar beneden bij 500 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en giet het supernatant.</li>
	<li>Met behulp van serologische Pipetteer 10 mL, voeg toe 10 mL warme DMEM/F12 voor inactivering van de trypsine en triturate de oplossing 5 keer te breken van het weefsel.</li>
	<li>Centrifugeer de buis naar beneden bij 500 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en giet het supernatant.</li>
	<li>Met behulp van serologische Pipetteer 10 mL, resuspendeer de pellet in 10 mL warme DMEM/F12 en breng de oplossing over in een 50 mL conische centrifugebuis.</li>
	<li>Met een 10 mL injectiespuit met een naald 18 gauge, triturate de oplossing 3 keer.</li>
	<li>Deze oplossing distribueren in stappen van 12,5 mL warme DMEM/F12 per hersenen.</li>
	<li>Pipetteer 1 mL stappen van de triturated oplossing in een 12 goed plaat (1 per hersenen).</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2in een bevochtigde cel cultuur incubator. Media na drie dagen vervangen en vernieuwen van media om de volgende drie dagen. Na 2 weken, kunnen de cellen worden verzameld voor experimenten.</li>
</ol>2. Macromer synthese69
<ol><li>Weeg 375 mg hyaluronzuur (HA) zout in een conische centrifugebuis van 50 mL en voeg 37,5 mL gedestilleerd water.</li>
	<li>Spoel de oplossing met een vortexer voor 1 min en bewerk ultrasone trillingen ten het mengsel totdat het lijkt homogene en haar gel-achtige viscositeit verliest. Dit proces duurt 6 uur.</li>
	<li>Overdracht oplossing voor een bekerglas van 100 mL met een magnetische roer bar (38 mm), en roer krachtig bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Titreer zorgvuldig 5.0 M NaOH in de mengkamer HA en maatregel met pH-papier totdat de pH tussen 8 en 12 stabiliseert.</li>
	<li>Verzamelen van 3 mL verse methacrylzuur anhydride (MA, 94%), bedekt met stikstof tijdens de opslag. Opmerking: MA wordt blootgesteld aan de atmosfeer voor lange duur (dagen), dan verliest de reactiviteit. Let op: Alle gebruik van MA moet gebeuren in een zuurkast.</li>
	<li>Voeg 200 µL van MA in de mengoplossing HA. De reactie verlaagt de pH van de oplossing onder 8.</li>
	<li>Herhaal stap 2.4 tot en met 2.6 totdat de 3 mL MA zijn toegevoegd aan de oplossing. Dit kan maximaal 1-2 uur duren.</li>
	<li>Toestaan dat de reactie op blijven 's nachts bij 4 ° C, zonder mengen.</li>
	<li>Breng de oplossing aan 400 mL koude ethanol (EtOH) in een bekerglas van 500 mL en toestaan van neerslag voor 24-72 uur bij 4 ° C. 56
</li>
	<li>Zorgvuldig decanteren in het grootste gedeelte van de oplossing in een afzonderlijk bekerglas voor verwijdering, en verzamelen van het precipitaat op in een tube van 50 mL conische centrifuge. Dit kan worden verdeeld in 2-4 buizen, indien nodig.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 200 x g in een centrifuge gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en de afzet van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>De buis met koude EtOH herladen, meng de oplossing met een vortexer voor 1 min en herhaalt u stap 2.10-2.11.</li>
	<li>Voeg 25 mL steriel gedeïoniseerd water, meng de oplossing met een vortexer voor 1 min, bewerk ultrasone trillingen ten (> 20 kHz) voor 1 h, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
	<li>Plaats van de oplossing in een vriezer-80 ° C gedurende 15 minuten of totdat de bevroren of flash bevriezen in vloeibare stikstof. Let op: Bij het gebruik van vloeibare stikstof, gebruik van beschermende handschoenen, een gelaatsscherm en een schort.</li>
	<li>Bevriezen droog de buis (onder 0.1 mBar en -30 ° C) voor 24-48 h totdat een sneeuw-achtige poeder wordt geproduceerd.</li>
	<li>Op dit punt, test het monster voor zuiverheid via 1H nucleaire magnetische resonantie, waar de hoeveelheid methacrylaat protonen (pieken bij 6.1 en 5.6 pag/min), ten opzichte van methyl protonen (1.9 ppm), op de backbone HA kan worden bevestigd. Een minimumverhouding van 95% methacrylaat tot methyl protonen is aanvaardbaar. 69
</li>
</ol>3. gel vorming en 3D inkapseling65
<ol><li>
Dekglaasje aan en schimmel voorbereiding
	<ol>
<li>Maak een 50 mL gedestilleerd water oplossing van 2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylaat in een tube van 50 mL conische centrifuge.</li>
		<li>Plaats 18 mm glas coverslips in oplossing en rock gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tot 50 coverslips kunnen tegelijk worden toegevoegd.</li>
		<li>Spoel coverslips door serieel dompelen elk in 3 bekerglazen van 100 mL gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Droog de coverslips in een vacuüm bij 40 ° C's nachts met een exsiccator en oven.</li>
		<li>Snel het onderdompelen van individuele coverslips in 70% EtOH met een tang.</li>
		<li>Zonder drogen, door elke dekglaasje aan te vallen door een putje van een 12 goed plaat.</li>
		<li>Wassen en gecombineerd elk putje met steriel gedeïoniseerd water (1 mL per putje).</li>
		<li>Voeg 1 mL steriele 2 µg /mL poly-L-lysine (PLL) toe aan elk putje en incubeer gedurende > 2 h.</li>
		<li>Gecombineerd PLL oplossing en laat de coverslips in de lucht droog.</li>
		<li>Siliconenvloeist siloxaan (PDMS) mallen (Zie Figuur 1) in 70% EtOH, en plaats een op het midden van elke dekglaasje aan, onderdompelen en toestaan in de lucht droog en creëren een afdichting tussen de schimmel en glas.<ol>
<li>PDMS mallen voor te bereiden door het gieten van PDMS premix reagentia in een verhouding 10:1 in een platbodem polystyreen schotel. De hoeveelheid PDMS bereid is geselecteerd om de opbrengst van een blad ongeveer 1 mm dik. Formulier putjes in de PDMS, snijden van de platen met een punch van de cirkel met een inwendige diameter van 10.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de cel Opmerking: Alle stappen in het protocol worden uitgevoerd met steriele techniek in een kabinet bioveiligheid. De fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wordt ingesteld op pH 7.4 voor alle stappen.<ol>
<li>24 h vóór de inkapseling van de cel in HAMA, vernieuwen het medium voor de primaire culturen van 2 weken (vanaf stap 1.15) in de 12 goed platen. Voeg vervolgens 1 mL van DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS) middellange per putje.</li>
		<li>Voor elke 12-well plaat van cellen bereiden 12,5 mL verdunde trypsine (0,25% trypsine-EDTA verdund 30% met DMEM/F12 media), en 25 mL DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS) en warm in bij 37 ° C in een waterbad.</li>
		<li>Geconditioneerde medium ophalen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL (> 0,5 mL per putje) platen, grondig gecombineerd resterende vloeistof, en vervangen door 1 mL per putje van verdunde trypsine (0,075% trypsine-EDTA) voor 20-30 min in een incubator (37 ° C, 5% CO2) tot de confluente cellaag is losgekoppeld van de plaat.</li>
		<li>Herstellen van zwevende cel materiaal met een 1 mL Pipet (wordt weergegeven als een zwevende stuk) en verzamelen in een tube van 15 mL conische centrifuge. Verdund met een gelijkwaardige hoeveelheid DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS), en centrifuge op 200 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, teruggooi het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 10 mL warm DMEM/F12 (10% FBS en 1% PS), triturate van de cellen 5 keer met een pipet 10 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 2 minuten.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren, resuspendeer de cellen in 5 mL warm DMEM/F12 en de cellen overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge.</li>
		<li>Met een 10 mL injectiespuit met een naald 18 gauge, triturate van de cel-oplossing 3 keer en filtreer de schorsing door een zeef van 40 µm cel in een nieuwe conische centrifugebuis.</li>
		<li>Verzamelen van 10 µL celsuspensie, Verdun 1:100 in warme DMEM/F12 en cellen tellen met een geautomatiseerde cel counter</li>
		<li>Incubeer in een waterbad 37 ° C tot inkapseling stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cel inkapseling Opmerking: Alle stappen in het protocol worden uitgevoerd met steriele techniek in een kabinet bioveiligheid.<ol>
<li>Voor elke 12-well plaat van 3D warme hydrogels 12,5 mL DMEM/F12 en 12,5 mL van de geconditioneerde DMEM/F12 media verzameld tijdens de voorbereiding van de cel.</li>
		<li>Weeg de hoeveelheid methacrylated hyaluronzuur (HAMA) vereist voor een eindconcentratie van 0,5% wt/vol. ontbinden deze HAMA in steriele gefilterde PBS met een concentratie van (2% wt/vol); een concentratie 4 keer hoger dan de uiteindelijke concentratie wordt gebruikt om de toevoeging van cellen en andere reagentia. Een 12 goed plaat van hydrogels vereist ~ 350 µL PBS met 7 mg HAMA.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten (> 20 kHz) oplossingen tot HAMA volledig voor 60 min opgelost is.</li>
		<li>Individuele oplossingen van 10% van zowel triethanolamine (thee) en 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP), en een 1 mM oplossing van eosine Y (EY) in 1 mL aliquots van steriele PBS pH 7.4 voorbereiden.</li>
		<li>Voor een 12 goed plaat, een definitieve 1,4 mL van het mengsel van 1 x 107 cellen maken, 0,5% wt/vol HAMA (350 µL van 2% wt/vol), 0,1% thee (14 µL van 10%), 0,1% NVP (14 µL van 10%), en 0,01 mM EY (14 µL van 1 mM) , en 20% basale lamina mengsel (280 µL van voorraad). Het resterende volume is PBS.</li>
		<li>Zachtjes Meng de oplossing en Pipetteer 100 µL in elke PDMS schimmel met een tip 1 mL.</li>
		<li>Monsters met een hoge intensiteit groen LED licht bloot (~ 520 nm, 60 mW, in een afgesloten 20 x 20 cm x 20 cm vak) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 1 mL per putje van warme geconditioneerde DMEM/F12 op een 12 goed bord.</li>
		<li>Grijpen elke dekglaasje aan tussen duim en wijsvinger langzaam het PDMS schimmel afschilferen met gebogen pincet voorzichtig niet om te sneuvelen de gel en plaatst u deze in een putje met geconditioneerde medium.</li>
		<li>Voeg een extra 1 mL warm DMEM/F12 aan elk putje.</li>
		<li>Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 weken, cel media wekelijks vernieuwen door de media uit elke putten pipetting 1 mL en 1 mL DMEM/F12 te vervangen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscopie
<ol><li>
Immunocytochemie Opmerking: Een omgekeerde confocal microscoop werd gebruikt om het imago van deze monsters en ImageJ werd gebruikt voor het verwerken en weergeven van de afbeeldingen. Microglia, astrocyten, oligodendrocyten en kernen, zal na 3 weken in de HAMA cultuur worden aangeduid.<ol>
<li>Verwarm de 10% PBS-gebufferd formaline (pH 7.0) in een bad van 37 ° C. Let op: Hoewel formaline kan worden gebruikt buiten een zuurkast, dit materiaal is reactief met weefsel, en moet altijd behandelen met zorg en handschoenen. Het moet afzonderlijk vervreemden.</li>
		<li>Zorgvuldig gecombineerd media van de platen en de pipet 1 mL 10% formaline aan elk putje.</li>
		<li>Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 voor 20 min.</li>
		<li>Gecombineerd vloeistof uit elke plaat, Pipetteer 2 mL PBS (pH 7.4) in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.4 tweemaal.</li>
		<li>Gecombineerd vloeistof uit de platen, voeg 1 mL per putje van PBS met 10% normale paard serum (NHS) en 0,5% triton X-100 en zachtjes rock met minimale snelheid) gedurende 1 uur.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.4 driemaal.</li>
		<li>Gecombineerd vloeistof en voeg 1 mL per putje van het volgende mengsel in PBS: konijn geïoniseerd calcium-bindende adapter molecuul (Iba1) 1:1, 000, kip gliale fibrillary eiwit (GFAP) 1:5, 000, muis 2', 3'-cyclische-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% NHS , en 0,1% cel holpijpen oppervlakteactieve stof. Bij 4 ° C na een nacht bebroeden, zo voorzichtig mogelijk het schommelen van de plaat.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.4 driemaal met 1 h incubations tussendoor.</li>
		<li>Gecombineerd vloeistof en voeg 1 mL per putje van het volgende mengsel in PBS: 647 nm opgewonden ezel anti-konijn antilichaam 1:200, 546 nm opgewonden geit anti-kip antilichaam 1:200, 488 nm opgewonden ezel anti-muis antilichaam 1:200, 1% NHS, 1:1,000 blue nucleaire vlek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, zachtjes het schommelen van de plaat.</li>
		<li>Herhaal stap 4 drie keer met 1 h incubations tussendoor.</li>
		<li>Om te bewaren de hydrogels, buffer, gecombineerd en dompel ze in 0,5 mL van cel montage medium voor 1 min. Pipet uit het montage-medium en zachtjes plaats een dekglaasje aan op de top van de gel, een laag tussen het glas maken. Voeg een kleine hoeveelheid montage medium naar de ongedekte kant van de coverslips om te voorkomen dat het drogen van de hydrogel. Opmerking: Omwille van probleemoplossing gels kunnen worden beeld bij stap 4.1.11. om te zien de juiste labeling vóór verdere verwerking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scanning elektronen microscopie (SEM) Opmerking: Om te visualiseren de hydrogel, een Scannende Elektronen Microscoop werd gebruikt om het imago van deze monsters.<ol>
<li>Verwarm een kleefpoeders mengsel van 2,5% Glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in PBS (0.1 M) in een waterbad 37 ° C. Let op: Deze reagentia zijn zeer reactieve met weefsels, en moeten worden behandeld met zorg en handschoenen. Ze moeten worden behandeld in een zuurkast zoveel als mogelijk en afzonderlijk afgevoerd.</li>
		<li>Gecombineerd worden overgedragen door de cel cultuur platen en voeg 1 mL van het voorverwarmde kleefpoeders mengsel.</li>
		<li>Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 voor 20 min.</li>
		<li>Plaats de platen in 4 ° C (koelkast/cooler) 's nachts.</li>
		<li>Gecombineerd de kleefpoeders oplossing uit de putten en voeg 1 mL PBS.</li>
		<li>Gecombineerd vloeistof uit elke plaat, voeg toe 2 mL PBS in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Herhaal stap 4.2.6 twee meer tijden.</li>
		<li>De PBS gecombineerd en voeg 1 mL 1% osmium tetraoxide gebufferd in PBS aan elk putje. Opmerking: Totdat de monsters worden gedroogd, deze stap en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een zuurkast.</li>
		<li>Toestaan van fixatie optreden voor 30 min. Osmium damp uit de vloeistof kan het oplossen van andere monsters in de dezelfde plaat; daarom dienovereenkomstig partitioneren monsters voor deze stap. Let op: Osmium tetraoxide is zeer reactief met weefsel en vluchtige. Het is gevaarlijk en moet worden behandeld in de zuurkast met handschoenen. Het en eventuele onmiddellijke gewassen moet worden afgevoerd afzonderlijk.</li>
		<li>Herhaal stap 4.2.6 driemaal.</li>
		<li>Gecombineerd de vloeistof en de dehydraterend mengsels toevoegen in de lijst hieronder, in volgorde, en incubeer (kamertemperatuur) gedurende de aangegeven tijd. Start door geleidelijk toe te voegen ethanol (EtOH) gevolgd dan hexamethyldisilazane (HMDS). Zie tabel 2 voor elk interval. Opmerking: Bij het toevoegen van HMDS, de coverslips kan sterk houden aan het plastic en zeer moeilijk te verwijderen. Dit kan worden voorkomen door het plaatsen van een kleine plastic platform onder de glazen slip na de eerste toepassing van HMDS. Na de tweede EtOH incubatie, kan het monster worden genomen en uitgeblust in vloeibare stikstof voor enkele seconden om te bevriezen van breuk het monster.</li>
		<li>Zorgvuldig verwijderen van de gedroogde monsters en bevestig de monsters op Scannende Elektronen Microscoop stubs met dubbel zijdig geleidende tape.</li>
		<li>Sputter coat de monsters met een minimum bedrag van goud. Leg de monsters in een houder en bedienen van de machine voor 2 min op 15 mA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Richting van het doel van het genereren van een 3D cultuur systeem model gliale bioreactivity en het gliale littekens proces, hebben we een systeem dat kan ondersteunen primaire gekweekte microglia, astrocyten en oligodendrocyten en maakt robuuste karakterisering van cel morfologie en cel interacties. Van de microfoto komt te staan, was de morfologie van elk celtype duidelijk verschillend met 2D, 3D-HAMA en 3D HAMA-basale lamina mengsel platforms. In de 2D systeem, morfologie was duidelijk bevooroordeeld langs het vliegt...

Ontsteking van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft lang beschouwd als een stempel van acute (b.v., ischemische beroerte, traumatische hersenen en ruggenmerg letsel) en chronische (zoals Alzheimer, Parkinson van en Huntingtons ziekten) CNS letsel, maar wordt steeds meer erkend als een causale bijdrage aan neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Opgelopen of ongepaste ontsteking kan veroorzaken van neurale letsel en demyelinisatie (bv . multiple sclerose), en negatieve invloed hebben op de ontwikkeling van de hersenen (bijvoorbeeld, schizofrenie, autisme) en stemming Staten (bijvoorbeeld, depressie, angst bipolaire stoornis). Verdere, nieuwe therapeutische strategieën door middel van de implanteerbare hulpmiddelen (bv., hersenen-computer-interfaces1,2,3, diepe brein stimulatie4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) genereren van een voorspelbare inflammatoire respons op het raakvlak tussen het apparaat en de CNS wat resulteert in een beschermende weefsel antwoord dat leiden verlies van niet-werkzaamheid of apparaat gedurende de levensduur van de prothese11 tot kan. Ontsteking in het VNV wordt meestal geïnitieerd door microglia, die fungeren als de resident immuuncellen van het centraal zenuwstelsel die verantwoordelijk zijn voor weefsel surveillance en montage van de vreemd lichaam reactie (herziene12). Afhankelijk van de ernst van een belediging, cel het microglia signaal en werven extra typen naar de site van een schade. In het bijzonder de microglia activeren de astrocyten, die op zijn beurt fungeren als secundaire ontstekingscellen en vormen een dichte, beschermende barrière bevatten een letsel site13,14. Microglia kan ook een cascade van de activiteit in de cellen van de perifere immuunsysteem, die in de verdeling van de BBB resulteren kan zodat immuun infiltratie (herzien in verwijzing15) starten.
In het geval van apparaten de CNS ingeplant, weefselschade ten gevolge van het apparaat, alsmede de voortdurende aanwezigheid van de buitenlandse apparaat kan het starten van een proces genoemd gliale littekens. In dit proces, de microglia migreren naar en verspreiden op de site van letsel. Ze zijn ook starten met de release van inflammatoire factoren te neutraliseren van potentiële bedreigingen en werven extra gliacellen. Vervolgens geactiveerd astrocyten hypertrofische geworden en beginnen encapsulating het geïmplanteerde apparaat om te vormen van een continu vezelig barrière-16. Inflammatoire signalering dient ook om intrekking van neuronale processen uit de omgeving van het implantaat en uiteindelijk werft fibroblasten ter versterking van de ontwikkelingslanden gliale litteken17. De oligodendrocyten, verantwoordelijk voor de bescherming van de neuronen in de myeline te verbeteren geleidingsvermogen, dit proces niet overleven en verre cellen worden gepartitioneerd van het implantaat door de litteken-18. Gliale littekens sterk vermindert de functie en de levensduur van geïmplanteerde apparaten, met name voor opname elektroden, en uiteindelijk dient om de functionaliteit van neurale interfaces19te beperken.
Verschillende benaderingen hebben benut om de biocompatibiliteit en interface activiteit van geïmplanteerde apparaten in de CNS20,21,22,23te verhogen. Een uitgebreide review is beschikbaar op de biocompatibel ontwerp van deze neurale interfaces24. De meest prominente strategieën omvatten rondom de elektrode met compatibele coatings zoals polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic zuur (PLGA)25, of verbetering van de elektrode met geleidende polymeren zoals poly (ethyleen dioxythiophene) (PEDOT), en polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioactieve coatings zijn ook tewerkgesteld aan aanwijzingen geven voor zenuwweefsel groei met behulp van liganden afgeleid van extracellulaire matrices met inbegrip van collagens, fibronectins en hyaluronic zuren32,33,34 ,35,,36,,37. De topicale van deze coatings is verder onderzocht met groeifactor release systemen te emuleren natuurlijke cel afscheidingen30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. gelijktijdig, sommige onderzoeksgroepen hebben gekozen om het remodelleren van de elektrode geometrie, flexibiliteit en compositie aan het verlagen van de mechanische wanverhouding tussen apparaat en weefsel51,52,53 ,54,55,56,,57. Over het geheel genomen hebben deze strategieën geleid tot veel veelbelovende verbeteringen in volgende generatie neurale Interfaciale apparaten, maar de lange termijn compatibiliteit een probleem gaande is en vooruitgang kan worden belemmerd door de complexe en tijdrovende in vivo modellen .
Dierlijke modellen gebaseerde benaderingen kunnen beperken de experimentele doorvoer en hogere kosten van de elektrode biocompatibiliteit testen. In vitro benadert met behulp van conventionele celcultuur technieken bieden een meer kosteneffectief alternatief maar niet veel van de complexiteit van de interactie tussen apparaat en weefsel58recapituleren. In het bijzonder, testen van oppervlaktecoatings 2D cel cultuur grenzen met het modelleren van de meetkunde van de elektrode en de invloed van mechanische mismatch en micromotion dacht dat bijdragen aan het genereren van een reactie van de gastheer bij te dragen tot apparaat mislukking59 , 60.
Om te overwinnen problemen in verband met 2D celcultuur, zijn hydrogel culturen van neurale cellen ontwikkeld voor een breed scala aan toepassingen, farmacologische studies61, directe neurale cel differentiatie62, om te begrijpen van de ziekte trajecten63,64, of gelaagde in co-cultuur met andere celtypes model cel migratie, neuroprotectie, of tot en met model weefsel microenvironments61. Hydrogels gemakkelijk worden gevormd in verschillende maten en geometrieën talrijke soorten primaire of vereeuwigd celculturen kunnen opnemen, en zijn zeer vatbaar voor analyse door veelgebruikte technieken zoals confocal fluorescentie microscopie. Als u wilt maken een model van het gliale littekens proces, hebben we onlangs ontwikkeld en een hyaluronzuur gebaseerde 3D hydrogel systeem voor high-throughput testen van de gliale reactie op geïmplanteerde elektroden (Figuur 1)65gekenmerkt. Dit systeem heeft een aantal duidelijke voordelen: 1) primaire gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) zijn ingekapseld in een 3D matrix samengesteld van polymeren van hyaluronzuur, een onderdeel van de endogene extracellulaire matrix; 2) de stijfheid van de matrix kan worden 'afgestemd' herstellen van de mechanische eigenschappen van hersenen of ruggenmerg weefsel; en 3) cellen kunnen worden samengevat in de matrix in een snelle aanpak van de Bank-top photopolymerization met groen licht, beperking van toxiciteit tijdens inkapseling. Dit systeem maakt zeer belangrijke eigenschappen van in vivo biocompatibiliteit: apparaten worden ingevoegd in de hydrogel op een vergelijkbare wijze aan weefsel, en de cellulaire reactie op geïmplanteerde apparaten op een groot aantal parameters65worden gecontroleerd. Het gaat hierbij om mechanische wanverhouding tussen apparaten en de hydrogel coatings van verschillende structuren en elektrische stimulatie pulsen. Dit systeem omvat ook Oligodendrocyt en verwante precursoren, die vaak aanwezig en aangeworven gliale littekens. Hun schade, dood en fagocytose door microglia zijn zeer indicatief van inflammatoire letsel en als een model verminderd littekens of herstel, zij hebben de capaciteit om aan te tonen van re-myelinisering van neuronen66.
Hierin beschrijven we een methode voor de synthese en de vorming van hybride hyaluronzuur hydrogels gecombineerd met verkrijgbare kelder membraan formuleringen te verbeteren van de opneming van de cel. Verder zullen we laten zien de opneming van primaire gekweekte gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) en analyse van de groei van de cultuur met immunocytochemie en confocale microscopie.

<table><tbody><tr><td>1. Materialen voor HAMA-synthese en fotopolymerisatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronzuur (HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53747-10G</td><td>Streptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 X 10^6</td></tr><tr><td>Methacrylzuuranhydride (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275585-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Commerical Alcohols Inc.</td><td></td><td>Anhydrous</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) tabletten</td><td>Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1-Vinyl-2pyrrolidon (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td></td></tr><tr><td>EosinY (EY)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 Siliconen Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxisilyl)propylmethacrylaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Beker (100 mL)</td><td>Corning</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Beker (500 mL)</td><td>Corning</td><td>1000-600</td><td></td></tr><tr><td>pH-papier (Labstick)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9580</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>2. Materialen voor gliacellenisolatie en celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1-2 Sprague Dawley rattenpups</td><td>Charles River</td><td>CD Sprague Dawley rattenstam code 001</td><td></td></tr><tr><td>Dissector schaar - slanke bladen (klein)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - Toughcut (groot)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11521-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen fijne pincetten (Dumont #7)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium en Ham's voedingsmengsel F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (PS)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-ethyleen-diaminetetra-azijnzuur (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6282</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische centrifugebuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische centrifugebuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>12 wel Tissuecultuur behandelde platen (Cellstar)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 108</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (60 mm X 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (100 mm X 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Dekglas (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100 18CIR</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>3. Materialen voor microscopie (confocale en rasterelektronenmicroscopie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-CNPase</td><td>abcam</td><td>ab6319</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Iba1</td><td>Wako Laboratory Chemicals</td><td>019-17741</td><td></td></tr><tr><td>Kip anti-GFAP</td><td>abcam</td><td>ab4674</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Gebufferd (10%)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td>Gebufferd (8%)</td></tr><tr><td>Guteraldehyde</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16019</td><td>Gebufferd (8%)</td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>19152</td><td>Gebufferd (2%)</td></tr><tr><td>Hexamethyldilazana (HMDS)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16700</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>Anhydrous</td></tr><tr><td>Microscoopglas (25 X 75 X 1 mm)</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterd 3d hydrogel culturen van primaire gliacellen voor in vitro modellering van neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In het centrale zenuwstelsel, talrijke acute verwondingen en neurodegeneratieve aandoeningen, zo goed als geïmplanteerde apparaten of biomaterialen ontworpen ter verbetering van het resultaat van de functie in dezelfde uitkomst: overmaat ontsteking leidt tot gliosis, cytotoxiciteit, en/of vorming van een gliale litteken dat collectief schade verergeren of voorkomen van gezond herstel. Met de bedoeling van het creëren van een systeem model gliale litteken vorming en studie inflammatoire processen, hebben we een geschikt voor huisvesting van primaire gekweekte gliacellen 3D cel-steiger gegenereerd: microglia die de reactie van het buitenlandse lichaam reguleren en initiëren de inflammatoire gebeurtenis astrocyten die reageren op een vezelig litteken vormen en oligodendrocyten die meestal kwetsbaar voor inflammatoire letsel zijn. Het huidige werk biedt een gedetailleerde stapsgewijze methode voor de fabricage, cultuur en microscopisch karakterisering van een hyaluronzuur-gebaseerde 3D hydrogel steiger met ingekapselde rat gliale cellen van hersenen-afgeleide. Verder, protocollen voor karakterisering van cel inkapselen en de hydrogel steiger door confocal immunofluorescentie en scanning elektronen microscopie zijn aangetoond, evenals de capaciteit om te wijzigen de steiger met bioactieve substraten, met opneming van een commerciële basale lamina mengsel verbeterde cel integratie.

Om het model van de reactie van de gastheer zenuwweefsel en het gliale litteken in een hoge doorvoer, vereist in vitro systeem een 3D cel steiger met een matrix-materiaal dat is biocompatibel, niet een cytotoxische gebeurtenis doet oplopen tijdens in situ vorming en is aanpasbaar met bioactieve componenten bij welwillende reactie. Te dien einde hebben we gemaakt van een 3D cel steiger systeem op basis van hyaluronzuur en een primaire gemengde gliale celpopulatie om te st...

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Het algemene doel van dit 3D-protocol voor celkweek is om het gliaschelpevenement van het centrale zenuwstelsel te modelleren met behulp van belangrijke indicatorcellen:microglia, astrocyten en oligodendrocyten.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-ontsteking, zoals het potentieel van gliacellen om regeneratieve strategieën te verbeteren en het gliaschelp te ontrafelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gliabiologie snel kan worden gekarakteriseerd in een 3D-micro-omgeving met systematische en hoogwaardige manipulaties.Om dekglasjes voor het zaaien voor te bereiden, begint u met het toevoegen van één milliliter 3-propylmethacrylaat aan 49 milliliter gedistilleerd water om een 2%-oplossing te maken.Plaats vervolgens 18 millimeter glazen dekglasjes in de oplossing en schud gedurende één uur bij kamertemperatuur.Na één uur spoelt u de dekglasjes door elk dekglasje opeenvolgend in drie bekers met 100 milliliter gedeïoniseerd water te dompelen.Laat de dekglasjes vervolgens een nacht in een vacuüm met een exsiccator en oven op 40 graden Celsius drogen.Gebruik de volgende dag een pincet om individuele dekglasjes snel i

improved-3d-hydrogel-cultures-primary-glial-cells-for-vitro-modelling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Hier presenteren we een protocol voor driedimensionale cultuur van glioblastoma patiënt-afgeleide cellen binnen orthogonaal afstembare biomaterialen ontworpen na te bootsen de hersenen-matrix. Deze aanpak biedt een in vitro, experimenteel platform die veel kenmerken van in vivo glioblastoma cellen meestal verloren in cultuur onderhoudt.

Hyaluronzuur gebaseerd Hydrogels voor 3-dimensionale cultuur van Glioblastoma patiënt-afgeleide cellen

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Hier rapporteren we een methode van 3D bioprinting van muriene corticale astrocyten voor het biofabriceren van neurale weefsels om de functionaliteit van astrocyten in het centrale zenuwstelsel en de mechanismen met betrekking tot gliacellen bij neurologische ziekten en behandelingen te bestuderen.

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

In dit manuscript demonstreren we de bereiding van een biohybride hydrogel bioink met grafeen voor gebruik in perifere tissue engineering. Met behulp van dit 3D-biohybride materiaal wordt het neurale differentiatieprotocol van stamcellen uitgevoerd. Dit kan een belangrijke stap zijn om vergelijkbare biomaterialen naar de kliniek te brengen.

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om 3D-gebioprinte coculturen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten te produceren. Dit cocultuurmodel, gegenereerd in een hydrogelsteiger in formaten met 96 of 384 putjes, toont een hoge levensvatbaarheid na het printen en neurietuitgroei binnen 7 dagen en toont de expressie van rijpheidsmarkers voor beide celtypen.

Driedimensionale bioprinting van menselijke iPSC-afgeleide neuron-astrocyt coculturen voor screeningstoepassingen

We presenteren een methode voor het repliceren van de micro-omgeving van de glioomtumor aan het invasieve front die interstitiële vloeistofstroom omvat. Dit model is een hyaluronzuur-collageen I hydrogel in een weefselkweekinzetstuk waar een vloeistofdrukkop op kan worden aangebracht. Invasie kan worden gekwantificeerd en cellen kunnen worden geïsoleerd of gelyseerd.

Een fotopolymeriseerbaar hyaluronzuur-collageenmodel van de invasieve glioommicro-omgeving met interstitiële stroom

Leer een 3D hydrogelcultuurmethode voor primaire ratgliacellen om neuro-inflammatie en gliaire littekenvorming te bestuderen. Deze techniek ondersteunt regeneratieve strategieën en gedetailleerde celbiologie.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

Meer video's verkennen