Name: Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van DNA dubbele-strand breuken in tumorcellen. Deze methode visualiseert enkele breuken en reparatieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het project werd ondersteund door de Duitse José Carreras leukemie Stichting (DJCLS 14 R/2017).

alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie II van de Mannheim van de medische faculteit van de Universiteit van Heidelberg. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle individuen.
 1. voorbereiding van materialen <ol><li>antistollingsmiddel stockoplossing: bereiden een anticoagulatie stockoplossing van 200 I.E. heparine per mL in natriumchloride 0,9%. Vul elk van de collectie buizen (tekenen volume 9 mL) met 2 mL van de anticoagulatie stockoplossing vóór terugtrekking van de monsters van bloed of beenmerg.</li>
	<li>Lysis oplossing voor rode bloedcellen: voorbereiden de 10 x lysis oplossing voor rode bloedcellen met 82.91 g ammoniumchloride, 7.91 g Ammoniumbicarbonaat en 2 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra zure oplossing aan een pH van 8.0 door ontbinding van de agenten in tweemaal gedestilleerd water voor een totaal volume van 1 L.</li>
	<li>Fixatie oplossing: toevoegen 8.3 µL van een 1 M kaliumhydroxide-oplossing voor 360 mg paraformaldehyde (PFA) in een buis van de microtiterplaat. Vul de buis met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot de maatstreep met 1 mL van de buis en warmte de buis in een blok van de verwarming op 95 ° C om 1 mL van een oplossing van de PFA 36%. Breng de 1 mL 36% PFA oplossing over in een buis met een inhoud van 15 mL. 8 mL PBS aan de 1 mL 36% PFA oplossing, om 9 mL van een 4% PFA stockoplossing toevoegen. Aliquot de 4% PFA stockoplossing en winkel bij-18 ° C tot voor fixatie van de cellen gebruiken. 
	Let op: 1) kaliumhydroxideoplossing is corrosief. Zich bewust zijn van de bescherming van de ogen en huid. 2) PFA is kankerverwekkend. Vermijd contact met de huid en inhalatie. Bereid de oplossing van de fixatie onder een motorkap.</li>
	<li>Permeabilization oplossing: toevoegen 50 µL Octoxinol 9 tot en met 50 mL PBS om een oplossing van ongeveer 0,1% Octoxinol 9.</li>
	<li>Blokkeren oplossing: bereiden van 5% en 2% voor het blokkeren van oplossingen door het mengen van de blokkerende agent van eiwit met PBS en winkel op 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Bereiding van de monsters <ol><li>fibroblasten in celkweek: cultiveren van menselijke fibroblasten voor de cellijn NHDF in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 4 mM glutamine, en 1% penicilline/streptomycine.
	<ol><li>Voorbereiding van een microscoopglaasje met aanhanger fibroblasten <ol><li>Verwijder het medium van de kolf (75 cm 2 groeigebied) met een exponentieel groeiende NHDF fibroblasten. Voeg aan de maatkolf toe 10 mL PBS. Wassen van de aanhangend fibroblasten zachtjes door handmatig schudden de kolf gedurende 1 min.</li>
			<li>Verwijder van de PBS en voeg 1 mL trypsine in de kolf. Schud de kolf voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle aanhangend cellen trypsine vallen. Verwijder de Trypsine van de kolf. Zet de kolf in de incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C.</li>
			<li>Neem de kolf uit de incubator en voeg 10 mL RPMI 1640 medium in de kolf. Pipetteer van het medium op en neer meerdere malen te verspreiden van de fibroblasten.</li>
			<li>Pipetteer 0.3 mL van de verspreide fibroblasten op elk van de twee velden van het microscoopglaasje en zet de dia in de incubator voor 24u zodat de fibroblasten aan de dia houden. Voor immunokleuring van γH2AX en 53BP1 in de kernen van fibroblasten, gaan naar stap 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Patiënt monsters <ol><li>bloed monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing voor anticoagulatie en voeg 7 mL bloed in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3).</li>
		<li>Het beenmerg monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing anticoagulatie (stap 1.1) en 7 mL beenmerg toevoegen in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3). Gebruik CD34 microbeads en cel scheiding kolommen voor de isolatie van de CD34 +-cellen.</li>
		<li>Isolatie van mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren 
		Opmerking: Mononucleaire cellen zijn geïsoleerd uit bloed en beenmerg monsters door dichtheid kleurovergang centrifugeren 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Dilute het EDTA bloedmonster in een verhouding van 1:1 met PBS en het beenmerg EDTA monster in een verhouding van 1:3 met PBS. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet tweemaal.</li>
			Een volume van de kleurovergang medium dichtheid toevoegen <li>aan een verse buis. Zachtjes laag het verdunde bloed of beenmerg bovenop het verloop medium dichtheid. Wees voorzichtig niet te mengen de twee lagen.</li>
			<li>Centrifugeren de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g. tekent de bovenste plasma laag af met de pipet. Vervolgens oogst zorgvuldig de mononucleaire cellen in de laag boven het verloop medium dichtheid. Breng de mononucleaire cellen in een verse buis.</li>
			Ten minste drie volumes van PBS toevoegen <li>aan de mononucleaire cellen in de buis. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.</li>
			<li>Na de spin het supernatant verwijderen en voeg 10 mL van 4 ° C, 1 x lysis oplossing voor rode bloedcellen. Resuspendeer de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer, en plaats de buis op ijs gedurende 5 minuten. Klik Voeg toe 30 mL PBS bij 4 ° C en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.</li>
		</ol></li> <li>Voorbereiding van de cytospins <ol><li>twee cytospins met mononucleaire cellen van de patiënt monsters (dat wil zeggen, een cytospin voor γH2AX immunofluorescentie kleuring en een cytospin voor γH2AX en 53BP1 voor te bereiden gecombineerd immunofluorescentie kleuring) door middel van centrifugeren (300 x g, 10 min) van 1,0 x 10 5 cellen voor elk preparaat ( Figuur 3 en 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX en 53BP1 immunofluorescentie kleuring <ol><li>fixatie en permeabilization: herstellen van de cellen met de 200 µL van 4% PFA gedurende 10 minuten. Na fixatie, wassen de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Dan permeabilize de cellen met 200 µL van 0,1% Octoxinol 9 voor 10 min. Spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL van blokkerende 5%-oplossing gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Blokkeren van de cellen in 30 mL vers 5% blokkeren oplossing voor 1 h.</li>
	<li>Incubatie met de antilichamen <ol><li>broeden één preparaat van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en de andere voorbereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en een Polyclonal konijn van het antilichaam van anti-53BP1 (1:500) 's nachts bij 4 ° C.</li>
		<li>Na incubatie wassen de cellen zachtjes 3 keer met 30 mL van blokkerende 2%-oplossing gedurende elke 5 minuten op een lab-shaker.</li>
		<li>Verwijderen van de blokkerende oplossing en Incubeer de eerste voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam (1:500) en de tweede voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam ( 1:500) en een Alexa555-geconjugeerde ezel anti-konijn secundair antilichaam (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li> <li>Montage medium: zet de dia met de cellen in een kom en spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS voor elke 5 min op een lab-shaker. De PBS verwijderen en monteren van de cellen met montage medium dat 4,6-diamidino-2-phenylindole. Voorzichtig zetten een dekglaasje aan op de top van het montage-medium, zodat er geen luchtbellen zijn ingesloten. Wacht ten minste 3 h voor verharding van het montage-medium voor het analyseren van de cellen door fluorescentie microscopie.</li>
</ol> 4. Analyse van γH2AX en 53BP1 Foci <ol><li>fluorescentie microscopie: analyseren van de γH2AX en 53BP1 foci in de celkernen met een fluorescentie Microscoop uitgerust met filters voor DAPI, Alexa 488 en Cy3 tijdens beeldvorming op een 100 X-doelstelling vergroting. Beelden met een camera registreren en verwerken van de beelden met passende imagingsoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DSB in een breed spectrum van onderzoeksgebieden. Kritische parameters die invloed hebben op de resultaten van de experimenten zijn de fase van de celcyclus, de stoffen die worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, de keuze van de antilichamen, en de hardware en software van de fluorescentie Microscoop.
De invloed van de celcyclus op γH2AX fo...

DNA is permanent beschadigd door endogene (bv, replicatie stress, reactieve zuurstof soorten, intrinsieke instabiliteit van DNA) en exogene (bv, chemische radicalen, bestraling) bronnen (Figuur 1)1,2 ,3,4. Onder DNA schade, DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn bijzonder ernstige letsels en kunnen leiden tot celdood of carcinogenese. Ongeveer 50 DSB voordoen per cel en celcyclus5. Bij zoogdiercellen homologe recombinatie (HR) en nonhomologous eind-verbinden (NHEJ) ontwikkeld als belangrijke trajecten voor de reparatie van DSB (Figuur 2). HR treedt op in laat S/G2-fase en maakt gebruik van een intact zus chromatide als een sjabloon voor reparatie mogelijk vrij van fouten. Ter vergelijking: NHEJ is actief gedurende de celcyclus en potentieel mutagene zoals basenparen kunnen worden toegevoegd of gereseceerd voordat Afbinding van de gebroken uiteinden. Daarnaast mogen alternatieve einde-toetreding worden gebruikt als een langzame mutagene reparatie van de back-up mechanisme in geval van NHEJ deficiëntie6,7.
DSB induceren de fosforylering van de Histon H2AX op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren rond elke DSB. De vormende nucleaire foci heten γH2AX foci en door immunofluorescentie microscopie8worden opgespoord. ΓH2AX bevordert de aanwerving van verdere DSB-responsieve eiwitten en is betrokken bij de chromatine remodeling, reparatie van DNA en signaaltransductie9. Zoals elke γH2AX focus wordt beschouwd als een enkele DSB vertegenwoordigen, is de kwantificering van DSB door immunofluorescentie microscopie het mogelijk, dat is aangetoond in kanker cellijnen en patiënt exemplaren10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een andere belangrijke eiwit in het bemiddelen van DSB reparatie. Het is betrokken bij de aanwerving van DSB-responsieve eiwitten, checkpoint signalering en de synapsis van DSB uiteinden15. Daarnaast speelt 53BP1 een cruciale rol bij de keuze van DSB reparatie traject. Er wordt de reparatie van DSB richting NHEJ gegenereerd terwijl HR verhinderd16 is. Gelet op de daadwerkelijke functies van γH2AX en 53BP1 in DSB reparatie, de gelijktijdige analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie mogelijk een handige methode voor de nauwkeurige analyse van de vorming en de reparatie van DSB.
Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 in de celkernen. In het bijzonder wordt de techniek toegepast in normale fibroblasten voor de cellijn NHDF, x-ray bestraald lymfocyten van een gezond individu en CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie. De details van de methode zijn gewezen in het kader van de gepresenteerde resultaten.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Medium voor celcultuur</td></tr><tr><td>Heparine natrium</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp;Heparine 5.000 I.E. / mL</td></tr><tr><td>Natriumchloride-oplossing 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Component van de anticoagulantia-voorraadoplossing</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Medium voor isolatie van mononucleaire cellen</td></tr><tr><td>Trypsine-oplossing 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzym voor dissociatie van fibroblasten in celcultuur</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolatie van CD34+ myeloïde voorlopercellen</td></tr><tr><td>Diagnostische microscoopglazen</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Microscoopglazen</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp;Centrifuge voor op tafel&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytospin-apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deksel</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Deksel voor werken zonder microbuizen</td></tr><tr><td>Cyto-container</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Cyto-container met 2 conische openingen</td></tr><tr><td>Klemdrager</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Drager voor het vasthouden van een cyto-container en een schuif</td></tr><tr><td>Ondersteunende inleg</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Ondersteunende inleg voor het vasthouden van een klemdrage</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergens voor permeabilisatie van celmembranen</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide-oplossing 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Noodzakelijk voor het bereiden van de paraformaldehyde-oplossing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixatiemiddel</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Gebalande zout-oplossing</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Blokkeermiddel</td></tr><tr><td>Monoklonaal anti-&gamma;H2AX-antilichaam van muis (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Primair antilichaam voor detectie van &gamma;H2AX</td></tr><tr><td>Polyklonaal konijnen anti-53BP1-antilichaam (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Primair antilichaam voor detectie van 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-geconjugeerd geiten anti-muis antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Bevat DAPI voor kleuring van DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 CCD-camera</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Camerasysteem voor digitale opname</td></tr><tr><td>Isis software</td><td>Metasystems</td><td>Niet van toepassing</td><td>Microscoopsoftware</td></tr></tbody></table>

immunofluorescentie microscopie van γh2ax en 53bp1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van dna dubbele-strand einden

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn ernstige DNA-beschadigingen. Analyse van de vorming en de reparatie van DSB is relevant in een breed spectrum van onderzoek op gebieden zoals genoom integriteit genotoxiciteit, straling biologie, veroudering, kanker en Geneesmiddelenontwikkeling. In reactie op DSB, is de Histon H2AX phosphorylated op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren vormen discrete nucleaire foci aantoonbaar door immunofluorescentie microscopie. Bovendien is 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een ander belangrijk DSB-responsieve eiwit bevordering van reparatie van DSB door nonhomologous einde-toe te treden terwijl het voorkomen van homologe recombinatie. Volgens de specifieke functies van γH2AX en 53BP1 kunnen de gecombineerde analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie een redelijke benadering voor een gedetailleerde analyse van DSB. Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol, aangevuld met methodische notities voor het uitvoeren van de techniek. Specifiek, blijkt de invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. Verder, is de waarde van de γH2AX foci een biomarker teljaren in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. Tot slot wordt de genetische instabiliteit in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie onderzocht door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Analyse van γH2AX foci in cellen is nauwkeurigste in de G0/G1-fase en de G2-fase als γH2AX foci worden weergegeven als verschillende TL stippen (figuur 5A). In tegenstelling, wordt analyse van γH2AX foci in cellen in de S-fase bemoeilijkt door verspreide pan-nucleaire γH2AX spikkels veroorzaakt door het replicatieproces (figuur 5B).
Fixatie van de cellen is uitgevoerd m...

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Het algemene doel van gamma-H2AX en 53BP1 immunofluorescence microscopie is om de vorming en reparatie van DNA dubbelstrengsbreuken in verschillende weefsels te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in kankeronderzoek, zoals hoe genetische instabiliteit ontstaat in tumorcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat enkele DNA dubbelstrengsbreuken kunnen worden gevisualiseerd en dat de reparatieprocessen kunnen worden geanalyseerd.Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Susanne Brendel, een technicus van ons laboratorium. Begin het experiment door oplossingen voor te bereiden, beginnend met de anticoagulant stockoplossing met 200 internationale eenheden heparine per milliliter in 0,9 procent natriumchloride. Vul elk van de verzamelbuisjes met twee milliliter anticoagulant stockoplossing voor het afnemen van de bloed- of beenmergmonsters.Bereid vervolgens de 10X Lysis-oplossing voor rode cellen met 82,91 gram ammoniumchloride, 7,91 gram ammoniumbicarbonaat en twee milliliter 0,5 molaire ethyleendiamientetraacetic acid-oplossing tot een pH van 8,0 door de agentia op te lossen in twee keer gedestilleerd water voor een totaal volume van één liter. Bereid vervolgens de fixatie-oplossing door 8,3 microliter van een één molaire kaliumhydroxide-oplossing toe te voegen aan 360 milligram paraformaldehyde, of PFA, in een microtiterbuisje. Vul de buis tot de één milliliter markering met fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS, en verwarm de buis in een verwarmingsblok op 95 graden Celsius om één milliliter van een 36 procent PFA-oplossing te verkrijgen.Breng de één milliliter 36 procent PFA-oplossing over naar een 15 milliliter buisje. En voeg acht milliliter PBS toe om een negen milliliter vier procent PFA stockoplossing te verkrijgen. Verdeel de vier procent PFA stockoplossing in porties en bewaar deze op min 18 graden Celsius tot gebruik voor celfixatie.Bereid vervolgens de permeabiliseringsoplossing door 50 microliter Octoxynol 9 toe te voegen aan 50 milliliter PBS om een oplossing van ongeveer 0,1 procent Octoxynol 9 te verkrijgen. Bereid ten slotte vijf procent en twee procent blokkeringsoplossingen door het eiwitblokkeringsmiddel met PBS te mengen. Om de bloed- of beenmergmonsters voor te bereiden, haalt u de buisjes gevuld met twee milliliter van de anticoagulant stockoplossing op.Trek zeven milliliter bloed of beenmerg per buisje onder steriele omstandigheden af door venepunctie of beenmergpuncie respectievelijk. Bewaar de monsters een nacht bij kamertemperatuur. Na overnacht opslag, verdunt u het heparine-gehesen bloedmonster een op een met PBS en het heparine-gehesen beenmergmonster in een verhouding van een op drie met PBS.Suspensie de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken. Voeg vervolgens één volume dichtheidsgradiëntmedium toe aan een verse buis. Laag de verdunde bloed- of beenmerg voorzichtig op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium en zorg ervoor dat u de twee lagen niet mengt.Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 400 G. Haal de bovenste plasmalaag af met een pipet. Verzamel vervolgens voorzichtig de mononucleaire cellen in de laag boven het dichtheidsgradiëntmedium. Breng de mononucleaire cellen over in een verse buis en voeg ten minste drie volumes PBS toe.Suspensie de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken. Centrifugeer de buis. Verwijder na het centrifugeren het supernatant.Voeg 10 milliliter vier graden Celsius 1x Lysis-oplossing voor rode cellen toe. Re-suspendeer de cellen voorzichtig door ze twee keer in en uit de pipet te trekken en plaats de buis gedurende vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens 30 milliliter PBS bij vier graden Celsius toe en centrifugeer de buis.Gebruik CD34 microkralen en celscheidingskolommen voor de isolatie van CD34 positieve cellen. Bereid twee cyto-spins voor met mononucleaire cellen van de patiëntmonsters door centrifugatie van eenmaal tien de vijf cellen voor elke bereiding. Fixeer de cellen met 200 microliter vier procent PFA gedurende 10 minuten.Na fixatie, was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter PBS gedurende vijf minuten elk op een shaker. Permeabiliseer vervolgens de cellen met 200 microliter 0,1 procent Octoxynol 9 gedurende 10 minuten. Was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter vijf procent blokkeringsoplossing gedurende vijf minuten elk op een lab shaker.Blokker de cellen in 30 milliliter verse vijf procent blokkeringsoplossing gedurende één uur. De fixatie en permeabilisering van de cellen met vier procent paraformaldehyde in 0,1 procent Octoxynol 9 behoudt de gamma-H2AX en 53BP1 foci duidelijk. Incubeer één bereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-gamma-H2AX antilichaam en de andere bereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-gamma-H2AX antilichaam en een polyklonaal konijn anti-53BP1 antilichaam overnacht bij vier graden Celsius.Het gebruik van bewezen anti-gamma-H2AX en anti-53BP1 antilichamen wordt sterk aanbevolen. Na incubatie, was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter twee procent blokkeringsoplossing gedurende elke vijf minuten op een lab shaker. Incubeer vervolgens de eerste bereiding van de cellen met een Alexa 488 geconjugeerd geit anti-muis secundair antilichaam verdund één op 500 in twee procent blokkeringsoplossing.Incubeer de tweede bereiding van de cellen met een Alexa 488 geconjugeerd geit anti-muis secundair antilichaam en een Alexa 555 geconjugeerd ezel anti-konijn secundair antilichaam verdund één op 500 in twee procent blokkeringsoplossing. Was de cellen voorzichtig drie keer met 30 milliliter PBS op een laboratorium shaker. Verwijder de PBS en monteer de cellen met montagemedium.Leg voorzichtig een deksel op het montagemedium zodat er geen luchtbellen ingesloten zijn. Wacht ten minste drie uur totdat het montagemedium is uitgehard voordat u de cellen analyseert door middel van fluorescentiemicrosco

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

In this video, we describe the immunofluorescence method to visualize the localization of the DNA repair proteins γH2AX and 53BP1 at the sites of double-strand DNA breaks in irradiated cell nuclei.

Immunofluorescence-Based Visualization of DNA Repair Protein Interactions

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van DNA dubbele-strand breuken in tumorcellen. Deze methode visualiseert enkele breuken en reparatieprocessen.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden (Video) | JoVE Journal

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Meer video's verkennen