Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Het algemene doel van gamma-H2AX en 53BP1 immunofluorescence microscopie is om de vorming en reparatie van DNA dubbelstrengsbreuken in verschillende weefsels te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in kankeronderzoek, zoals hoe genetische instabiliteit ontstaat in tumorcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat enkele DNA dubbelstrengsbreuken kunnen worden gevisualiseerd en dat de reparatieprocessen kunnen worden geanalyseerd.

Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Susanne Brendel, een technicus van ons laboratorium. Begin het experiment door oplossingen voor te bereiden, beginnend met de anticoagulant stockoplossing met 200 internationale eenheden heparine per milliliter in 0,9 procent natriumchloride. Vul elk van de verzamelbuisjes met twee milliliter anticoagulant stockoplossing voor het afnemen van de bloed- of beenmergmonsters.

Bereid vervolgens de 10X Lysis-oplossing voor rode cellen met 82,91 gram ammoniumchloride, 7,91 gram ammoniumbicarbonaat en twee milliliter 0,5 molaire ethyleendiamientetraacetic acid-oplossing tot een pH van 8,0 door de agentia op te lossen in twee keer gedestilleerd water voor een totaal volume van één liter. Bereid vervolgens de fixatie-oplossing door 8,3 microliter van een één molaire kaliumhydroxide-oplossing toe te voegen aan 360 milligram paraformaldehyde, of PFA, in een microtiterbuisje. Vul de buis tot de één milliliter markering met fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS, en verwarm de buis in een verwarmingsblok op 95 graden Celsius om één milliliter van een 36 procent PFA-oplossing te verkrijgen.

Breng de één milliliter 36 procent PFA-oplossing over naar een 15 milliliter buisje. En voeg acht milliliter PBS toe om een negen milliliter vier procent PFA stockoplossing te verkrijgen. Verdeel de vier procent PFA stockoplossing in porties en bewaar deze op min 18 graden Celsius tot gebruik voor celfixatie.

Bereid vervolgens de permeabiliseringsoplossing door 50 microliter Octoxynol 9 toe te voegen aan 50 milliliter PBS om een oplossing van ongeveer 0,1 procent Octoxynol 9 te verkrijgen. Bereid ten slotte vijf procent en twee procent blokkeringsoplossingen door het eiwitblokkeringsmiddel met PBS te mengen. Om de bloed- of beenmergmonsters voor te bereiden, haalt u de buisjes gevuld met twee milliliter van de anticoagulant stockoplossing op.

Trek zeven milliliter bloed of beenmerg per buisje onder steriele omstandigheden af door venepunctie of beenmergpuncie respectievelijk. Bewaar de monsters een nacht bij kamertemperatuur. Na overnacht opslag, verdunt u het heparine-gehesen bloedmonster een op een met PBS en het heparine-gehesen beenmergmonster in een verhouding van een op drie met PBS.

Suspensie de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken. Voeg vervolgens één volume dichtheidsgradiëntmedium toe aan een verse buis. Laag de verdunde bloed- of beenmerg voorzichtig op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium en zorg ervoor dat u de twee lagen niet mengt.

Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 400 G. Haal de bovenste plasmalaag af met een pipet. Verzamel vervolgens voorzichtig de mononucleaire cellen in de laag boven het dichtheidsgradiëntmedium. Breng de mononucleaire cellen over in een verse buis en voeg ten minste drie volumes PBS toe.

Suspensie de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken. Centrifugeer de buis. Verwijder na het centrifugeren het supernatant.

Voeg 10 milliliter vier graden Celsius 1x Lysis-oplossing voor rode cellen toe. Re-suspendeer de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken en plaats de buis gedurende vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens 30 milliliter PBS bij vier graden Celsius toe en centrifugeer de buis.

Gebruik CD34 microkralen en celscheidingskolommen voor de isolatie van CD34 positieve cellen. Bereid twee cyto-spins voor met mononucleaire cellen van de patiëntmonsters door centrifugatie van eenmaal tien de vijf cellen voor elke bereiding. Fixeer de cellen met 200 microliter vier procent PFA gedurende 10 minuten.

Na fixatie, was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter PBS gedurende vijf minuten elk op een shaker. Permeabiliseer vervolgens de cellen met 200 microliter 0,1 procent Octoxynol 9 gedurende 10 minuten. Was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter vijf procent blokkeringsoplossing gedurende vijf minuten elk op een lab shaker.

Blokker de cellen in 30 milliliter verse vijf procent blokkeringsoplossing gedurende één uur. De fixatie en permeabilisering van de cellen met vier procent paraformaldehyde in 0,1 procent Octoxynol 9 behoudt de gamma-H2AX en 53BP1 foci duidelijk. Incubeer één bereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-gamma-H2AX antilichaam en de andere bereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-gamma-H2AX antilichaam en een polyklonaal konijn anti-53BP1 antilichaam overnacht bij vier graden Celsius.

Het gebruik van bewezen anti-gamma-H2AX en anti-53BP1 antilichamen wordt sterk aanbevolen. Na incubatie, was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter twee procent blokkeringsoplossing gedurende elke vijf minuten op een lab shaker. Incubeer vervolgens de eerste bereiding van de cellen met een Alexa 488 geconjugeerd geit anti-muis secundair antilichaam verdund één op 500 in twee procent blokkeringsoplossing.

Incubeer de tweede bereiding van de cellen met een Alexa 488 geconjugeerd geit anti-muis secundair antilichaam en een Alexa 555 geconjugeerd ezel anti-konijn secundair antilichaam verdund één op 500 in twee procent blokkeringsoplossing. Was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter PBS op een laboratorium shaker. Verwijder de PBS en monteer de cellen met montagemedium.

Leg voorzichtig een deksel op het montagemedium zodat er geen luchtbellen ingesloten zijn. Wacht ten minste drie uur totdat het montagemedium is uitgehard voordat u de cellen analyseert door middel van fluorescentiemicrosco